新生SD大鼠心肌细胞原代培养方法的比较

目的建立并比较新生SD大鼠心肌细胞的原代培养方法。方法采用胰酶法和胰酶+Ⅱ型胶原酶法分别消化心肌组织,两次90 min差速贴壁纯化心肌细胞,倒置显微镜下观察细胞形态变化,分别采用台盼蓝和免疫荧光染色评估心肌细胞的存活率和纯度。结果与胰酶法相比,胰酶+Ⅱ型胶原酶法可以获得形态良好且结构完整的心肌细胞;胰酶+Ⅱ型胶原酶法分离心肌细胞的获得率[（1.21±0.03）×10⁶ vs（0.65±0.02）×10⁶,P<0.01]和心肌细胞存活率[（93.37±0.40）%vs （86.40±0.36）%,P<0.01]明显高于胰酶法;两种方法获得的心肌细胞纯度均达到95%以上,但是胰酶+Ⅱ型胶原酶法获得心肌细胞所耗时间明显多于胰酶法[（14.00±0.40）h vs （4.59±0.10）h,P<0.01]。结论胰酶+Ⅱ型胶原酶法比胰酶法分离心肌细胞耗时长,但胰酶+Ⅱ型胶原酶法分离的心肌细胞获得率高、存活率高、细胞结构完整,是一种简单易行且高效的培养方法。     

人脐静脉内皮细胞体外培养方法的改进

目的 建立一种能大量分离人脐静脉内皮细胞(HUVECS)的体外培养方法,为血管内皮细胞的大规模体外实验研究奠定基础.方法 比较0.25%胰酶、0.1%Ⅰ型胶原酶、0.25%胰酶与0.1%Ⅰ型胶原酶(1∶1)3种消化方法分离HUVECs的细胞数量和活细胞率的差异.观察血管内皮细胞生长因子(VEGF)对细胞生长的影响.细胞鉴定采用形态学观察和免疫荧光法检测.结果 0.1%Ⅰ型胶原酶单独或混合0.25%胰酶消化分离细胞数量较多、活细胞率较高(P＜0.05).VEGF能明显促进细胞增殖能力,延长细胞自然生长时间.细胞呈单层"铺路石"样排列,免疫荧光细胞化学法染色,激光买聚焦检测可见胞质中绿色荧光颗粒.结论 Ⅰ型胶原酶与胰酶混合消化HUVECs是获取血管内皮细胞的一种经济且效果较好的方法,添加VEGF能明显促进细胞增殖,可用于构建体外研究血管内皮细胞的模型.     

机械法和胰酶法分离大鼠卵巢颗粒细胞的比较

目的 探讨胰酶法分离大鼠卵巢颗粒细胞的优势。方法 取3～4周龄雌性SD大鼠的卵巢,分别采用机械法和胰酶法分离颗粒细胞并进行培养。机械法：于40倍解剖显微镜下用针头刺破卵巢成熟的卵泡,将含有卵巢剩余组织及卵泡液的培养液用200目滤网过滤;胰酶法：用无菌眼科剪将卵巢剪成小于2 mm³的小碎块,然后加入0.25%胰酶,室温消化1 h后,将含有卵巢碎块的消化液用200目滤网过滤。比较这2种分离方法获得的细胞数量、细胞活力,及雌二醇和孕酮的分泌情况。结果 机械法和胰酶法这2种方法分离的原代大鼠卵巢颗粒细胞存活率均>90%。将细胞培养1～9 d,除24 h外,其余各时间点胰酶法分离的细胞增殖率均高于机械法;胰酶法细胞增殖率峰值出现时间早于机械法24 h,并且胰酶法分离的细胞最大增殖率[72 h：（210.09±0.95）%]高于机械法[96 h：（180.50±0.74）%],差异有统计学意义（P<0.05）。胰酶法分离的细胞激素的最大分泌量、每日平均分泌量及分泌总量均高于机械法,差异均有统计学意义（P均<0.05）。结论 胰酶法分离的大鼠卵巢颗粒细胞在细胞活力和激素分泌功能方面均优于机械法,值得在卵巢早衰的研究中推广使用。     

不同分离方法对人卵巢颗粒细胞体外培养的影响

目的 比较人卵巢颗粒细胞不同分离方法.方法 取体外受精-胚胎移植(ⅣF-ET)采卵时的卵泡液,用裂解法、密度梯度离心法、酶解法分离纯化并原代培养人卵巢颗粒细胞.比较不同的分离方法获得的卵巢颗粒细胞数量、形态及其对早期培养的影响.结果 裂解法得到的颗粒细胞数较密度梯度离心法、酶解法多(P＜0.005,P＜0.001);比较3种分离方法获得的卵巢颗粒细胞的活性和孕激素分泌量差异无统计学意义;接种24h后,酶解法得到的卵巢颗粒细胞存活量最多(P＜0.05),裂解法得到的存活细胞最少(P＜0.05);裂解法获得的卵巢颗粒细胞继续培养48、72及96h均较培养24h有明显细胞增殖(P＜0.05),且与其他组存活的细胞量差异无统计学意义.结论 裂解法得到的颗粒细胞数量多,细胞生长较好,操作简单,是较理想的分离人卵巢颗粒细胞的方法.     

人离体子宫在位内膜细胞的原代培养方法探讨

目的:比较不同的消化酶对人离体子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分离培养的异同,为研究人体子宫内膜细胞生长、分化及药物作用机制提供一个较理想的实验方法。方法:将人离体子宫内膜细胞随机分为胰酶组、胶原酶组、胰酶组和胶原酶联合消化组进行消化分离和体外培养,用倒置相差显微镜观察细胞的生长状况及形态特点。结果:3组的培养成功率分别为53.33%、73.33%、86.67%。联合消化组较胰酶组培养成功高(P<0.05)。3种不同方法消化分离后的子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞贴壁、生长状况无明显差异(P>0.05)。结论:采用胰酶与胶原酶联合消化法进行子宫内膜细胞消化分离和体外培养,较单用胰酶法细胞培养的成功率高,比单用胶原酶缩短了消化时间,具有降低培养成本的优点。     

人增生性瘢痕组织中肥大细胞分离的条件优化

目的探讨分离人增生性瘢痕组织中肥大细胞(MC)所用的I型胶原酶和透明质酸酶的最佳浓度;获取MC,用于瘢痕瘙痒研究。方法用不同浓度的I型胶原酶和透明质酸酶消化分离MC;甲苯胺蓝染色和番红复染,鉴定并计数MC。结果MC体积大、核呈蓝色,胞浆内含紫红色分泌颗粒。当透明质酸酶浓度为1mg/ml时,与I型胶原酶浓度为1、2mg/ml组比较,Ⅰ型胶原酶浓度为3、4mg/ml组分离出的MC占有核细胞的百分比明显增加,差异均有显著性(P<0.01);但3mg/ml组与4mg/ml组之间的差异不明显(P>0.05)。当Ⅰ型胶原酶浓度为3mg/ml时,与透明质酸酶浓度为0.5mg/ml组比较,透明质酸酶浓度为1、2mg/ml组分离出的MC占有核细胞的百分比明显增加,差异均有显著性(P<0.01);但1mg/ml与2mg/ml组之间的差异不明显(P>0.05)。培养12h的细胞悬液中大部分黏附能力强的细胞已贴壁、溶解,而MC黏附性较差,轻轻摇动就可重新悬浮于培养液中。结论用Ⅰ型胶原酶和透质酸酶可以成功分离出人增生性瘢痕组织中的MC,最佳浓度分别为3、1mg/ml。分离的MC存活时间较长,可满足实验需求。     

分离培养人卵泡液中颗粒细胞两种方法的比较

目的 探讨简便可行分离卵巢颗粒细胞的方法以供化疗保护卵巢功能的体外实验研究.方法 分别采用密度梯度离心法和低渗透性溶解法分离及原代培养16例卵泡液中的颗粒细胞.结果 低渗透性溶解法与密度梯度离心法分离及原代培养的细胞其细胞活率和雌激素的分泌量大体相当,差异无统计学意义(P＞0.05);但低渗透性溶解法耗时明显比密度梯度离心法低,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 低渗透性溶解法并不降低颗粒细胞的活率及其激素的分泌,反而较密度梯度离心法省时,简便高效.     

人离体子宫在位内膜细胞的原代培养方法探讨

目的：比较不同的消化酶对人离体子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分离培养的异同，为研究人体子宫内膜细胞生长、分化及药物作用机制提供一个较理想的实验方法。方法：将人离体子宫内膜细胞随机分为胰酶组、胶原酶组、胰酶组和胶原酶联合消化组进行消化分离和体外培养，用倒置相差显微镜观察细胞的生长状况及形态特点。结果：3组的培养成功率分别为53．33％、73．33％、86．67％。联合消化组较胰酶组培养成功高（氏0．05）。3种不同方法消化分离后的子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞贴壁、生长状况无明显差异（B〉0．05）。结论：采用胰酶与胶原酶联合消化法进行子宫内膜细胞消化分离和体外培养，较单用胰酶法细胞培养的成功率高，比单用胶原酶缩短了消化时间．具有降低培养成本的优点。     

小鼠腔前卵泡不同分离方法的比较

目的 探讨小鼠腔前卵泡的最佳分离方法.方法 取性未成熟小鼠的卵巢,按照不同分离方法,单纯机械法与酶解法分离腔前卵泡,并用基础培养基进行培养,比较不同分离方法获得的卵泡数量、形态,及对其早期生长发育的影响.结果 2 mg/mL的胶原酶可获得大量基底膜完整的腔前卵泡及裸卵(P<0.01);体外培养2d后,酶解组卵泡生长直径大(P<0.05)、GVBD率、放出第一极体率和7d生存率无明显差异(P>0.05).结论 胶原酶酶解法较单纯机械法更易获得大量高质量腔前卵泡,且对其早期发育无明显影响.     

大鼠泪腺上皮细胞的原代培养和鉴定

目的 从大鼠泪腺组织分离泪腺上皮细胞并鉴定.方法 采用胶原酶Ⅰ、透明质酸酶和DNA酶混合消化法分离细胞,并对泪腺上皮细胞进行纯化和鉴定.采用胶原预包被培养瓶,并在培养基中添加霍乱毒素(cholera toxin,CT)维持上皮细胞形态.采用细胞免疫荧光染色方法对培养的泪腺细胞主要标志物进行鉴定,包括上皮细胞标志物细胞角...     

酶消化法急性分离大鼠主动脉平滑肌细胞及其鉴定

目的 探讨采用酶消化法快速分离SD大鼠胸、腹主动脉平滑肌细胞的方法,为膜片钳实验提供大量原代平滑肌细胞.方法 取SD大鼠胸、腹主动脉,用酶液Ⅰ(木瓜蛋白酶等)、酶液Ⅱ(胶原酶和透明质酸酶等)酶解分离平滑肌细胞,酶液Ⅰ、Ⅱ的消化时间分别选取10、15、20、25、30 min,并两两组合以确定最佳消化时间.分离的细胞经台盼蓝染色测定其活性并通过平滑肌特异性α-肌动蛋白(α-actin)免疫组化染色鉴定.结果 分离的平滑肌细胞在倒置显微镜下计数,酶液Ⅰ、Ⅱ的消化时间分别在30、15 min时平滑肌细胞数量最多为(18.3 1.5)个/低倍视野,与其他各时间点组合相比,差异有统计学意义(P＜0.05).镜下观察典型的平滑肌细胞呈长梭形,细胞膜完整,边缘光滑;台盼蓝染色,90%以上的细胞为活细胞;免疫组化染色鉴定为平滑肌细胞.结论 酶消化法分离获取SD大鼠平滑肌细胞方法简单、成本低,采用本法可获得较大量的平滑肌细胞供实验使用.     

不同消化方法对心肌成纤维细胞体外培养影响

目的对比不同消化方法对原代乳鼠心肌成纤维细胞体外培养的影响,探求更高效的细胞分离、培养方法。方法改良既往文献报道的心肌成纤维细胞分离方法,选用胶原酶、胰酶、胶原酶加胰酶消化液分别对同等数量随机挑选的同窝出生1～2 d的SD乳鼠进行心肌成纤维细胞分离,从细胞数量及活性、细胞增殖、细胞纯度及对中药、西药反应灵敏度等方面对分离出的第0代(P0)细胞及传代至第2代(P2)的细胞进行比较。结果胶原酶消化法分离所得细胞在数量、成活率、贴壁速度、增殖速度方面,明显优于胰酶消化法或胶原酶加胰酶消化法,P0.05,差异有统计学意义;在形态学上并无明显差异,且细胞纯度均可达到95%;胶原酶消化法所得细胞对中药、西药灵敏度较高,P0.05,差异有统计学意义。结论选用胶原酶作为原代乳鼠心肌成纤维细胞的消化酶,运用时间梯度消化细胞,可以高效得到数量多、活性好、纯度高、对药物反应灵敏的细胞。     

黄芪对肝星状细胞胶原降解基因表达的影响

目的 :观察黄芪对肝星状细胞有关胶原降解基因表达的影响。方法:选择肝星状细胞系作为体外研究对象 ,采用MTT法选择药物的实验浓度 ,酶联免疫测定 (ELISA)法检测细胞上清液中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原含量 ,逆转录多聚酶链反应检测间质性胶原酶及金属蛋白酶组织抑制因子基因表达水平。结果:与对照组比较 ,黄芪组细胞上清液中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原含量明显降低(P<0.01),黄芪组间质性胶原酶基因表达水平明显增强 (P<0.01) ,而金属蛋白酶组织抑制因子基因表达水平无明显差异 (P>0.05)。结论:黄芪的抗肝纤维化作用可能部分是通过增强间质性胶原酶基因表达水平而完成的     

性成熟小鼠卵巢和性未成熟小鼠体外培养卵泡的雌激素受体α、β亚型表达的研究

目的:探讨小鼠体内成熟与卵泡体外培养两种情况下卵泡的雌激素受体α亚型和β亚型的分布及表达.方法:采用兔抗小鼠ERα、ERβ多克隆抗体分别对性成熟小鼠卵巢和性未成熟小鼠窦前卵泡体外培养后免疫组化染色,检测雌激素受体两种亚型的分布,并对各级卵泡的染色强度进行定量分析.结果:性成熟小鼠卵巢的免疫组化染色显示膜细胞和间质细胞ERα的染色阳性,ERβ染色为阴性;原始卵泡的颗粒细胞ERβ、ERα染色均为阴性,从初级卵泡开始至成熟卵泡的颗粒细胞ERβ的染色呈阳性,ERα染色为阴性.其中ERβ的表达水平在小窦状卵泡的颗粒细胞最高,大窦状卵泡的颗粒细胞染色次之,成熟卵泡的颗粒细胞染色下降.性成熟小鼠卵巢各级卵泡的颗粒细胞ERβ的免疫染色强度显示:除初级卵泡与小窦前卵泡之间颗粒细胞上的ERβ染色无差异外,其余各组卵泡之间颗粒细胞上ERβ的染色强度都具有显著差异(P＜0.01).各级卵泡的卵母细胞两种ER亚型的染色都呈阳性.性未成熟小鼠各级卵泡的颗粒细胞、卵母细胞染色结果和染色强度定量分析结果分别同性成熟小鼠免疫组化染色和染色强度定量分析结果.结论:雌激素受体β亚型在卵泡发育中起主要作用.体内成熟和体外培养两种情况下卵泡两种雌激素受体的表达相似.     

分离人卵泡液中颗粒细胞两种方法的比较

目的：探讨简便可行分离卵巢颗粒细胞的方法以供化疗保护卵巢功能的体外实验研究。方法：分别采用密度梯度离心法和低渗透性溶解法分离及原代培养16例卵泡液中的颗粒细胞。结果：低渗透性溶解法与所密度梯度离心法分离及原代培养的细胞其细胞活率和雌激素的分泌量大体相当,差异无统计学意义（P>0.05）;但低渗透性溶解法耗时耗钱明显比密度梯度离心法低。差异有统计学意义(P<0.05)。结论：低渗透性溶解法并不降低颗粒细胞的活率及其激素的分泌,反而较密度梯度离心法省时省钱,简便高效。     

兔原代肋软骨细胞的三步酶消化法高效分离及体外培养观察

目的观察三步酶消化法分离兔原代肋软骨细胞的效果和收获效率,并观察其体外传代培养的生物学特性.方法三步酶消化法设计为以培养液配制的1g/L胰蛋白酶/1g/L EDTA、1g/L透明质酸酶和2g/LⅠ型胶原酶顺序消化肋软骨分离细胞,检测细胞收获效率和存活率;体外传代培养观察细胞形态、生长及胞外基质中Ⅰ型和Ⅱ型胶原、蛋白多糖聚集体等的变化.结果①肋软骨经三步酶消化软骨基质逐步解离和降解,细胞被完全分离,每克软骨的细胞收获量平均为4 295.7×104个细胞,细胞存活率平均为97.2%.②原代和第1代细胞附壁生长呈三角形或多角形,生长融合时呈卵圆形,Ⅱ型胶原免疫组化和甲苯胺蓝异染反应均呈阳性,原代细胞外基质有高的硫酸糖胺多糖含量为(80.61±11.40)μg/cm2;第3代后细胞逐渐变为梭形,Ⅱ型胶原免疫组化为阴性,甲苯胺蓝异染反应亦明显减弱,第4代细胞外基质的硫酸糖胺多糖含量为(44.74±10.18)μg/cm2.结论①三步酶消化法能完全消化降解肋软骨基质,使细胞完全分离,并具有高细胞收获率和高细胞存活率.②原代和第1代肋软骨细胞具有良好的生物学活性.     

人子宫内膜异位症在位内膜间质细胞原代培养方法探讨

目的 探讨子宫内膜异位症在位内膜间质细胞原代培养的最优方法.方法 40例子宫内膜异位症患者(增殖期和分泌期内膜各20例)的在位内膜组织随机分为4组,分别采用胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶消化,随机选择离心分离或筛网分离间质细胞,行细胞免疫组织化学染色(SP法)鉴定.结果 增殖期与分泌期内膜间质细胞培养成功率差异无统计学意义(χ2=3.68,P＞0.05).胰蛋白酶组的细胞培养成功率与其他3种胶原酶组的细胞培养成功率间差异有统计学意义(P＜0.05),3种胶原酶细胞培养成功率间差异无统计学意义(P＞ 0.05);I型胶原酶酶解所得间质细胞的单层汇聚时间[(5.0±0.8)d] 最短(P＜0.05);I型胶原酶和胰蛋白酶的细胞消化时间差异无统计学意义(P＞0.05),但短于Ⅱ型和Ⅳ型胶原酶(P＜0.05);筛网分离法与离心分离法在细胞培养成功率和细胞纯度上差异无统计学意义(P＞0.05),但前者的细胞单层汇聚时间[(6.0±0.3)d]短于后者[(6.5±0.4)d](P＜0.05).结论 月经周期不影响细胞培养成功率;采用I型胶原酶消化子宫内膜、筛网分离间质细胞是子宫内膜异位症在位内膜间质细胞培养的最好方法.     

人胎儿毛囊隆突细胞的分离、培养与鉴定

目的:建立一种简单高效的毛囊隆突细胞的培养方法. 方法: 将5～7 mo终止妊娠胎儿头皮的毛干中上部剪下后Ⅰ型胶原酶消化,采用成纤维细胞和毛囊隆突细胞对胰酶的不同敏感性进行纯化,流式细胞仪进行细胞周期分析,MTT法检测细胞克隆率,免疫组化检测细胞K19的表达情况. 结果: 消化法原代培养可以每小时获得100个左右毛囊隆突,经姨酶消化不同时间可以纯化毛囊隆突细胞,流式细胞仪检测第二代细胞G1期占88.20%,细胞克隆形成率为18.2%,K19表达呈阳性. 结论: 建立了一种简单高效的毛囊隆突细胞的分离、培养方法,并证明其具有某些干细胞的特征性表现.     

混合酶消化法大鼠颅盖骨细胞的原代培养和鉴定

目的 通过不断的摸索,寻找一种获得细胞数量较多且纯的原代成骨细胞的体外培养方法,为下一步实验研究奠定基础.方法 取出生24 h内的SD大鼠脱臼处死,取出颅盖骨,剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的组织片;采用胰酶和Ⅰ型胶原酶混合酶消化法分离获得原代成骨细胞;采用"差速贴壁法"进行纯化.通过对细胞形态学的镜下观察,碱性磷酸酶染色及Ⅰ型胶原免疫组化法等对细胞进行鉴定.结果 镜下观察所获得的细胞具有成骨细胞的典型特征,细胞多为单核,呈三角形、多边形、长梭形等形态,并伸有粗大伪足;碱性磷酸酶染色及Ⅰ型胶原免疫组化染色呈阳性.结论 采用混合酶消化法可获得数量较多且活性较好的细胞,再采用"差速贴壁法"可以去除成纤维细胞等杂质细胞,获得纯度较高的成骨细胞.     

小鼠肝Kupffer细胞分离方法探讨

目的 探讨分离BALB/c小鼠肝Kupffer细胞(KC)的方法.方法采用在体酶灌注和离体酶消化、不连续密度梯度离心、选择性贴壁三步法分离KC,并比较链霉蛋白酶、Ⅳ型胶原酶及联用链霉蛋白酶和Ⅳ型胶原酶等3种不同酶消化分离方法所得KC得率及纯度.结果3种不同酶消化分离方法细胞得率分别为(6.32±0.5)×106 g-1,(3.66±0.4)×106g-1,(10.3±0.7)×106 g-1;细胞纯度分别为(93.2±1.7)％,(90.7±1.5)％,(94.5±1.9)％.结论联合链霉蛋白酶和Ⅳ型胶原酶在体灌注和离体消化是分离小鼠KC的较好方法.