重组结核抗原痘苗病毒Ankara株的构建及其免疫原性研究

目的 构建5种不同类型的表达结核杆菌特异抗原的重组痘苗病毒,并研究其特异免疫原性.方法 运用同源重组技术将含结核分泌抗原Ag85A和ESAT-6的基因片段插入痘苗病毒表达质粒p18中.重组质粒导入痘苗病毒Ankara(MVA)后构建重组痘苗病毒,经筛选和Western blot鉴定,得到5个种类的带有结核抗原基因的重组病毒.用构建的5种重组病毒免疫小鼠,MTT法检测免疫后小鼠脾淋巴细胞对特异结核抗原的增殖反应;ELISA检测小鼠脾淋巴细胞培养上清液中IFN-γ的含量;结核菌素纯蛋白衍化物(PPD)皮内试验以检测重组病毒引发的针对结核抗原的特异细胞免疫应答.结果 构建的5种蘑组病毒介导的细胞表达产物经Western blot鉴定确认相对分子质量与结核抗原一致.免疫小鼠两次后,5种重组病毒免疫组脾淋巴细胞体外与Ag85A-ESAT-6融合蛋白共培养后表现出明显的增殖活性(P<0.01),培养上清液中IFN-γ的浓度均较同组细胞经生理盐水刺激明显增高(P<0.05);与空痘苗病毒或生理盐水免疫后小鼠相比,5种重组MVA免疫组脾淋巴细胞与AgB5A.ESAT-6融合蛋白共培养后同样表现出明显的增殖活性(P<0.01),与Ag85A-ESAT-6融合蛋白共培养的细胞上清液中IFN-γ的浓度均升高(P<0.01).与空痘苗病毒或生理盐水免疫后小鼠相比,5种重组MVA免疫组小鼠对PPD都表现出显著的迟发型超敏反应应答(P<0.05).结论 成功构建了5种不同类型的表达结核杆菌抗原的重组痘苗病毒疫苗,其免疫小鼠后可激发针对结核杆菌抗原的特异性细胞免疫.     

结核杆菌免疫保护性抗原Ag85A的基因克隆与表达研究

目的结核病疫情再度增高给结核病的防治提出了新的挑战,由于卡介苗对结核病的预防效果极不稳定,发展新型结核病疫苗势在必行,本研究通过对结核杆菌免疫保护性抗原Ag85A进行克隆与表达研究,旨在为结核病新型疫苗研制提供新的靶点.方法根据结核杆菌H37Rv株免疫保护性抗原Ag85A的基因序列自行设计一对寡核苷酸引物,以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板通过PCR扩增获得具有完整开架读码框(ORF)的Ag85A抗原基因,并将其正向插入真核和原核穿梭表达型载体pBKCMV构建重组质粒,重组质粒转入大肠杆菌后IPTG诱导表达,并对其表达产物进行Western-blotting分析.结果①PCR扩增获得了具有完整开架读码框的Ag85A抗原基因;②构建了Ag85A抗原基因真核和原核穿梭表达型载体;③Ag85A抗原基因在大肠杆菌中实现了稳定表达.结论本研究成功地对结核杆菌免疫保护性抗原Ag85A进行了基因克隆与表达,为进一步研究其在结核病新型疫苗研制中的应用奠定了基础.     

恶性疟原虫保护性抗原复合基因-痘苗病毒重组活疫苗株在换人血猕猴模的抗攻击试验

目的 探讨恶性疟原虫保护性抗原复合基因－痘苗病毒重组活疫苗修选株在实验动物的抗疟原虫攻击能力,为下一步进入夜猴及人体试验奠定基础。方法 利用多次部分换人血猕猴模经静脉输血法进行了抗疟原虫红内期虫体的攻击试验。结果 在免疫后１个月攻虫,重组痘苗病毒免疫猴从第３天一直到第１２ｄ的采血检查中均未发现疟原虫;非重组痘苗病毒（对照病毒）免疫猴等３天后原虫感染率上升,第６天原虫感染率最高达到６．０％,而后原虫     

重组杆状病毒表达的EIAV Env蛋白与含有env基因重组痘苗病毒的联合免疫

目的：构建新型的马传染性贫血病毒(EIAV)的候选疫苗：方法：利用BAC—To—BAC杆状病毒表达系统，将中国马传贫驴白细胞弱毒疫苗(EIAV DLV)及其亲本株(EIAV LN)env基因导入到杆状病毒基因组中。转染昆虫细胞后，得到的重组病毒用SDS—PAGE和Western blot检测表达产物。以本实验室构建的含有EIAV env基因的重组痘苗病毒，单独或与重组杆状病毒表达的EIAV Env蛋白联合免疫小鼠。结果：构建的重组杆状病毒能正确表达全长Env蛋白。与单独免疫组相比，联合免疫组免疫应答显著增强，其中中和抗体的滴度提高5～9倍。结论：含有EIAV env基因的重组痘苗病毒与Env蛋白抗原联合免疫，能够诱导高滴度的中和抗体。     

基因重组Epstein—Barr病毒壳抗原gp125的免疫原性

天然的Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ病毒ｇｐ１２５蛋白有极强的免疫原性，是ＥＢＶ初次感染的主要免疫原，也是诊断ＥＢＶ既往感染和新近感染最有价值的抗原。文章在用重组痘苗病毒表达ｇｐ１２５的基础上，研究了表达产物的特异性，并用活的重组痘苗病毒免疫中国本兔，用表达产物免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，研究了其免疫原性和免疫抗体的特异性。结果显示：重组痘苗病毒在感染细胞内特异性地表达ｇｐ１２５，活病毒及表达产物能诱导动物产     

恶性疟原虫保护性抗原复合基因——痘苗病毒重组活疫苗株免疫猴血清对恶性疟原虫的体外抑制试验

用重组痘苗病毒、非重组对照痘苗病毒免疫猴血清及正常对照猴血清进行了恶性疟原虫的体外培养抑制试验。结果培养渡中加人重组痘苗病毒免疫猴血清后，疟原虫感染率逐渐下降，第4天后原虫感染率维持在较低水平(0．1％以下)，第12天后血片中没有原虫检出；加入非重组对照痘苗病毒免疫猴血清的培养瓶中疟原虫感染率的变化与正常对照猴血清无明显的差异，说明重组痘苗病毒免疫猴血清对体外培养的恶性疟原虫具有一定抑制作用。     

人禽流感病毒H5N1多价重组痘苗病毒(天坛株)疫苗在小鼠中的免疫原性研究

目的 研发高效广谱的人高致病性禽流感病毒H5N1实验疫苗.方法 首先构建了含H5N1(安徽株)结构基因[血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白M1与M2]的两个双顺反子(HAop/M2,NAop/M1)重组痘苗病毒(rTTV天坛株)疫苗,采用不同剂量(104 PFU或107PFU)或组合(疫苗单独或联合)方式于0、4周二次免疫BALB/c小鼠,初步比较分析抗原特异的体液(HA血凝抑制抗体、NA特异性抗体、中和抗体)与细胞免疫应答(IFN-γ ELISPOT)特点.结果 重组痘苗病毒疫苗可有效表达H5N1靶抗原;高剂量组的重组痘苗病毒疫苗可快速激发较强的针对各个抗原的抗体与针对血凝素与神经氨酸酶蛋白的细胞免疫应答,含血凝素蛋白的重组痘苗病毒疫苗亦可诱导明显的中和抗体;但各组重组痘苗病毒疫苗所激发的针对基质蛋白(M1,M2)的细胞免疫应答均较弱;两个双顺反子(HAop/M2,NAop/M1)重组痘苗病毒疫苗联合应用所激发的针对基质蛋白2(M2)的体液免疫应答明显强于单双顺反子(HAop/M2)疫苗单独应用.结论 本研究中制备的各组重组痘苗病毒疫苗可诱导多个抗原特异的体液与细胞免疫应答,该研究为新型H5N1疫苗的研发及免疫方案的优化奠定了基础.     

HIV-1CN54 DNA疫苗滴鼻免疫小鼠诱发系统和黏膜免疫应答

目的：探讨重组痘苗病毒rVVsyngp120或rVVmCN54gp120候选疫苗是否增强HIV-1CN54合成gp120基因(syngp120)DNA疫苗的免疫原性。方法：第0、7、14、21天用DNA疫苗滴鼻免疫小鼠,第28、35、42天再滴鼻接种rVVsyngp120或rVVmCN54gp120。体外测脾和肠系膜淋巴结(MLN)淋巴细胞增殖应答与CD8^ CTL应答。测血清和黏膜洗液特异的IgG和IgA,并测其是否中和实验室适应株HIV-1SF33。结果：单纯DNA免疫后,脾和MLN淋巴细胞在体外发生增殖应答和CTL应答,且测出血清特异的IgG和黏膜洗液特异的IgA。重组痘苗病毒末次免疫后第2周(第56天),发现rVVmCN54gp120增强MLN淋巴细胞增殖应答和CTL应答,脾CTL应答也增强。rVVsyngp120则增强MLN CTL应答。同时发现：2组重组痘苗病毒免疫的动物其血清中特异IgG抗体滴度均有所增高,但黏膜(粪便和阴道)洗液特异IgA抗体滴度却未增高,未测出血清特异IgA和黏膜洗液特异IgG。免疫血清可中和HIV-1SF33,而阴道洗液却不能。结论：单纯DNA疫苗滴鼻免疫可诱发较弱的系统和黏膜体液免疫与细胞免疫,但维持时间短。重组痘苗病毒主要增强局部黏膜的细胞免疫应答,且稍增强系统体液免疫应答,未增强黏膜的IgA应答。免疫血清有中和作用。     

去除痘苗病毒显性表位B8R对外源抗原免疫原性的增强

目的 去除B8R对外源抗原免疫原性的影响,为降低载体的免疫优势从而提高疫苗的有效性提供参考.方法 利用针对痘苗病毒的pSC11质粒,构建插入OVA的质粒pSC11-OVA,在CV-1细胞中与去除B8R的痘苗病毒重组,筛选纯化获得重组病毒.利用体外培养细胞,检测B8R缺失和外源抗原插入对病毒感染复制特性的影响;利用感染小鼠模型,检测重组病毒诱发的针对OVA的细胞免疫应答和免疫记忆效应;采用体征及神经行为学评分系统,检测重组病毒的毒力.结果 B8R缺失和OVA导入对痘苗病毒的生物学特性无明显影响;去除B8R后,外源性OVA成为显性表位,针对OVA的细胞免疫应答和免疫记忆效应明显增强;去除B8R还可显著降低痘苗病毒的毒力.结论 去除B8R可有效降低痘苗病毒的免疫优势效应,增加外源性抗原的免疫原性.去除痘苗病毒本身的显性表位,可为疫苗和基因治疗提供更为有效的载体.     

表达HPV-16结构蛋白的重组痘苗病毒疫苗免疫效果研究

目的研究表达HPV—16结构蛋白L1和12的重组痘苗病毒（rVVL1L2）的免疫效果。方法以重组痘苗病毒rVVL1L2免疫C57BIJ6小鼠，用酶联免疫（ELISA）和酶联免疫斑点（ELISPOT）方法检测重组痘苗病毒诱发小鼠产生的体液免疫和细胞免疫应答水平；利用C3肿瘤细胞在C57BIJ6小鼠中的成瘤模型，观察重组痘苗病毒在抗肿瘤移植实验和肿瘤生长抑制实验中对小鼠的免疫保护效果。结果重组痘苗病毒rVVL1L2免疫的小鼠，可以检测到针对L1和12特异的抗体、L1165-175肽特异性的、分泌IFN-的T细胞；同时可以观察到免疫后的C57BI/6小鼠，可以有效预防HPV．16相关肿瘤细胞（1．5×10^5C3细胞）的攻击；对已产生的肿瘤，可以延缓肿瘤细胞的生长速度。结论重组痘苗病毒rVVL1L2可以有效诱发小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答，为研究预防和治疗HPV-16感染的疫苗提供了实验资料。     

应用痘苗病毒载体表达的重组甲肝抗原特性的研究

目的 探讨以痘苗病毒载体表达的甲肝病毒培养合适的细胞系和重组病毒灭活以及甲肝病毒抗原保存条件.方法 将构建成功的表达甲肝抗原的重组痘苗病毒分别接种于K4、143、HEL、Hep-2和Vero等细胞,用ELISA测定重组甲肝抗原的表达产量和不同方法灭活重组病毒后的抗原活性.结果 在K4、143和HEL细胞表达重组甲肝抗原的产量略优于Hep-2和Vero细胞,重组病毒经β-丙内酯和甲醛灭活后,甲肝抗原活性不变,制备的重组甲肝抗原稳定性好.结论 痘苗病毒表达载体可以提高甲肝抗原表达效率,具有十分广阔的应用前景.     

应用痘苗病毒载体表达的重组甲肝抗原特性的研究

目的 探讨以痘苗病毒载体表达的甲肝病毒培养合适的细胞系和重组病毒灭活以及甲肝病毒抗原保存条件.方法 将构建成功的表达甲肝抗原的重组痘苗病毒分别接种于K4、143、HEL、Hep-2和Vero等细胞,用ELISA测定重组甲肝抗原的表达产量和不同方法灭活重组病毒后的抗原活性.结果 在K4、143和HEL细胞表达重组甲肝抗原的产量略优于Hep-2和Vero细胞,重组病毒经β-丙内酯和甲醛灭活后,甲肝抗原活性不变,制备的重组甲肝抗原稳定性好.结论 痘苗病毒表达载体可以提高甲肝抗原表达效率,具有十分广阔的应用前景.     

HIVpol基因修饰在不同载体系统中对免疫效果的影响

目的 了解pol基因修饰前后在不同载体系统中表达水平差异对免疫效果的影响,为确定HIV疫苗中能诱发较高水平细胞免疫的Pol靶抗原奠定实验基础.方法 将含有优化前后pol基因的HIV-1DNA( pVRC)疫苗和痘苗病毒载体(rVV)疫苗单独或联合免疫BALB/c小鼠,利用IFN -γ ELISPOT和ICS检测各组的细胞免疫效果,ELISA检测体液免疫水平,分别比较基因优化前后及在不同载体内的Pol诱发的免疫效果.结果 DNA疫苗中pol基因修饰后细胞免疫反应由112提高至258 (SFC/106SMNC),抗体滴度随免疫次数增加而提高,基因修饰后第二针的抗体水平由101.7提高至102.3,三针后则没有差别;而以痘苗病毒为载体的疫苗基因修饰前后细胞免疫反应( ～600SFC/106SMNC)和抗体水平(～102.2)均没有差异.两种疫苗联合免疫均可显著提高Pol在小鼠体内的免疫效果,基因修饰后细胞免疫反应由788提高至2500( SFC/106 SMNC),抗体水平则没有差别.结论 Pol基因修饰明显提高常规DNA疫苗免疫效果,并可进一步提高联合免疫效果,但对重组痘苗病毒疫苗单独免疫效果无明显影响.     

共表达HPV16型E6和E7突变基因重组痘苗病毒的构建及其抗肿瘤免疫效果的观察

目的：构建用于子宫颈癌治疗的HPV16型E6和E7重组痘苗病毒实验性疫苗株，并对其抗肿瘤免疫效果进行初步评价。方法：以痘苗病毒为载体、利用同源重组技术构建共表达HPV16 E6和E7基因的重组痘苗病毒。该病毒免疫C57BL／6小鼠后，检测其免疫原性和抗移植瘤生长情况。结果：PCR结果显示，重组病毒VmE6E7的TK基因内插入了分别由痘苗病毒早晚期启动子H6和7．5K表达的ME6和ME7－1基因。动物实验结果表明，rVmE6E7在C57BL／6小鼠体内可诱发E6和E7特异性抗体产生，被免疫小鼠能够抵抗HPV16 E6E7转化的同系肿瘤细胞的攻击。结论：获得1株用于宫颈癌治疗的HPV16型实验疫苗株，为进一步研制人用HPV16型疫苗株奠定了基础。     

SARS-CoV-2重组痘苗病毒疫苗rVTT△TK-RBD的构建、筛选及免疫原性研究

目的 构建重组痘苗病毒载体疫苗rVTT△TK-RBD,并评价其安全性和免疫原性。方法 参考严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)基因序列合成受体结合域(RBD)基因,并将其插入自主构建的重组质粒pSTKE的多克隆位点上,构建重组痘苗病毒穿梭载体pSTKE-RBD,并转染到预先感染天坛株痘苗病毒(VTT)的BHK-21细胞内,经多轮的荧光噬斑筛选成功获得重组痘苗病毒rVTT△TK-RBD;通过滴鼻方式免疫小鼠后,检测rVTT△TK-RBD对BALB/c小鼠体质量的影响;通过肌肉免疫小鼠后,分析rVTT△TK-RBD对BALB/c小鼠产生的特异性抗体和中和抗体的水平;通过流式细胞术检测rVTT△TK-RBD对BALB/c小鼠T细胞亚群的影响。结果 利用同源重组、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)筛选标记和多次荧光噬斑筛选,成功筛选获得了表达RBD的胸腺激酶(TK)基因缺失型重组痘苗病毒rVTT△TK-RBD,且PCR验证成功。BALB/c小鼠体内实验表明rVTT△TK-RBD具有较好的抗SARS-CoV-2的免疫原性且相比于亲本株VTT明显降低了对机体的毒性作用。结论 成功构建并...     

三种淋巴因子在重组痘苗病毒中的表达及其对重组病毒毒力和免疫效果影响的初步研究

研究了巨噬细胞游走抑制因子（ＭＩＦ）、白细胞介素６（ＩＬ－６）及白细胞介素２（ＩＬ－２）等三种淋巴因子分别在含有甲型肝炎病毒基因的重组痘苗病毒中表达后，对病毒毒力及免疫效果的影响。使用Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠和家兔进行免疫的初步结果显示，表达ＩＬ－６的重组痘苗病毒免疫后特异性抗体反应明显增强，痘苗病毒抗体及甲型肝炎病毒抗体阳转小鼠数量分别由对照的３／１０和１／１０提高到８／１０和７／１０，痘苗病毒和甲型肝炎病毒抗体滴度也明显升高。家兔初次免疫痘苗病毒后，抗体平均滴度比对照病毒组提高约６倍，并能促使甲型肝炎病毒抗体阳转。而ＩＬ－２和ＭＩＦ重组痘苗病毒免疫后，特异性抗体反应升高不明显。重组痘苗病毒毒力变化结果显示，兔皮内接种ＩＬ－２和ＭＩＦ均显示了一定的减毒能力，二者的重组痘苗病毒毒力均比单纯ＴＫ病毒下降接近１个对数，而表达ＩＬ－６的重组痘苗病毒的毒力与单纯ＴＫ病毒对照无差别。     

表达HPV18E7E6的重组痘苗病毒构建及免疫效果的初步研究

目的 构建表达HPV18E7E6融合蛋白的重组痘苗病毒,并对E7E6蛋白的免疫原性进行研究.方法 将去除了转化活性的HPV18E6、E7基因融合,插入痘苗病毒重组质粒,通过同源重组构建表达HPV18E7E6的重组痘苗病毒,观察其免疫效果.结果 构建了表达E7E6融合蛋白的重组痘苗病毒,PCR鉴定及测序表明融合基因序列与设计相符,正确插入到痘苗病毒TK区域;Western-Blot检测表明该重组病毒能表达HPV18E7E6融合蛋白.免疫后的小鼠可产生E6、E7特异性抗体,但ELISPOT没检测到E7肽库刺激小鼠脾细胞产生分泌IFN-丫的阳性反应.结论 构建了一株表达HPV18E7E6融合蛋白的重组痘苗病毒,可以有效诱发小鼠产生针对E6、E7的体液免疫,但不能诱发产生相应的细胞免疫,为进一步研究不同动物模型中HPV18E6E7的细胞免疫特点提供了实验基础.     

非复制重组痘苗病毒中白细胞介素6的表达及其对重组病毒免疫效果的影响

目的 研究白细胞介素6（IL－6）在非复制型痘苗病毒中的表达及其对重组痘苗病毒免疫效果的影响。方法 利用非复制型痘苗病毒表达载体pNEOCK11β75IL6和重组病毒RVJ123，通过两步重组构建能同时表达IL－6和乙型肝炎病毒（HBV）HBsAg的非复制型重组痘苗病毒PVJ123ΔCK11β75IL6。免疫动物并观察其免疫效果。结果 Southern blot证实痘苗病毒C、K片段间基因缺失的同时伴有IL－6基因的插入，IL－6和HBsAg可同时表达。鼻腔吸入分别免疫BALB／c小鼠和新西兰白兔，ELISAPOT实验证实免疫后两周小鼠肺淋巴细胞的抗－HBsAg IgA、IgG抗体分泌细胞（ASC）数比对照组（RVJ123ΔCK11β75）显著增加，并可在小鼠血液、肺浸出液以及新西兰白兔血液、肺浸出液、其他分泌液样品中检测到抗－HBsAg的特异性的IgA、IgG抗体。与对照组相比，IgA、IgG抗体阳转率及抗体滴度提高。结论 非复制型痘苗病毒载体中表达的IL－6可增强其诱导的免疫反应，为细胞因子IL－6作为有效的载体疫苗佐剂提供了实验基础。     

痘苗病毒A47L缺失对细胞免疫反应的影响

目的 以去除A47L表位的痘苗病毒为载体,导入外源基因OVA,研究去除A47L后对细胞免疫和免疫记忆效应的影响,以期通过去除痘苗病毒载体中对外源抗原的免疫性具有显著抑制作用的表位,提高疫苗的有效性.方法 将扩增的OVA基因导入pSC11穿梭质粒,在CV-1细胞中与去除A47L的痘苗病毒重组,通过多轮筛选纯化获得重组病毒...     

结核杆菌pcHSP65真核表达载体的构建及其DNA免疫实验

目的：构建以结核分枝杆菌热休克蛋白65kD基因为基础的核酸疫苗。方法：采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Rv株基因中，扩增出HSP65的编码基因，经限制性核酸内切酶消化后，插入真核表达载体pcDNA3.1(-)的相应酶切位点，并将此重组质粒免疫动物。结果：重组质粒的插入基因经序列测定证实为结核分枝杆菌HSP65。DNA免疫小鼠体内产生特异性抗体，能抵抗结核杆菌的感染。结论：以HSP65编码基因为基础的真核表达载体构建成功，并能引起特异性动物免疫反应，为进一步研究其在结核病防治的作用奠定了基础。