维生素D，维生素K，雌二醇和睾酮对结石模型大鼠肾骨桥蛋白表达的影响

目的 :探讨骨桥蛋白的表达和调控与尿石症的关系。方法 :分别用维生素D、维生素K、雌二醇和睾酮处理正常大鼠和结石模型大鼠 ,连续用药 7d ,免疫组化和Northernblot技术检测大鼠肾骨桥蛋白及其mRNA的表达 ,偏光显微镜观察大鼠肾晶体沉积情况 ,并测定尿晶体成分的含量。结果 :维生素K、雌二醇和睾酮均可上调骨桥蛋白及其mRNA的表达 ,减少大鼠肾草酸钙晶体的沉积。维生素D增加尿钙的排泄量 ,促进晶体沉积。结论 :维生素K、雌二醇和睾酮可上调肾骨桥蛋白的表达 ,抑制结石的形成 ,维生素D过量则可促进结石形成     

Regulation of osteopontin expression in a rat model of urolithiasis

目的　探讨骨桥蛋白 (OPN)的表达和调控与尿石症的关系。方法　分别用维生素D、维生素K、雌二醇和睾酮处理正常大鼠和结石模型大鼠 ,连续用药 7天 ,免疫组化和原位杂交技术检测大鼠肾脏OPN及其mRNA的表达 ,偏光显微镜观察鼠肾草酸钙晶体沉积情况 ,并测定尿晶体成分的浓度。结果　维生素K、雌二醇和睾酮均可上调OPN及其mRNA的表达 ,减少鼠肾草酸钙晶体的沉积。维生素D增加尿钙的排泄量 ,促进晶体在鼠肾的沉积。结论　结果提示 ,维生素K、雌二醇和睾酮可上调OPN的表达 ,抑制结石的形成 ,维生素D过量则可促进结石形成。     

雌、孕激素对去卵巢大鼠肝脏维生素D受体mRNA表达的影响

目的：探讨雌、孕激素对去卵巢大鼠维生素D受体mRNA的影响。方法：25只成年SD雌性大鼠，随机分为 Sham组（假手术组）、OVX组（单纯去卵巢组）、OVX＋E组（去卵巢＋补充 雌激素组）、OVX＋P组（去卵巢＋补充孕激素组）、OVX＋E＋P组（去卵巢＋补充雌、孕激素组），每组5只。喂养3个半月后处死，取肝脏检测1，2，5－二羟维生素D3受体mRNA结果:与去卵巢组比较 :(1)雌激素对去卵巢大鼠肝脏1,2,5-二羟维生素D3受体mRNA的表达有显著上调作用;(2)雌、孕激素联合用药组1，25－二羟维生素D3受体mRNA的表达介于单用雌激素和孕激素之间；（3）孕激素对去卵巢大鼠肝脏1，25－二羟维生素D3受体mRNA的表达无显著上调。结论：雌激素能促进去卵巢大鼠肝脏1，25－二羟维生素D3受体的表达。     

雌、孕激素对去卵巢大鼠肝脏维生素D受体mRNA表达的影响

目的探讨雌、孕激素对去卵巢大鼠维生素D受体mRNA的影响。方法25只成年SD雌性大鼠,随机分为Sham组(假手术组)、OVX组(单纯去卵巢组)、OVX+E组(去卵巢+补充雌激素组)、OVX+P组(去卵巢+补充孕激素组)OVX+E+P组(去卵巢+补充雌、孕激素组),每组5只。喂养3个半月后处死,取肝脏检测1,25-二羟维生素D3受体mRNA。结果与去卵巢组比较:(1)雌激素对去卵巢大鼠肝脏1, 25-二羟维生素D3受体mRNA的表达有显著上调作用;(2)雌、孕激素联合用药组1, 25-二羟维生素D3受体mRNA的表达介于单用雌激素和孕激素之间;(3)孕激素对去卵巢大鼠肝脏1,25-二羟维生素D3受体mRNA的表达无显著上调。结论雌激素能促进去卵巢大鼠肝脏1, 25-二羟维生素D3受体的表达。     

维生素D和维生素K对结石大鼠肾脏骨桥蛋白mRNA表达的影响

目的：进一步明确维生素Ｄ 和维生素Ｋ 与肾结石的关系。方法：健康成年雄性ＳＤ大鼠３６ 只随机分成６组,即对照组、单纯成石组、维生素Ｄ组、诱石剂＋ 维生素Ｄ 组、维生素Ｋ 组和诱石剂＋ 维生素Ｋ组,测定肾脏骨桥蛋白（ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ, ＯＰＮ） ｍＲＮＡ 的表达量和尿晶体成分的浓度。结果：维生素Ｄ 和维生素Ｋ 均可促进肾脏表达ＯＰＮ ｍＲＮＡ;维生素Ｄ可升高尿钙,维生素Ｋ则抑制尿草酸的分泌,诱石剂有降低尿镁和柠檬酸的作用。结论：维生素Ｄ过多可促进肾结石形成,而维生素Ｋ 有抑制结石形成的作用。     

泽泻有效部位对肾草酸钙结石模型大鼠肾组织骨桥蛋白表达的影响

目的研究泽泻有效部位对大鼠肾草酸钙结石形成和肾组织骨桥蛋白(OPN)表达的影响,探讨泽泻抑制尿结石形成的机制。方法采用现代植化和生物活性导向分离的方法分离、提取泽泻的有效部位。将30只大鼠随机分成3组对照组、模型组、泽泻组。以乙二醇和1α-羟基维生素D3ig制备大鼠肾草酸钙结石模型。检测各组大鼠血及尿生化、肾Ca2 水平、24h尿草酸分泌量和肾组织病理学改变,并采用免疫印迹(Western blotting)和半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别观察各组大鼠肾组织OPN蛋白及其mRNA的表达水平。结果ig泽泻有效部位(主要以四环三萜类化合物为主)大鼠的血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、肾Ca2 水平、24h尿Ca2 分泌量、肾组织草酸钙晶体的分布、OPN蛋白及其mRNA的表达水平均显著低于模型组(P<0.01)。结论泽泻有效部位能抑制大鼠肾组织OPN的表达,减少肾组织草酸钙结晶的沉积,从而能有效抑制大鼠肾草酸钙结石的形成。     

女贞子对去卵巢大鼠钙代谢及维生素D依赖型基因表达的影响

目的研究补肾中药女贞子对去卵巢大鼠钙代谢及维生素D依赖型基因表达的影响。方法大鼠去卵巢手术处理4周后,ig给药治疗14周。血清、尿液及粪便中钙水平采用比色法测定。RT-PCR技术分析小肠及肾脏基因表达。结果大鼠去卵巢后体内钙流失显著增加,表现在血钙下降,尿钙及粪钙排泄增加。女贞子可以有效防止尿钙及粪钙排泄增加,并恢复血钙水平。RT-PCR分析表明雌二醇和女贞子都可以抑制去卵巢引起的小肠维生素D受体(VDR)mRNA表达下降。女贞子对肾脏25-羟基维生素D 1-羟化酶(1-OH ase)及25-羟基维生素D 24-羟化酶(24-OH ase)mRNA无明显作用,但却可以提高肾脏钙结合蛋白-9k(C aBP-9k)及钙结合蛋白-28 k(C aBP-28k)的基因表达。结论女贞子能够改善雌激素缺乏所引起的钙失衡状态,主要是通过提高小肠对活性维生素D的敏感性及加强肾脏对钙的重吸收而发挥作用的。     

维生素D和维生素K对结石大鼠肾脏骨桥蛋白mRNA表达的影响

目的：进一步明确维生素Ｄ和维生素Ｋ与肾结石的关系。方法：健康成年雄性ＳＤ大鼠３６只随机分成６组,即对照组,单纯成石组,维生素Ｄ组,诱石剂＋维生素Ｄ组,维生素Ｋ和诱石剂＋维生素Ｋ组,测定肾脏骨桥蛋白（ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ,ＯＰＮ）ｍＲＮＡ的表达量和尿晶体成分的浓度,结果;维生素Ｄ和维生素Ｋ均可促进肾脏表达ＯＰＮｍＲＮＡ纱Ｄ可升高尿钙,维生素Ｋ则抑制尿草酸的分泌,诱石剂有降低尿镁和柠檬酸的作用。结论     

枸橼酸钾对大鼠肾草酸钙结石骨桥蛋白表达的影响

目的 探讨枸橼酸钾对大鼠肾草酸钙结石骨桥蛋白(osteopontn,OPN)表达的影响.方法 32只8周龄雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组、枸橼酸钾组、结石组(乙二醇和氯化氨)、结石+枸橼酸钾组,每组8只.采用乙二醇和氯化铵诱导大鼠肾草酸钙结石模型进行试验研究.连续给药4周后处死大鼠取肾组织,采用HE染色和免疫组化法检测各组肾结石形成及OPN表达情况.结果 结石+枸橼酸钾组大鼠肾结石形成比结石组明显减少(P<0.05);结石+枸橼酸钾组大鼠的OPN表达比结石组明显降低(P<0.05);枸橼酸钾组OPN表达与对照组相比无明显变化(P>0.05).结论 枸橼酸钾可能通过减少草酸钙结晶的形成而减轻对肾小管上皮细胞的损伤,降低肾OPN的表达.     

细胞凋亡在维生素K2抑制高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞钙化中的作用

目的探讨维生素K2对高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)钙化的影响及细胞凋亡在其中所起的作用。方法选取8~10周龄健康雄性SD大鼠6只,分别体外分离培养大鼠胸主动脉VSMCs,采用免疫细胞化学方法鉴定。将VSMCs采用随机数字表法分为正常对照组、高磷组、维生素K2组1(10μmol/L)、维生素K2组2(25μmol/L)及维生素K2组3(50μmol/L)。检测VSMCs钙含量、Axl mRNA和Bcl-2 mRNA表达、细胞凋亡率。结果5组大鼠VSMCs钙含量比较,差异有统计学意义(P<0.05)。高磷组、维生素K2组1、维生素K2组2、维生素K2组3均高于正常对照组(P<0.05);维生素K2组1、维生素K2组2、维生素K2组3均低于高磷组(P<0.05);维生素K2组2、维生素K2组3均低于维生素K2组1(P<0.05);维生素K2组3低于维生素K2组2(P<0.05)。5组大鼠VSMCs中Axl mRNA表达水平比较,差异有统计学意义(P<0.05)。高磷组、维生素K2组1 Axl mRNA表达水平低于正常对照组,维生素K2组3 Axl mRNA表达水平高于正常对照组,维生素K2组2、维生素K2组3 Axl mRNA表达水平高于高磷组(P<0.05)。5组大鼠VSMCs中Bcl-2 mRNA表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。5组大鼠细胞凋亡率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。高磷组、维生素K2组1细胞凋亡率高于正常对照组,维生素K2组1、维生素K2组2、维生素K2组3细胞凋亡率低于高磷组(P<0.05)。结论维生素K2能够抑制高磷诱导的大鼠VSMCs钙化,其机制可能是通过上调生长停滞特异基因6(Gas6)/Axl的表达而抑制了VSMCs的凋亡。     

活性维生素D3对糖尿病大鼠肾脏BMP-7及TGF-β1表达的影响

目的:探讨活性维生素D3对糖尿病大鼠肾脏骨形成蛋白-7(BMP-7)和转化生长因子-β1(TGF-β1)表达的影响。方法:30只雄性SD大鼠,按随机数字表法分3组:正常对照(NC)组,糖尿病模型(DM)组,活性维生素D3(DC)组(制备糖尿病模型后用骨化三醇灌胃),每组10只。12周后,检测大鼠24 h尿蛋白定量及血生化指标,采用PAS及Masson染色观察大鼠肾脏病理改变,免疫组化法检测肾组织中BMP-7及TGF-β1蛋白的表达,RT-PCR法检测肾组织中BMP-7、TGF-β1 mRNA的表达。结果:与NC组比较,DM组大鼠肾脏肥大指数、24 h尿蛋白定量、血肌酐、尿素氮、胱抑素C水平均明显升高(P<0.05);同时肾组织中TGF-β1 mRNA及蛋白表达水平也明显升高(P<0.05),而BMP-7 mRNA及蛋白表达水平明显下降(P<0.05)。与DM组比较,DC组肾组织中BMP-7 mRNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.05),余上述指标明显下降(P<0.05),病理改变明显减轻。结论:活性维生素D3可能通过上调BMP-7、下调TGF-β1的表达,发挥其肾脏保护作用。     

维生素在草酸钙结石形成过程中的作用

许多研究表明，某些维生素的缺乏或过量对草酸钙结石的形成起抑制或促进作用。维生素对草酸钙结石的影响主要是通过改变机体物质代谢，破坏尿中矿物质的平衡，使尿中致结石因素如草酸、尿酸、钙、磷等物质排出增多，而尿中抑制结石成分如柠檬酸、镁排出减少，引起晶体析出、沉积和结石形成。现将近年来国内有关维生素在草酸钙结石形成过程中的作用研究综述如下。     

1，25-二羟维生素 D3对白血病6T-CEM细胞株作用的体外研究

目的研究1,25-二羟维生素D3[1,25（OH）2 D3]对人白血病6T-CEM细胞株凋亡及维生素D受体（VDR）蛋白表达的影响。方法在体外用不同浓度的1,25（OH）2 D3作用于6T-CEM。末端脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记染色法（TUNEL）检测细胞晚期凋亡的变化,免疫细胞化学法检测VDR蛋白表达。结果不同浓度的1,25（OH）2 D3作用后可促进6T-CEM 细胞的凋亡,呈剂量和时间依赖性（P ＜0．05）。1,25（OH）2 D3作用前后6T-CEM细胞均表达VDR蛋白,药物作用后VDR蛋白表达上调。结论1,25（OH）2 D3在一定浓度范围内可诱导6T-CEM细胞凋亡,使VDR蛋白表达上调。     

维生素D补充对多囊卵巢综合征大鼠的保护作用

目的探讨维生素D(VitD)对多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠卵泡发育、性激素变化和胰岛素抵抗的影响。 方法40只雌性大鼠随机分为对照组、PCOS组、VitD组和VitD+PCOS组。干预后处死大鼠,取卵巢组织进行组织形态学检测;比较各组血清性激素和胰岛素抵抗水平。 结果与对照组比较,PCOS组不同发育阶段正常卵泡数量和活力减少,而闭锁卵泡数量增多;黄体生成素、睾酮、胰岛素、血糖、胰岛素抵抗均升高,卵泡刺激素、雌二醇和孕酮均降低(P＜0.05);与PCOS组比较,VitD+PCOS组上述变化趋势均明显改善(P＜0.05)。 结论VitD可能通过调节性激素及胰岛素敏感性,促进PCOS大鼠卵泡正常发育。     

间α胰蛋白酶抑制物在大鼠肾草酸钙结石模型中的表达

目的　研究间α胰蛋白酶抑制物(IαI) 在实验性肾草酸钙结石大鼠肾组织中的表达及意义。方法　采用乙二醇和氯化铵诱导形成大鼠肾草酸钙结石模型, 检测各组大鼠肾功能、肾组织Ca2 含量和草酸钙晶体沉积、尿生化,并用免疫组化和计算机图像分析技术观察IαI在肾组织的表达情况。结果　模型组大鼠的血清Cr、BUN、肾Ca2 含量、24 h尿Ca2 和草酸分泌量均明显高于正常组(P<0. 05)。正常肾组织IαI分布仅在近曲小管, 而在结石组肾组织的近曲小管、上皮细胞、皮髓质交界处等的表达显著增加。结论　高草酸尿和草酸钙结晶的沉积能使肾脏通过合成更多的IαI来抑制草酸钙晶体的形成。     

活性维生素D3对糖尿病大鼠肾脏TGF-β1和HGF表达的影响

目的:探讨活性维生素D3对糖尿病大鼠肾脏(Transforming growth factor-beta 1,TGF-β1)和肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)表达的影响.方法:雄性SD大鼠30只,按随机数字表法分为正常对照组(NC),糖尿病模型组(DM),活性维生素D3治疗组(DC),每组10只.12周后,观测肾组织形态学和肾功能变化,尿白蛋白排泄率等指标的变化,用免疫组化法检测肾脏TGF-β1表达水平的变化,RT-PCR法检测肾皮质TGF-β1mRNA、HGFmRNA表达水平的变化.结果:与NC组比较,第12周末DM组大鼠肾脏肥大指数(KW/BW)、平均肾小球体积(MGV)、系膜面积比(FMA)、尿白蛋白排泄率(UAER)、血肌酐(Scr)均明显升高(P＜0.05),肾组织TGF-1mRNA及蛋白表达水平也显著升高(P＜0.05),同时肾皮质HGFmRNA表达也有所增加(P＜0.05).DC组HGFmRNA的表达水平较DM组显著升高(P＜0.05),而上述其他指标与DM组比较,则有明显的降低(P＜0.05).结论:活性维生素D3对于糖尿病肾脏病变至少具有部分保护作用,其机制可能为通过抑制糖尿病大鼠肾脏TGF-β1的过度表达,而上调HGF的表达,从而对糖尿病大鼠肾脏起保护作用.     

夏枯草提取物对肾草酸钙结石模型大鼠肾组织骨桥蛋白表达的影响

目的研究夏枯草50％甲醇提取物对大鼠肾组织骨桥蛋白（osteopontin，OPN）表达的影响。方法采用乙二醇和氯化铵诱导建立大鼠肾草酸钙结石模型，将24只Wistar大鼠随机分成3组：对照组（A）、结石组（B）、夏枯草组（C）。C组则通过灌胃方式予一定剂量的夏枯草50％甲醇提取物。饲养4周后，检测各组大鼠肾组织病理学改变和草酸钙结晶沉积情况。采用原位杂交RT—PCR观察各组大鼠肾组织中OPN mRNA表达，免疫组织化学和Westem blot检测各组大鼠肾组织OPN蛋白的表达水平。结果A组肾小管正常，B组肾小管腔可见大量成片草酸钙结晶存在，管腔明显扩张；C组肾小管腔可见少许散在草酸钙结晶存在，管腔轻度扩张。原位杂交显示A组大鼠肾组织中仅肾脏髓质小部分亨利氏袢中检测到OPN mRNA的表达，与此相反在B组和C组大鼠肾组织中则明显检测到OPN mRNA的表达，只是C组中OPN mRNA的表达强度相对弱于成石对照组。RT-PCR检测结果与原位杂交一致。免疫组化显示A组中仅能检测到OPN蛋白的微弱表达，B组大鼠肾组织中OPN表达则明显增强，C组大鼠肾组织中OPN表达强度低于B组。Western blotting检测显示A组轻度表达OPN，而B组则显著表达，C组表达强度低于B组。结论夏枯草50％甲醇提取物能有效抑制大鼠肾组织OPN的表达，减少肾组织草酸钙结晶的沉积，从而能有效抑制大鼠肾草酸钙结石的形成。     

维生素K对氟致睾丸功能损伤的作用研究

【立论依据】 长期摄入过量氟造成氟斑牙和氟骨症,同时男性生殖能力下降,甚至导致不育。维生素K在骨骼发育中有重要作用,促进血清中骨钙素(osteocalcin, OC)羧化,羧化骨钙素与羟基磷灰石结合能力增强,促进骨骼矿化,改善骨骼质量。BGP属于γ-羧基谷氨酸(γ-Carboxyglutamic acid, Gla)蛋白类,该蛋白为维生素K依赖型,睾丸组织含Gla蛋白。非羧化骨钙素(uncarboxylation Osteocalcin, ucOC)与睾丸内分泌功能密切相关,而维生素K可促进睾酮分泌。当氟骨症发生时,机体OC水平表现出明显变化,但ucOC水平变化尚无研究。 【设计思路】 以氟骨症动物模型入手,采用形态学、细胞生物学及分子生物学技术,研究维生素K通过OC与ucOC途径对氟致睾丸损伤可能作用途径与效果,为新疆高发地方病氟骨症发病机制积累实验数据与资料,探讨维生素K做为氟骨症治疗药物可能性。 【实验内容】 (1)复制饮用水氟骨症模型,Wistar大鼠自由饮用含氟化钠100 mg/L去离子水10周,以白垩状氟斑牙出现为建模成功标志,检测造模前后血中OC、ucOC浓度与睾丸形态功能变化。(2)观察不同类型维生素K对氟骨症大鼠骨骼及睾丸功能损伤不同作用效果。选用三种类型维生素K,维生素K1 10 mg/d/只皮下注射、维生素K3 10 mg/d/只皮下注射和维生素K4 4 mg/d/只灌胃,另设空白对照组与l,25-二羟维生素D组(0.10 μg/(kg·d)灌胃),给药20 d后检测大鼠骨骼与睾丸的形态学和功能学变化。(3)检测筛选出维生素K对氟骨症大鼠骨骼与睾丸中OC与ucOC表达的影响。给药方式与前同,给药前、后检测血清中OC与ucOC浓度、骨钙素N端各分子片段含量、骨与睾丸中两种OC及骨钙素N端各分子片段的蛋白与mRNA表达等。(4)数据采用SAS软件分析,组间比较用方差分析,计数资料用秩和检验Kruskal-Wallis法,相关性分析采用Pearson法。 【材料】 大鼠,氟化钠,三种维生素K,OC与ucOC检测试剂盒、抗体、引物,睾酮检测试剂盒等。 【可行性】 前期实验已完成,资料调研充分,指导教师有两项相关国家自然科学项目,实验平台具备条件。 【创新性】 (1)氟骨症骨相与非骨相损伤之间相互作用的研究思路。(2)氟骨症中维生素K与骨组织内分泌功能关系的研究角度。     

龟板提取物上调维生素D受体表达促骨髓间充质干细胞向成骨分化

目的 探讨龟板提取物诱导大鼠骨髓间充质干细胞 (mesenchymal stem cells, MSCs) 向成骨分化和对维生素D受体 (VDR) 表达的影响。方法 从大鼠骨髓中分离 MSCs,体外培养,利用流式细胞术检测 MSCs 表面抗原 CD44 细胞标志,体外培养 MSCs 分成不同的组观察其向成骨分化,在培养基中不加任何处理的作为对照组,培养基中加成骨诱导液诱导 MSCs 向成骨分化作为阳性对照组,龟板提取物组在培养基中加龟板提取物,诱导 7 d 后,通过免疫化学染色、Western blotting、原位杂交、RT-PCR 等方法观察龟板提取物对原代培养的 MSCs 向成骨分化的成骨分化标记分子碱性磷酸酶 (ALP)、骨桥蛋白 (OPN) 及 VDR 阳性表达及 VDR mRNA 的表达情况。结果 免疫组化染色显示,龟板提取物组成骨分化标记分子 ALP、OPN 和VDR 的阳性百分比明显高于对照组,Western blotting 结果也显示龟板提取物组的 ALP、OPN和 VDR 的蛋白表达水平高于对照组;同时原位杂交、RT-PCR 结果表明,龟板提取物诱导MSCs 向成骨分化过程可明显促进 VDR mRNA 的表达。结论 龟板提取物可促 MSCs 向成骨分化,其机制可能与 VDR 的上调有关。