套式PCR扩增特定SSU rRNA基因片段检测四川疟原虫感染的研究

目的用套式PCR系统诊断、鉴别人体疟原虫感染。方法以疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸（SSUrRNA）基因为靶基因,选用1对疟原虫属特异性引物和4对种特异性引物,建立套式PCR扩增系统并用于四川省疟疾病人血样的检测。结果从间日疟原虫、恶性疟原虫和三日疟原虫感染血样中分别扩增出104bp、102bp和115bp预期大小的特定扩增带。61份血样检测结果与镜检的间日疟阳性符合率为100％。并查出镜检漏诊的2例P.v.和P.m.的混合感染及1例P.v.、P.f.和P.m.的混合感染病例。结论本系统特异、灵敏、稳定、简便,可在诊断疟疾的同时判定混合感染,故对疟疾的诊断、大规模流行病学研究及疫情监控有实际应用价值。     

套式PCR扩增SSU rDNA特定片段检测云南金平县疟原虫感染的研究

目的　采用套式 PCR系统诊断、鉴别人体疟原虫感染。　方法　采用已建立的套式 PCR系统扩增 SSU r DNA特定片段检测云南金平县恶性疟镜检阳性患者的 6份血样 ,并设阳性与阴性对照。　结果　间日疟原虫、恶性疟原虫和三日疟原虫感染血样中分别扩增出 10 4 bp、10 2 bp和 115 bp预期大小的特定扩增带。正常人血、人源弓形虫、杜氏利什曼原虫 DNA及灭菌双蒸水均未产生特异扩增带。 6份血样中检出 4份 P.v.、P.f.和 P.m.的混合感染 ,1份 P.v.和 P.f .及 1份 P.f .和 P.m.的混合感染。　结论　该系统特异、灵敏、稳定 ,在诊断疟疾的同时可准确地判定混合感染 ,对疟疾的诊断、大规模流行病学研究及疫情监控等具有实际应用价值。     

套式PCR扩增SSU rDNA特定片段检测云南金平县疟原虫感染的研究

目的：采用套式PCR系统诊断、鉴别人体疟原虫感染。方法：采用已建立的套式PCR系统扩增SSUrDNA特定片段检测云南金县恶性疟镜检阳性患者的6份血样，并设阳性与阴性对照。结果：间日疟原虫、恶性疟原虫和三日疟原虫感染血样中分别扩增出104bp、102bp和115bp预期大小的特定扩增带。正常人血、人源弓形虫、杜氏利什曼原虫DNA及灭菌双蒸水均未产生特异扩增带。6份血样中检出4份p.v.、p.f.和p.m.的混合感染1份p.v.和p.f.及1份p.f.和p.m.的混合感染。结论：该系统特异、灵敏、稳定，在诊断疟疾的同时可准确地判定混合感染，对疟疾的诊断、大规模流行病学研究及疫情监控等具有实际应用价值。     

PCR检测疟疾混合感染的现场应用研究

目的 评价PCR检测技术在间日疟与恶性疟混合感染区诊断疟疾的现场应用价值。方法 采集海南省疟疾混合感染流行区304份滤纸干血滴样本，根据红内期疟原虫SSUrRNA基因序列，设计合成3条引物．采用PCR技术在同一反应体系中扩增出间日疟原虫和恶性疟原虫不同的DNA片段，检测现场所采样本中的间日疟原虫或恶性疟原虫DNA；同时与镜检法进行比较。结果 在304份样本中，PCR法阳性15份，其中间日疟7份．恶性疟8份；镜检法阳性11份，其中间日疟6份，恶性疟5份。镜检阳性的样本PCR均为阳性；镜检阴性而PCR阳性的4份样本，其扩增产物经限制性酶切鉴定，证实为间日疟原虫或恶性疟原虫DNA。结论 此PCR检测体系灵敏、特异．对诊断或鉴别诊断间日疟原虫和恶性疟原虫混合感染具有实用价值。     

PCR鉴别诊断间日疟及恶性疟的研究

目的 :在同一反应体系中建立能鉴别诊断间日疟与恶性疟的 PCR检测方法。方法 :根据红内期疟原虫 SSUr RNA编码基因序列 ,设计合成 3个引物 ,采用聚合酶链反应技术 ,在同一反应体系中 ,间日疟原虫和恶性疟原虫分别预期被扩增出 34 1bp和 4 31bp的 DNA条带。结果 :间日疟原虫和恶性疟原虫模板在同一反应体系中分别被扩增出预期大小的 DNA片段 ,并经限制性酶切证实 ;杜氏利什曼原虫、弓形虫、健康人血及空白对照均无特异性扩增条带 ;以该检测体系至少可检出原虫血症为 2 .56× 10 ^-7间日疟原虫感染和 1.0 8× 10 ^-5恶性疟原虫感染 ;69份镜检阳性的间日疟和 2份恶性疟患者血样 PCR检测均为阳性 ,1例发热待查患者PCR诊断为间日疟 ,与镜检复查结果一致 ,所有疟疾阳性标本中未检出混合感染 ,2 0份健康人血 PCR均为阴性。结论 :该检测体系灵敏、特异 ,对于诊断间日疟和恶性疟以及鉴别间日疟原虫和恶性疟原虫混合感染具有一定的应用价值。     

疟疾复合PCR检测系统的建立

目的：建立简易、快速的复合ＰＣＲ系统,用于检测间日疟、恶性疟及混合感染。方法：以疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸基因为靶片段,设计疟原虫属特异性上游引物Ｓ１和间日疟原虫、恶性疟原虫种特异性下游引物Ｓ２和Ｓ３,建立双温度点复合ＰＣＲ扩增系统并用于临床血样的检测。结果：从间日疟原虫和恶性疟原虫感染血样中分别扩增出７０５ｂｐ和５７５ｂｐ特定扩增带,而食蟹猴疟原虫、诺氏疟原虫及健康人血样均未见扩增带。检测原虫水平达２－１０虫／μｌ全血。限制性内切酶酶切分析证实扩增产物为目的片段。检测１０４份镜检确诊疟疾患者血样,其中８１份与镜检结果相符,并查出镜检未发现的１７份混合感染和２份虫种鉴别失误的恶性疟。结论：本系统敏感性高,特异性强,操作简便,可在一次扩增中同时检出间日疟和恶性疟两种原虫。     

标签引物-套式/多重PCR检测恶性疟原虫和间日疟原虫的研究

目的 建立简便、灵敏、低本底、可同时检测恶性疟原虫和间日疟原虫的套式/多重聚合酶链反应（PCR）系统。 方法 应用标签引物扩增技术、Primer Premier 5.0软件、美国生物信息中心(NCBI-BLAST)网络资源和矩阵试验法优化套式/多重PCR，检测疟疾患者滤纸血样并与镜检结果进行比较。 结果 新建立的标签引物套式/多重PCR，检测模拟现场滤纸血样的敏感性为恶性疟原虫1～2个虫/μl血，间日疟原虫5～10个虫/μl血。检测71份现场采集的镜检疟原虫阳性滤纸血样（恶性疟24份和间日疟47份）的结果与镜检结果的符合率分别为87.5%和100%。 结论 通过标签引物扩增技术优化的套式/多重PCR系统，适用于检测现场采集的滤纸血样，其检出低原虫血症的敏感性和鉴定虫种的准确性均优于镜检法，是很有潜力的疟疾诊断技术。     

PCR检测疟疾混合感染的现场应用研究

目的　评价PCR检测技术在间日疟与恶性疟混合感染区诊断疟疾的现场应用价值。　方法　采集海南省疟疾混合感染流行区 3 0 4份滤纸干血滴样本 ,根据红内期疟原虫SSUrRNA基因序列 ,设计合成 3条引物 ,采用PCR技术在同一反应体系中扩增出间日疟原虫和恶性疟原虫不同的DNA片段 ,检测现场所采样本中的间日疟原虫或恶性疟原虫DNA ;同时与镜检法进行比较。　结果　在 3 0 4份样本中 ,PCR法阳性 15份 ,其中间日疟 7份 ,恶性疟 8份 ;镜检法阳性11份 ,其中间日疟 6份 ,恶性疟 5份。镜检阳性的样本PCR均为阳性 ;镜检阴性而PCR阳性的 4份样本 ,其扩增产物经限制性酶切鉴定 ,证实为间日疟原虫或恶性疟原虫DNA。　结论　此PCR检测体系灵敏、特异 ,对诊断或鉴别诊断间日疟原虫和恶性疟原虫混合感染具有实用价值。     

逆转录聚合酶链反应检测和鉴定疟原虫的研究

在同一反应体系中建立能同时检测和鉴定恶性疟、间日疟及混合感染的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测方法,并用于现场采集血样检测。先以恶性疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸基因为靶片段,设计1对针对恶性疟原虫的特异性引物,建立RT-PCR检测恶性疟原虫方法,在此基础上,增加1条针对间日疟原虫的种特异性引物,使在同一反应体系中,能够同时扩增恶性疟原虫和间日疟原虫的特异片段。恶性疟原虫和间日疟原虫模板在同一反应体系中分别被扩增出预期大小为359bp和449bp特定扩增带,健康人血样和空白对照均未见扩增带。用建立的RT-PCR检测方法对现场采集128份血样进行检测,与镜检的阳性符合率为9609%,14份镜检为阴性的发热病人全血标本中2份RT-PCR检测为间日疟阳性。RT-PCR检测疟原虫方法具有敏感性高、特异性强的特点,对疟疾诊断、镜检质量控制和流行病学研究具有较大的实用价值。     

PCR检测Pf60.1基因诊断恶性疟实验方法研究

为探讨通过PCR技术检测Pf60.1基因来诊断恶性疟的可行性,采用PCR技术检测了4年前采集贮存的20例疑似疟疾病人的血样。阳性对照为恶性疟原虫FCC1／HN培养株;阴性对照为食蟹猴疟原虫、间日疟原虫及非疟区的正常供血员血样。结果为FCC1／HN株、12例镜检定为恶性疟和2例混合感染的血样扩增出长度为313bp～320bp的特定Pf60.1基因片段;而阴性对照均未产生DNA带型。此结果说明检测Pf60kD中的Pf60.1基因片段的方法稳定性好,特异性强和敏感性高,是恶性疟诊断的理想方法之一。     

套式/多重PCR诊断疟疾的敏感性、特异性和稳定性初探

目的 提高标签引物?鄄套式/多重PCR诊断疟疾的敏感性、特异性与稳定性。 方法 用滤纸法采集非疟疾发热病人血样30份及其他传染病（感冒， 流感， 伤寒， 肝炎等）患者血样20份；抽取恶性疟和间日疟各1例患者血4 m1，进行系列稀释制备不同疟原虫含量的感染血样；健康者血样作对照。用热裂解法制备DNA模板，用线粒体细胞色素氧化酶基因作为靶基因，应用相关软件和网络资源（Primer Premier 5.0, PUBMED, NCBI-BLAST和Mfold服务器）设计和优化标签引物?鄄套式/多重PCR，并用于检测所采集制备的各种血样。 结果 间日疟与恶性疟患者血系列稀释为含 1 000、100、10和1个虫/μl后经标签引物?鄄套式/多重PCR检测，恶性疟和间日疟患者各稀释含虫血样分别在611 bp和255 bp出现1条带，能检测到原虫密度均为1个虫/μl血；非疟疾发热病人血样30份及其他传染病患者血样均为阴性；健康者血样未出现扩增条带，每种血样反复测试3次以上均获得同样结果。 结论 经优化的标签引物-套式/多重PCR在疟疾诊断中具有较高的敏感性、特异性和稳定性。     

PCR检测Pf60.1基因诊断恶性疟实验方法研究

为探讨通过PCR检测Pf60.1基因来诊断恶性疟的可行性,采用PCR检测了4年前采集贮存的20例疑似疟疾病人的血样,阳性对照为生疟原虫FCC1／HN培养株;阴性对照为食蟹猴疟原虫、间日疟原虫及非疟区的正常供血员血样。结果为FCC1／HN株、12例镜检定为恶性疟和2例混合感染的血样扩增出长度为313bp-320bp的特定Pf60.1基因片段,而阴性对照均未产生DNA带型。此结果说明检测Pf60kD中的Pf60.1基因片的方法稳定性好,特异性强和敏感性高,是恶性疟诊断的理想方法之一。     

套式PCR扩增特定SSrRNA基因片段诊断间日疟及混合感染的研究

根据间日疟原虫（Ｐ．ｖ．）小亚单位核糖体核糖核酸（ＳＳｒＲＮＡ）基因序列，设计并合成两对特异引物，采用套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，扩增出一条长１２０个碱基对（ｂｐ）的间日疟原虫ＳＳｒＲＮＡ基因特定片段，并用于云南间日疟患者的血样检测。结果表明：该系统特异性强，除间日疟原虫外，恶性疟原虫（Ｐ．ｆ．）、三日疟原虫（Ｐ．ｍ．）及正常人血ＤＮＡ样本均无此扩增带出现。该系统检测原虫的敏感度为０．１个疟原虫／ｌμｌ血，大大高于常规镜检。在进行间日疟检测中，该系统与镜检的阳性符合率为１００％，更重要的是发现镜检漏诊的４例Ｐ．ｖ．和Ｐ．ｆ．的混合感染病例。鉴于该系统具有特异、敏感、稳定、简便的特点和鉴别疟原虫种类、判定混合感染等优点，故对疟疾的诊断、大规模流行病学研究及疫情监控具有应用价值     

两种检测方法在间日疟和卵形疟诊断中的应用分析

目的分析疟原虫镜检和巢式PCR检测间日疟和卵形疟效果。方法收集2012～2016年输入性间日疟和卵形疟病例血样,巢式PCR检测疟原虫ssRNA基因,并与显微镜检结果进行比对。结果显微镜检和巢式PCR检测71份血样,间日疟、卵形疟、混合感染分别占74.6%、25.4%、0%和63.4%、29.6%、7%,符合率为81.7%;亚洲23份血样,镜检与巢式PCR均为间日疟,符合率为100%,巢式PCR检测非洲血样48份,间日疟、卵形疟和混合感染分别占45.8%、43.8%和10.4%,镜检与巢式PCR符合率为72.9%;巢式PCR检测26份卵形疟,经典curtisi、变种wallikeri和混合感染分别占80.8%、11.5%和7.7%,检出变种wallikeri总数占卵形疟19.2%。结论巢式PCR检测疟原虫虫种鉴别优于传统镜检法,可提高疟疾病例诊断水平。     

聚合酶链反应技术与镜检法诊断间日疟的对比研究

目的　评价聚合酶链反应技术在间日疟诊断中的应用价值。　方法　根据红内期疟原虫 SSUr RNA编码基因序列 ,设计合成 1对引物 ,采用聚合酶链反应技术 ,扩增检测“四热”病人血样中间日疟原虫 DNA;同时作厚血膜镜检疟原虫。　结果　从间日疟患者血样中扩增出 341bp的 DNA片段 ,与预期的扩增片段大小相符 ,而正常人血样及空白对照无特异性条带 ;对于 2 34份“四热”病人血样 ,PCR法检出 16份阳性 ,阳性率为 6 .8% ;厚血膜镜检 13份阳性 ,阳性率为 5 .6 % ;两种方法相比差异无显著性 (P>0 .0 5 ) ;对于 3份 PCR阳性而镜检法阴性的血样 ,重新作 PCR,结果仍然为阳性。以镜检法为标准 ,PCR法的灵敏度为 10 0 % ,特异度为 98.6 %。　结论　PCR技术灵敏特异 ,可替代镜检法用于间日疟感染的临床及现场检测。     

罕见输入性卵形疟原虫wallikeri亚种的PCR鉴定和测序分析

目的应用PCR技术对与间日疟原虫形态相识的卵形疟原虫亚种wallikeri进行鉴定。方法采集1例镜检可疑间日疟输入性疟疾患者滤纸血,采用PCR扩增18核糖体小亚单位RNA（18Small Subunit ribosomal RNA,18S SurRNA）片段,并进行测序分析。结果采用5对引物（rFAL1、rFAL2,rVIV1、rVIV2,rMAL1、rMAL2,rOVA1、rOVA2,rOVA1v、rOVA2v）进行PCR扩增,其中rOVA1v、rOVA2v引物扩增阳性,PCR产物大小为760bp;测序分析该基因片段（GenBank accession number KJ786425）与GenBank数据库中Plasomdium ovale wallikeri克隆RSH10 18S rRNA基因部分序列（KF219561.1）及卵形疟ssrRNA基因（AJ001527.1）的序列一致性都为100%。结论卵形疟与间日疟原虫形态相似,可采用PCR技术确认。本例患者感染的疟原虫经PCR鉴定和测序分析确定为卵形疟原虫变形P.ovale wallikeri变形亚种。     

1例国内罕见的输入性卵形疟的实验室检测

目的对1例输入性疑似疟疾患者的血样进行实验室检测。方法制备疑似疟疾患者血样的血涂片,吉姆萨染色后进行疟原虫的镜检观察。利用实验室自行研制的疟原虫属特异性（通用型）和4种疟原虫种特异性的巢式PCR和实时荧光PCR检测方法,对该血样进行疟疾检测及分型。将PCR扩增片段进行序列测定,并与已知的卵形疟序列进行blast比对分析。结合血样的分子生物学检测结果,重新对镜检结果进行复核。结果血样初次镜检为疟疾阴性。使用疟原虫巢式PCR通用引物对血样的DNA进行PCR检测,扩增出了预期大小约240bp的条带;巢式PCR分型检测表明,血样仅扩增出预期大小约450bp的卵形疟条带,无对应大小的恶性疟、间日疟和三日疟扩增条带产生。疟原虫通用型和卵形疟特异性的荧光PCR检测结果均为典型的S形阳性曲线,卵形疟扩增片段的熔解温度为72.5℃。序列分析表明,扩增片段长度为434bp,blast比对发现去除引物后的393个碱基与GenBank DQ845247等卵形疟的SSU rRNA对应部分的基因序列同源性为100%。重新对血涂片进行镜检复核,结果在薄血膜中发现了卵形疟的环状滋养体,被寄生的红细胞为椭圆形,边缘呈伞矢状。结论使用巢式PCR、实时荧光PCR、序列分析和镜检等方法,证实该例输入性的疑似疟疾患者为卵形疟原虫感染。     

多重PCR种特异性检测恶性疟原虫和间日疟原虫方法的建立

目的建立恶性疟原虫和间日疟原虫种特异性检测的多蕈PCR方法,用于疟疾的检测和诊断.方法根据疟原虫18S核糖体小亚基ssRNA的基因序列设计合成8对11条引物,通过对恶性疟、间日疟患者及健康对照者血样的DNA进行扩增,选择出敏感性和特异性最佳的引物用于建立多重PCR方法,并用梯度变化的方法分别对引物浓度、复性温度、延伸温度和循环次数等反应参数进行比较分析,优化PCR反应条件.利用优化后的多重PCR埘采自云南和上海的139份疟疾患者血样和32份非疟疾患者血样进行检测,以镜检方法为金标准,分析多重PCR方法检测患者血样的敏感性和特异性.结果从8对11条引物中优选出2对共3条引物用于建立多重PCR.利用这3条引物进行多重PCR,一次反应即可完成对恶性疟原虫和间日疟原虫的种特异性鉴定.对疟疾和非疟疾患者血样检测结果显示,该方法检测患者血样的敏感性为97.8%,特异性为100%.结论多重PCR方法敏感、特异、可进行批量检测,适用于对人群的疟疾监测和疑似疟疾病例的诊断,并能鉴定恶性疟原虫和间日疟原虫虫种.     

复式PCR检测间日疟原虫和恶性疟原虫的现场应用

目的探讨复式PCR方法在疟疾诊断中的现场应用价值。方法根据疟原虫18 S rRNA基因序列,合成疟原虫属特异性上游引物和间日疟原虫、恶性疟原虫种特异性下游引物,优化PCR反应体系,建立在同一PCR反应体系中同时检测间日疟原虫、恶性疟原虫基因组特异性DNA片段的疟疾诊断方法,并评价其现场应用价值。结果间日疟原虫和恶性疟原虫基因组DNA经过复式PCR后,分别扩增出1 451 bp和833 bp的特异性条带,而伯氏疟原虫、食蟹猴疟原虫及健康人血样均无扩增带出现,用该反应体系可检出原虫血症为1.1×10-6和5.6×10-7的间日疟原虫和恶性疟原虫感染。与镜检法相比,复式PCR检测119份现场样本,112份与镜检结果相同,阳性率为54%,漏诊率为0.8%,误诊率为0,而镜检法依次分别为53%、1.7%和3.4%。结论复式PCR方法检测疟原虫具有简便、快速、特异、敏感等优点,在疑似病例的鉴别诊断和分子流行病学调查中具有良好的应用价值。     

套式/多重PCR方法应用于疟疾诊断与监测的初步评价

目的 与镜检法比较评价标签引物-套式/多重PCR（UT-PCR）在疟疾监测中的应用价值。 方法 在海南、云南省恶性疟和间日疟混合流行区和广西疟疾控制区的疟疾监测中,采集初诊为疟疾或疑似疟疾的发热患者的血片与滤纸血样400份,在双盲条件下比较镜检法与UT-PCR的初检结果,对结果不一致的血片再次镜检复查,同时对其滤纸血样重复PCR 2～3次;评估UT-PCR与镜检法的敏感性和特异性。 结果 400例发热患者血样中,镜检法初检检出疟原虫阳性234例,其中恶性疟125例,间日疟109例;UT-PCR检出疟原虫阳性235例,其中恶性疟124例,间日疟109例;恶性疟和间日疟混合感染2例。两法初检结果一致的血样占92.5%（370/400）,其中阴性154例,阳性216例（间日疟117例,恶性疟99例）。复查25份初检结果不一致的血样,包括镜检阴性PCR阳性11例,镜检阳性PCR阴性10例,镜检为恶性疟PCR为间日疟3例,镜检为间日疟而PCR为混合感染1例,其中15份与UT-PCR的初检结果一致,7份“假阳性”原因不明,仅3份为PCR的假阴性。根据复查结果评估PCR的敏感性为99.6%,特异性为98.8%。 结论 采用更敏感的UT?鄄PCR疟疾诊断方法有助于解决疟疾诊断与鉴别诊断中的疑难问题,提高疟疾监测的质量和效率。