人脑胶质瘤细胞放射敏感性的实验研究

目的 观察不同人脑胶质瘤细胞的放射敏感性,测定种植系数(PE)和存活分数(SF)等参数并且根据L-Q模型绘制剂量存活曲线,为脑胶质瘤的综合治疗提供重要的参考资料。方法实验采用体外传代培养的11种人脑胶质瘤细胞株,即T98G、SF295、Skmg-1、Skmg-4、MGR-1、MGR-2、MGR-3、UWR-7、SF767、SHG-44和uw28。应用集落形成技术和L-Q模型确定放射敏感性参数及绘制剂量存活曲线。结果11种人脑胶质瘤细胞株的放射敏感性存在较大差异,PE从1.61％到40.89％;SF_2的范围从0.32到0.59,平均为0.44±0.10;SF_8从0.00到3.71×10~(-2),平均为0.42×10~(-2)±1.1×10~(-2)。结论 人脑胶质瘤细胞具有不同的内在放射敏感性。     

胶质瘤干细胞对替莫唑胺敏感性的研究

目的 探讨胶质瘤干细胞(GSC)对替莫唑胺(TMZ)的敏感性及耐药机制.方法 新鲜多形性胶质母细胞瘤(GBM)标本培养后获得GSC.免疫荧光技术榆测未分化GSC的CD133及分化生长GSC的GFAP的表达,MTS法检测对替莫唑胺的敏感性,流式细胞技术对CD133阳性细胞的比例进行定量,荧光标记的甲基化特异性PCR分析MGMT启动子区域的甲基化状态,Western blot检测抑癌基因PTEN的表达.结果 (1)5例GBM标本中成功获得GSC,符合肿瘤下细胞定义.(2)5个GSC细胞株多数对TMZ不敏感.其中,T509的半数抑制浓度(IC50)为22.3 μmol/L(敏感),T411的IC50为286.3 μmol/L(中度敏感),其余3个细胞株T402,T405及T509的IC50皆大于1000μmol/L(不敏感).(3)CD133阳性细胞比例大于10%的GSC细胞株对TMZ不敏感.(4)MGMT启动子区域呈去甲基化状态的GSC对TMZ不敏感或仅为中度敏感.(5)5个GSC细胞株中,PTEN表达水平差异大,与GSC对TMZ的敏感性无明显关联.结论 GSC对TMZ普遍耐药,与MGMT启动子区域甲基化状态及CD133阳性细胞有关,而与PTEN蛋白表达水平无明显关联.     

人脑胶质瘤干／祖细胞系SU-2放射耐受及其相关机制的初步研究

目的研究胶质瘤干细胞在胶质瘤耐受放射中的作用,为克服恶性胶质瘤放射耐受寻找新的干预靶点。方法干细胞培养条件下培养自建人脑胶质瘤干/祖细胞系SU-2,以及人脑胶质瘤细胞系U251和SHG-44,观察不同剂量直线加速器照射前后细胞形态变化、Hoechst 33342-细胞和CD133 细胞比例、肿瘤细胞存活率和裸小鼠致瘤率等项指标,并以实时荧光定量PCR方法检测人脑胶质瘤细胞系U251和人脑胶质瘤干/祖细胞系SU-2照射前后MGMT基因表达水平。结果当照射剂量为1～15Gy时,人脑胶质瘤干/祖细胞系SU-2中的Hoechst 33342-细胞和CD133 细胞比例明显增加,高达18.73%和13.70%,细胞存活率升高、致瘤率(8/8)增加、侵袭性增强,MGMT基因表达水平轻度升高。结论经一定剂量的X线照射后,胶质瘤干细胞因具有强于其他肿瘤细胞的放射耐受性而出现选择性存活且细胞比例升高,其生物学特性如细胞存活率、体内致瘤率增加,侵袭性增强。可能与胶质瘤干细胞DNA损伤修复能力提高有关,确切的分子学机制值得进一步深入研究。     

原肌球蛋白1与胶质瘤放射敏感性的体外研究

目的 研究原肌球蛋白1(tropomyosin 1,TPM1)与胶质瘤U251细胞放射抵抗性之间的关系,为进一步寻找提高胶质瘤的放射敏感性的可能靶点提供理论依据。方法 转染shRNA-TPM1(pc DNA3. 1-TPM1)抑制(诱导) U251和RR-U251细胞的TPM1表达。各组细胞进行放射治疗后,采用MTT法、划痕实验、侵袭实验、流式细胞术分别检测U251(RR-U251)细胞的增殖、迁移、侵袭、凋亡能力。用Western Blot检测TPM1蛋白表达水平,进而观察各组细胞放射敏感性的变化。结果 与U251细胞相比,RR-U251细胞的TPM1蛋白表达水平明显下降(P 0. 01)。各组细胞进行放射治疗后,与对照组相比,沉默TPM1的RR-U251和U251细胞的增殖、迁移和侵袭能力均显著提高,细胞凋亡率降低(均P 0. 05)。TPM1基因过表达时逆转了这一现象。结论 TPM1可提高胶质瘤U251细胞的放射敏感性。TPM1与胶质瘤细胞的放射抵抗机制有关,其可能是改善胶质瘤放射敏感性的潜在靶点。     

靶向脑胶质瘤干细胞的树突状细胞疫苗治疗恶性脑胶质瘤的体外实验研究

目的 研究应用脑胶质瘤干细胞抗原制备的树突状细胞(DC)疫苗对胶质瘤细胞的杀伤作用.方法 反复冻融法获得源于胶质瘤细胞系U251中的肿瘤干细胞的胞溶物,和源于小鼠间充质干细胞的DC共培养,获得胶质瘤干细胞疫苗.流式细胞仪检测疫苗表面标志变化;CCK-8法检测其促T细胞增殖能力以及对胶质瘤细胞的靶向杀伤作用;ELISA法检测培养基中干扰素-γ的含量.用热处理U251细胞制备的DC疫苗作为对照组.结果 与对照组相比,脑胶质瘤干细胞疫苗的CD80、CD86、CD11c和MHC Ⅱ等表面标志表达显著提高,具有更强的促T细胞增殖能力(P＜0.01),对U251细胞特异性靶向杀伤率随效靶比的提高而增加,最高为(78.508±4.156)％,相应的干扰素-γ分泌水平也达到最高.结论 胶质瘤干细胞疫苗能更有效地诱导特异性细胞毒性T细胞,表现出更强的抗肿瘤特性.     

人脑胶质瘤中ATM、ATR、Chk1和Chk2基因表达研究

目的 研究ATM、ATR、Chk1和Chk2在人脑胶质瘤中的表达及其与肿瘤发生的关系. 方法 采用SYBRTM Green实时定量PCR技术检测35例人原发脑胶质瘤组织和10例正常脑组织中的ATM、ATR、Chk1和Chk2的表达水平. 结果 ATR、Chk1和Chk2基因在各级脑胶质瘤中表达较正常脑组织升高,差异均有统计学意义(P<0.05).其中,ATR和Chk2基因表达在Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级胶质瘤组织之间差异均无统计学意义(P0.05),而Chk1,在Ⅳ级胶质瘤中的表达较Ⅱ级、Ⅲ级胶质瘤明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05).ATM基因表达量在正常脑组织和各级脑胶质瘤中差异无统计学意义(P0.05). 结论 ATR、Chk1和Chk2在人脑胶质瘤中表达上调,说明这些基因可能与人脑胶质瘤的发生有关.其中,Chk1表达与肿瘤恶性程度有关.可作为判别胶质瘤病理级别的辅助指标.     

MGMT反义RNA对人脑胶质瘤耐药性的逆转

目的探讨O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)反义RNA对人脑胶质瘤细胞MGMT表达的调节作用。方法将分别为针对MGMTmRNA5’端和全长序列的反义表达载体pLaMT5SN和pLaMTSN,分别导入U251/BCNU耐药细胞,经G418筛选产生稳定抗性克隆aMT5U和aMTU;分别将正义表达载体pLMTSN和空载体pLXSN导入U251/BCNU耐药细胞,经G418筛选产生稳定抗性克隆MTU和XU作为对照。观察转染后的U251/BCNU细胞对MGMT表达的调节作用及U251/BCNU细胞对BCNU敏感性的影响。结果经RT-PCR检测显示,pLaMT5SN和pLaMTSN可在一定程度上降低MGMTmRNA表达水平;MTT检测显示,aMT5U和aMTU细胞对BCNU的敏感性分别较未转染细胞提高7倍和2倍,表明pLaMT5SN和pLaMTSN可在一定程度上提高U251/BCNU细胞对BCNU的敏感性。结论MGMT反义RNA能够在一定程度上抑制脑胶质瘤细胞MGMT的表达水平,提高肿瘤细胞对亚硝基脲类药物的敏感性。     

自体肿瘤树突状融合细胞体外诱导抗人脑胶质瘤活性的研究

目的本实验使用人脑胶质瘤细胞和同一患者的外周血单个核细胞(PBMC)诱导的树突状细胞(DC)融合来制备DC-肿瘤融合细胞(FC),并研究其体外诱导抗胶质瘤的活性。方法采用PEG法将来自胶质瘤患者的肿瘤细胞和其自体DC进行融合,采用混合淋巴细胞反应和乳酸脱氢酶法(LDH)释放法来分别评价FC刺激T淋巴细胞增殖能力和FC致敏的T淋巴细胞对相同患者胶质瘤细胞的杀伤能力。结果建立了DC-人脑胶质瘤融合细胞(FC)的制备方法,通过荧光双染色证明FC具有胶质瘤细胞和DC细胞的双重标记,经过1.5Gy照射的FC致敏患者外周血T细胞,对自体胶质瘤细胞的杀伤明显高于仅用单纯DC或自体胶质瘤细胞致敏的T细胞(P<0.01),而且杀伤能力随E/T率的增加而由28%上升到90%,但对乳腺癌细胞MCF7的杀伤仅在10%左右,显著低于对自体胶质瘤细胞的杀伤(P<0.01);同时致敏的T细胞在负载患者胶质瘤细胞裂解物(lysate)的自体DC的刺激下引起的增殖高于仅用单纯DC或自体胶质瘤细胞致敏的T细胞,并具有统计学意义(P<0.05);对于已经致敏的T淋巴细胞,负载lysate的自体DC所引起的T细胞增殖明显高于自体DC或lysate的作用(P<0.01)。结论本实验所制备的FC经过1.5Gy照射后,可以有效致敏患者外周血T细胞,并在负载抗原的DC的刺激下可以在体外扩增,致敏的患者外周血T淋巴细胞是可以进行特异性杀伤的CTL,杀伤能力随效靶比增高而上升。     

凝胶侵袭模型对胶质瘤细胞体外侵袭力研究的应用初探

目的 初步探讨凝胶侵袭模型用于人胶质瘤细胞体外侵袭力研究的可行性,观察普通培养的胶质瘤细胞与胶质瘤干细胞在凝胶侵袭模型中侵袭力的差异,为胶质瘤的体外研究寻求新的实验手段.方法 经纯化的Ⅰ型和Ⅲ型胶原与MEM培养基混合制备凝胶液,将原代培养的胶质瘤细胞经悬滴法制成的细胞球和胶质瘤干细胞所形成的细胞球种植于其中,每个细胞球含(10-15)×103个细胞,在添加含有不同药物浓度基质金属蛋白酶抑制剂GM6001(0、25、50、75、100μmol/L)的相应培养基中培养4 d,测量不同药物浓度组肿瘤细胞侵袭距离及其差异.结果 不同处理组胶质瘤细胞在凝胶侵袭模型中生长良好,最初的细胞球形态呈规则圆形,随着时间的推移肿瘤细胞侵袭距离逐渐增加;且对GM6001的抑制作用表现出不同程度的剂量依赖性,以75 μmol/L GM6001对普通培养的胶质瘤贴壁细胞的侵袭抑制作用最为明显(均P=0.000);而25μmol/L GM6001对胶质瘤干细胞球的侵袭抑制作用最显著(P=0.002,0.012,0.000).结论 凝胶侵袭模型适用于普通贴壁培养的胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞球.     

胶质瘤放射免疫治疗的研究现状

近年来放射免疫治疗应用于胶质瘤的辅助治疗，常用的单抗有：①抗表皮生长因子受体单抗（mAb425）；②抗腱蛋白单抗81C6mAb;③81C6抗体的F（ab＇）2片段、Fab片段；④多肽分子。常用的同位素有^133I ^90Y、^211At等。早期通过静脉注射给药，随后经鞘内注射．但因其副作用较大，现主要采用局部用药途径。本文就此类药物在国外进入Ⅰ～Ⅱ期临床实验中的治疗效果及毒副作用、存在的问题及今后的发展等进行综述。     

脑胶质瘤干细胞鉴定与增殖及耐药特性的实验研究

目的 从胶质瘤组织中分离和培养出肿瘤干细胞,并初步探讨其生长特性. 方法 收集脑胶质瘤手术标本并获取细胞,用含有表皮生长因子(EGF)、白血病细胞抑制因子(LIE)和碱性成纤维生长因子(bFGF)的无血清培养液原代培养,再经免疫磁珠分离得到CD133+细胞.并用免疫细胞化学技术检测CD133、NSE和GFAP在细胞中的表达以鉴定CD133+细胞,比较不同恶性级别胶质瘤组织的CD133+细胞生长情况,并用CCK8法比较CD133+和CD133-细胞对替尼泊苷(VM-26)的耐药性. 结果 从胶质瘤组织中成功分选获得CD133+细胞,这些细胞能自我更新,增殖,并分化成NSE+和GFAP+的细胞.恶性度高的胶质瘤组织中CD133+细胞生长速度明显比低级别中的CD133+细胞快,且CD133+细胞在含有VM-26培养基中的存活细胞数显著多于CD133-细胞(P＜0.05). 结论 胶质瘤组织中存在肿瘤干细胞,这类细胞具有很强的耐药性,高恶性度胶质瘤组织中的CD133+细胞具有更强的增殖能力.     

热疗对增强阿霉素治疗神经胶质瘤敏感性研究

目的探讨热疗对提高人神经胶质瘤细胞U251阿霉素敏感性的影响及相关机制。方法将U251细胞分为空白对照组、化疗组、热疗组及热疗+化疗组分别进行相应处理。48h后采用台盼蓝拒染法检测细胞存活率,使用SRB检测肿瘤细胞抑制率,使用流式细胞仪检测细胞凋亡率、细胞表面P-gp蛋白和Bcl-2蛋白的表达情况。以作用48h的IC 50值作为实验的工作浓度。结果化疗及热疗对U251细胞有明显抑制作用(P<0.01),热疗+化疗组与其他各组相比差异有统计学意义(P<0.01);热疗组、化疗组及热疗+化疗组的细胞凋亡率均较对照组显著升高,各组比较差异均有统计学意义(P<0.01);p-gp蛋白及Bcl-2蛋白表达均下降,各组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论热疗联合阿霉素化疗能增强对U251细胞的体外抑制作用,提高肿瘤细胞的凋亡率,通过联合热疗有效下调P-gp及Bcl-2蛋白的表达,提高U251细胞对阿霉素化疗的敏感性。     

脑胶质瘤放射敏感性相关分子机制的研究进展

<正>脑胶质瘤起源于神经上皮组织,是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤。因其呈浸润性生长,手术难以完全将肿瘤切除干净,残留的肿瘤细胞易导致肿瘤复发。迄今,脑胶质瘤依然需要综合治疗,而放射治疗是重要的方法之一。以期破坏术后残存的肿瘤细胞,控制肿瘤细胞的生长,提高疗效,改善预后。但是临床上放疗预后经常未能达到预期的效果,而且即使是相同级别的胶质瘤放疗后的效果也不尽相同。大     

苦参碱对胶质瘤大鼠模型中Fas表达的调节作用的实验研究

目的 探讨苦参碱应用前后C6脑胶质瘤大鼠模型中Fas因子的表达变化及意义.方法采用脑立体定向技术,将体外培养的C6胶质瘤细胞注入大鼠尾状核区制备胶质瘤大鼠模型,并根据是否用药及用药量的多少分为空白对照组、冰片组、苦参碱低剂量组、苦参碱高剂量组、苦参碱低剂量+冰片组、苦参碱高剂量+冰片组.通过大鼠生存状态、标本的大体所见、MRI、HE染色观察苦参碱对胶质瘤大鼠模型生存质量及胶质瘤体积的影响,用免疫组织化学方法检测苦参碱对胶质瘤大鼠模型肿瘤细胞中Fas表达的影响.结果 大鼠生存状态、标本的大体所见、MRI及HE染色显示苦参碱可显著提高胶质瘤大鼠模型的生存质量,抑制胶质瘤细胞增殖.免疫组化结果显示,苦参碱低剂量+冰片组(98.16±11.82)、苦参碱高剂量+冰片组(1 12.80±12.12)Fas表达高于空白对照组(39.09±7.79)、冰片组(46.87±7.43)、苦参碱低剂量组(42.41±7.83)、苦参碱高剂量组(44.20±7.47),苦参碱高剂量+冰片组Fas表达高于苦参碱低剂量+冰片组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 苦参碱能增加胶质瘤细胞中Fas的表达,抑制胶质瘤细胞增殖.     

胶质瘤基因治疗进展

胶质瘤为起源于神经胶质细胞的肿瘤,呈浸润性生长,与周围组织无明显分界,目前采用手术、放疗、化疗等措施疗效不十分理想,五年生存率仅为35%～50%[1]。手术全切率低和术后复发率高以及肿瘤细胞对放疗的辐射耐受性造成的残余病灶再次复发[2]仍是困扰神经外科医师的重要难题之一。目前许许多多的基因被用于治疗神经胶质瘤,展现了神经胶质瘤基因治疗的广阔前景。本文就胶质瘤的基因治疗的最新研究进展进行归纳和综述。     

胶质瘤干细胞化疗耐受性的研究进展

近年的研究业已证实胶质瘤干细胞(gliomastemcells,GSCs)的存在,并对其生物学特性进行了较为深入的研究,化疗耐受性是其重要牛物学特性之一.     

三氧化二砷对人脑SHG-44胶质瘤细胞作用的体外实验研究

目的 探讨三氧化二砷(As2O3)对人脑SHG-44胶质瘤细胞株的增殖抑制及诱导凋亡机制.方法 将不同浓度的As2O3与体外培养的SHG-44胶质瘤细胞相互作用后,采用MTT比色法检测As2O3对胶质瘤细胞的增殖抑制;倒置显微镜、荧光显微镜下观察吉姆萨及Hochest33258染色后细胞凋亡的形态学改变;流式细胞仪检测细胞凋亡及对SHG-44胶质瘤细胞周期影响.结果 MTT比色法检测到As2O3对SHG-44胶质瘤细胞增殖具有明显的抑制作用,并呈剂量依赖性和时间依赖性;倒置显微镜及荧光显微镜下可观察到给药组细胞生长密度低以及出现细胞凋亡的特征性改变;流式细胞仪检测到给药组细胞凋亡比率明显高于空白对照组(P＜0.05),并具有剂量依赖性及时间依赖性,同时将胶质瘤细胞阻滞在S期,抑制了细胞周期的进程.结论 As2O3对SHG-44胶质瘤细胞增殖具有明显的抑制作用、可诱导SHG-44胶质瘤细胞的凋亡,并抑制细胞周期进程.     

树突状细胞融合瘤苗抗胶质瘤的实验研究

目的观察树突状细胞（dendritic cells，DC）融合瘤苗防治C6胶质瘤的疗效，对其抗肿瘤作用机制进行初步探讨。方法采用PEG化学融合方法制备融合瘤苗，流式细胞技术分选瘤苗，对融合瘤苗进行免疫组化和功能学鉴定；立体定向制备大鼠颅内C6肿瘤模型，荷瘤后5d经尾静脉注射10^7融合瘤苗、10^7DC以及100μl PBS，分别设为A、B、C三组，采用Log—rank对数秩检验进行生存分析，对肿瘤标本进行病理学检查。结果实验中DC具有典型的树突状结构，OX62特异性标志物阳性表达；融合瘤苗GFAP—FITC免疫荧光检查阳性；Log—rank生存分析数据对数秩检验表明A组与B、C组比较均有统计学意义（P〈0．01）；A组晚期死亡大鼠（〉31d）HE染色见较多的炎性细胞浸润，CD8^＋Mcab免疫组化染色阳性。结论PEG法可有效制备DC／C6融合瘤苗，融合瘤苗能够有效的发挥抗肿瘤效果，CD8^＋T细胞参与颅内抗胶质瘤免疫反应。     

替莫唑胺及甲泼尼龙对人胶质瘤细胞放射治疗敏感性的影响

目的探讨替莫唑胺(TMZ)和甲泼尼龙(MP)对人胶质瘤细胞系U251放射治疗敏感性的影响,以期为临床优化治疗方案提供依据。方法经体外传代培养的U251细胞根据治疗方案的不同,分为对照组、放射治疗(R)组、放射治疗+替莫唑胺(R+TMZ)组、放射治疗+甲泼尼龙(R+MP)组、放射治疗+替莫唑胺+甲泼尼龙(R+TMZ+MP)组,分别予以放射治疗(2 Gv/24 h)、替莫唑胺、甲泼尼龙及三者联合治疗。采用磺酰罗丹明B(SRB)比色法、流式细胞术和Western blotting法分析U251细胞增殖率和凋亡率,观察凋亡相关蛋白Bax和Bc1-2表达变化。结果放射线照射联合甲泼尼龙治疗后,U251细胞存活率明显升高(均P=0.000);但经体外培养24和48 h后,三者联合治疗组(R+TMZ+MP组)U251细胞增殖率显著高于放射治疗联合替莫唑胺组(P=0.000)。除对照组外,不同抗肿瘤治疗组U251细胞凋亡率均呈现升高趋势(P=0.000),但放射治疗联合甲泼尼龙组细胞凋亡率显著低于其他各组(均P=0.000)。经放射线照射联合替莫唑胺和三者联合治疗后,U251细胞Bax蛋白表达水平升高(P=0.000),而放射线照射联合甲泼尼龙和三者联合治疗,Bcl-2蛋白表达水平升高;其中以放射治疗联合替莫唑胺组Bax/Bcl-2比值最高(P=0.000),放射治疗联合甲泼尼龙组最低(P=0.000)。结论甲泼尼龙可以诱导人胶质瘤细胞产生放射抵抗,而替莫唑胺对甲泼尼龙诱导的放射抵抗具有增敏作用。提示:胶质母细胞瘤患者在应用甲泼尼龙减轻放射治疗不良反应过程中所诱导的放射治疗抵抗可通过同时应用替莫唑胺而抵消。     

CDC2敲低治疗人脑胶质瘤的实验研究

目的 提供CDC2作为胶质瘤发生发展相关新分子的实验依据.方法 构建针对目的 基因的shRNA逆转录病毒表达载体;对体外培养的人脑胶质瘤细胞及其裸小鼠移植瘤进行转染,观察与目标基因相关的表型变化;荧光实时定量PCR检测mRNA表达,Western印迹检测蛋白表达;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡的变化.结果 shRNA表达载体使人脑胶质瘤细胞株SHG44 CDC2的mRNA、蛋白表达显著下调,同时出现了明显的细胞G2/M期阻滞,细胞生长抑制,凋亡增加.裸小鼠皮下移植瘤明显缩小;肿瘤颅内移植裸小鼠生存期明显延长.结论 CDC2基因过表达是胶质瘤发生发展病因分子之一,敲低其表达可使肿瘤的恶性增殖得到控制.