人角膜基质细胞中cyclin-CDK-CKI网络成员的表达

目的：为进一步调控角膜基质细胞周期、抑制角膜基质细胞增殖提供基础和靶点,检测原位人角膜基质细胞和体外培养的人角膜基质细胞是否表达细胞周期蛋白（cyclin）－细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin dependent kinase,CDK)－细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（cyclin dependent kinase inhibitor,CKI)网络成员。方法：制作人角膜冰冻切片,并体外培养人角膜基质细胞,分别用免疫组织化学和免疫细胞化学的方法检测其中cyclinD、E,cdk2、4,p21WAF1的表达。结果：体外培养的人角膜基质细胞中有cyclinD、E,cdk2、4,p21WAF1蛋白水平的阳性表达,而原位人角膜基质细胞中无阳性表达。结论：体外培养的人角膜基质细胞有别于静止状态的角膜基质细胞,与在体激活的角膜基质细胞相似,cyclin-CDK-CKI成员在其中有阳性表达的结果,为进一步通过人为下调cyclin/CDK水平、上调CKI水平以抑制基质细胞增殖奠定了基础。     

转化生长因子β诱导基因在人角膜组织及细胞中的表达

背景 临床研究表明多数角膜营养不良的发病与转化生长因子β诱导(TGFBI)基因突变有关,但其发病的分子机制尚不完全清楚. 目的 研究TGFBI基因在人角膜组织及体外培养的角膜上皮细胞和基质细胞中的表达,为进一步研究角膜营养不良的发病机制奠定基础. 方法 对人角膜上皮细胞和基质细胞进行培养和传代,应用逆转录聚合酶链反应( RT-PCR)法检测TGFBI mRNA在人角膜组织及细胞中的表达,将供体角膜组织制成石蜡包埋切片,利用免疫组织化学法检测TGFBI蛋白在角膜组织、人角膜上皮细胞和角膜基质细胞中的表达,采用免疫荧光技术检测TGFBI蛋白在细胞爬片的表达. 结果 RT-PCR检测显示人角膜组织和基质细胞中在1274 bp处可见TGFBI mRNA的清晰条带,而角膜上皮细胞中亦有TGFBImRNA表达.免疫组织化学检测显示,TGFBI蛋白在人角膜组织中基质细胞的细胞质中呈阳性表达,但人角膜上皮细胞中未见TGFBI蛋白表达.免疫荧光检测技术显示,人角膜基质细胞胞质中TGFBI蛋白呈红色荧光,而角膜上皮细胞未见TGFBI蛋白表达. 结论 TGFBI主要在人角膜基质层表达,而在上皮层几乎不表达,有助于进一步研究TGFBI在角膜营养不良发病机制中的作用.     

水通道蛋白1在人角膜内皮细胞的表达

目的 研究水通道蛋白1(water channel protein1,AQP1)抗体在人角膜中的表达及水转运机制。方法 运用免疫组织化学法测定人角膜中AQP1的表达。结果 在角膜内皮细胞和基质细胞中有AQP1的表达，而角膜上皮细胞不表达AQP1。结论 本实验证实了AQP1在角膜内皮的表达，为角膜的水转运及角膜水肿机制的研究提供了分子生物学基础。     

人工角膜载体的体外构建及生物相容性研究

目的　应用壳聚糖（chitosan，CS）和蚕丝蛋白（silk fibroin，SF）构建组织工程角膜基质，探讨不同比例的CS和 SF共混膜的生物特性，为以后的角膜移植奠定基础。方法　将SF和CS按体积比3∶1和4∶1混合，体外构建具有相应器官特征的角膜基质层；体外培养原代兔角膜基质及上皮细胞，检测细胞分布情况和载体膜片的物理特性；免疫组织化学法测定细胞表型和分布情况,CCK-8试剂盒测定载体膜片毒性，电镜下观察细胞结构形态和附着情况，将构建的膜片植入兔板层角膜中检测组织生物相容性。结果　载体膜片的吸水率均在90%左右，明显强于天然角膜，抗拉力SF/CS 3∶1组为 0.90±0.02，SF/CS 4∶1组为 1.30±0.05，透光率均大于60%，且抗拉力和透光率随着CS含量增加而增强，但与天然角膜组织间仍存在差异。与载体膜片共培养的细胞在培养2周后，电镜下可见膜片上形成致密的细胞层，重构的板层角膜结构与天然角膜相似。CCK-8法检测结果显示，合成膜无明显毒性。免疫组织化学染色结果显示，培养出的基质细胞形态与天然角膜相似。动物板层移植术后，裂隙灯观察载体膜片组术后半个月内充血消失，无明显的前房炎症反应，术后1个月拆线时无明显新生血管。免疫组织化学法检测术后病理组织未发现CD4+、CD8+、CD31+T细胞浸润。结论　CS-SF可以用于组织工程角膜基质的构建，这为重建角膜基质提供了方向。     

腺病毒介导人内皮抑素感染视网膜色素上皮细胞的可行性研究

目的探讨以腺病毒为载体对体外培养的人视网膜色素上皮（human retinal pigment epithelial，hRPE）细胞进行人内皮抑素（human endostatin，hES）感染，获得高效表达hES转基因细胞的可行性。方法常规培养hRPE细胞，传代至第3～第5代后．应用携带有绿色荧光蛋白（green fluorescent protein．GFP）的hES重组腺病毒按感染复数30进行感染。培养24h后，在荧光显微镜下计数培养的hRPE细胞的GFP表达阳性率：用免疫组织化学法观察hES在已感染hRPE细胞中的表达情况；提取hRPE细胞总RNA，采用RT—PCR技术对产物行琼脂糖凝胶电泳：用Western blot法检测感染hRPE细胞培养上清液中hES的表达水平。结果hES重组腺病毒感染后，hRPE细胞形态正常，感染后24h，GFP即呈100％表达．弥漫整个胞质；免疫组织化学法观察可见，hRPE细胞浆内呈棕黄色的阳性反应．而在感染空载腺病毒的对照组中细胞胞浆无染色；RT—PCR反应可见，细胞裂解产物中有hES阳性条带：Western blot法检测结果表明，培养上清液中有hES蛋白的表达。结论hES重组腺病毒载体能有效感染体外培养的hRPE细胞．并稳定表达hES蛋白。     

膜型基质金属蛋白酶-1在圆锥角膜中表达的研究

本研究通过免疫组织化学法观察正常角膜、圆锥角膜及角膜白斑中膜型基质金属蛋白酶-1(memberane type-1 matrix metalloproteinases,MT1-MMP)的表达,探讨MT1-MMP在圆锥角膜发生发展中的作用.     

角膜基质细胞Toll样受体4对茄病镰刀菌炎性反应的实验研究

目的 检测茄病镰刀菌刺激小鼠角膜基质细胞后Toll样受体4(Toll like receptor 4,TLR4)的表达分布状况,探讨TLR4与炎性因子分泌的关系.方法 对小鼠角膜基质细胞进行原代培养和鉴定;制备茄病镰刀菌液;MTT法观察菌液刺激对角膜基质细胞生长作用的影响;免疫组化、RT-PCR测定刺激后不同时间点角膜基质细胞TLR4的表达;ELISA检测封闭TLR4对菌液诱导的角膜基质细胞分泌TNF-α、IL-8的影响.结果 采用消化法1～2 d培养出小鼠角膜基质细胞,抗波形蛋白免疫荧光染色阳性;菌液刺激48h后,MTT法显示刺激组较对照组OD值明显下降;正常角膜基质细胞TLR4在蛋白及mRNA水平呈弱表达,刺激6h可达到高峰,12h开始逐渐降低;菌液可上调角膜基质细胞TNF-α、IL-8的释放,刺激3h、6h、12 h的TNF-α、IL-8的浓度与TLR4 mRNA的表达呈明显的正相关(P＜0.05);预先封闭TLR4,可明显降低TNF-αt、IL-8的释放.各时间组间的差异有统计学意义(P＜0.05).结论 角膜可能通过TLR4识别真菌感染,TLR4在角膜对真菌的免疫炎性防御反应中起到重要作用.     

一种培养原代小鼠角膜基质细胞的新方法

目的改良小鼠角膜基质细胞分离培养方法 ,为角膜基质细胞生物学和角膜组织工程等研究提供更好的种子细胞。方法采用Dispase酶消化法联合组织块贴壁法分离、培养原代小鼠角膜基质细胞,倒置显微镜下观察细胞生长情况,通过间接免疫荧光化学染色Vimentin表型和RT-PCR检测Vimentin、Lumican和CK12基因表达对培养的细胞进行鉴别。结果倒置显微镜下可见小鼠角膜基质细胞呈三角形和树枝状,细胞间连接明显,可形成网状连接;免疫荧光化学鉴定小鼠角膜基质细胞表达Vimentin阳性;RT-PCR显示Vimentin和Lumican基因表达阳性,CK12表达阴性。结论 Dispase酶消化法联合组织块贴壁法培养可获得具有角膜基质细胞特性的细胞,本方法为体外获得单纯小鼠角膜基质细胞提供了简单高效的途径。     

同源盒基因Pax-6在鼠晶状体上皮细胞中的表达分析

目的 观察体外培养的小鼠晶状体上皮细胞(LEC)内同源盒基因Pax-6的表达,探讨维持晶状体上皮细胞特性的基因因素。方法 体外培养小鼠原代、传1代、传2代及传3代LEC,利用免疫组织化学法和免疫印迹法,检测细胞中Pax-6基因的蛋白表达情况,利用逆转录聚合酶链反应法检测细胞中Pax-6基因的mRNA表达情况。结果在原代、传1代及传2代培养的LEC中均可检测到Pax-6基因蛋白和mRNA的阳性表达,传3代培养的LEC中仅检测到Pax-6基因蛋白的微弱表达。阴性对照均未见,Pax-6基因的表达。结论 体外培养的小鼠LEC中具有Pax-6基因,该基因的正常表达是维持LEC特性的必要条件。     

培养的兔羊膜上皮细胞构建角膜表层移植片的研究

目的应用培养的兔羊膜上皮细胞（AECs）体外构建复层上皮细胞-角膜基质移植材料,探讨利用AECs重建角膜表层的可行性。方法取妊娠晚期新西兰大白兔（27～28孕周）的羊膜,制成AECs单细胞悬液,用含血清和表皮生长因子（EGF）的DMEM／F12培养液培养、传代,利用免疫组织化学单克隆抗体AE1／AE3、AE5检测培养的AECs中细胞角蛋白ck3／12的表达;将体外培养的2～3代兔AECs种植在新鲜兔角膜基质上,利用气-液界面培养法使之复层化,体外构建复层上皮细胞-角膜基质移植材料,进行光学显微镜和扫描电镜观察,并进行免疫组织化学测定。结果体外培养的兔AECs呈现单克隆抗体AE1／AE3、AE5表达阳性,AECs在新鲜兔角膜基质上能形成形态类似于正常角膜上皮细胞的3～5层复层结构,且复层化后的上皮细胞单克隆抗体AE5表达阳性。结论应用培养的AECs能成功构建类似角膜表层的复层上皮细胞-角膜基质移植材料,AECs可能成为重建角膜表层的一种新的细胞来源。     

圆锥角膜组织中EGF和bFGF变化免疫组织化学的研究

目的 观察正常人及圆锥角膜中表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)的表达，探讨EGF和hFGF在圆锥角膜中的变化。方法 采用免疫组织化学SABC法检测角膜组织中EGF、bFGF的表达，结果 在圆锥角膜上皮层、Bowman层和内皮层有EGF表达，EGF比正常角膜的表达强；在圆锥角膜的上皮层、实质层和内皮层可见bFGF的阳性表达，圆锥角膜的基质瘢痕区bFGF有较强的阳性表达。结论 圆锥角膜组织中EGF水平增高，促进上皮细胞和基质细胞的DNA合成，从而使组织愈合。bFGF表达增强可以促进角膜上皮、基质细胞和内皮细胞的增殖。     

异种角膜基质材料的制备和体外细胞种植的实验研究

目的研究异种角膜基质生物支架材料的制备方法和体外种植兔角膜基质细胞后细胞在材料上的生长、增殖情况。方法将York猪全层角膜用去垢剂联合0．25％胰蛋白酶、DNA-RNA酶祛除猪角膜基质细胞并冻干制备成支架材料；将兔角膜组织块用胶原酶消化后，用含10％血清的DMEM培养液体外培养，并做波形丝蛋白，角蛋白免疫组织化学染色检测；将培养的兔角膜基质细胞的2～3代接种在材料上，培养5d后，做HE染色、扫描电镜观察。结果猪角膜基质片经脱细胞处理后，细胞成分祛除干净并保留了角膜组织的三维网格状结构，网状间隙明显增大，利于细胞生长；体外培养的兔角膜基质细胞波形丝蛋白染色为阳性、角蛋白染色为阴性；HE染色、扫描电镜结果显示兔角膜基质细胞在支架材料上生长、增殖良好。结论异源性角膜经祛脱细胞处理而获得的生物支架材料利于异种细胞的黏附和增殖，可进一步用于组织工程角膜的研究。     

缺氧诱导因子1α在碱烧伤后兔角膜新生血管形成中的作用

目的 观察碱烧伤后兔角膜新生血管形成的不同时期缺氧诱导因子1α（HIF-1α）在角膜内的表达,探讨HIF-1α对角膜新生血管形成的影响.方法 实验研究.取30只健康家兔,采用随机数字表法分成5组,每组各6只兔,右眼采用1 mol/L氢氧化钠溶液建立角膜碱烧伤模型,左眼作为自身对照.分别于碱烧伤前和碱烧伤后1、3、5、7、14 d,在裂隙灯显微镜下观察家兔角膜新生血管增生情况,HE染色观察角膜组织病理学特征,并采用免疫组织化学法检验角膜组织中HIF-1α的表达,计算炎性细胞（多形核白细胞和淋巴细胞）和HIF-1α阳性细胞核数,对其结果行单因素方差分析及相关分析.结果 角膜碱烧伤后,HIF-1α主要表达在角膜基质中的炎性细胞、血管内皮细胞的细胞核中.随着时间的增加,炎性细胞表达增强,HIF-1α表达量也相应增加,并于碱烧伤后5 d达到高峰,以后逐渐减少.碱烧伤后1、3、5、7、14 d,角膜组织中炎性细胞和HIF-1α表达水平的差异均有统计学意义（F=422.086,437.555;P均＜0.05）,且HIF-1α的表达与新生血管的形成在时空上一致.经相关分析,角膜中炎性细胞和HIF-1α阳性细胞表达呈正相关（r=0.860,P＜0.05）.结论 碱烧伤后炎症反应能诱导HIF-1α的表达,而HIF-1α能促进角膜新生血管的形成.     

慢病毒介导EGFP基因修饰的人羊膜上皮细胞重建角膜表层的实验研究

背景研究发现人羊膜上皮细胞（AECs）具有干细胞的某些特性,已有学者用其进行眼表重建,其可能是角膜表层重建的一种新型种子细胞。目的探讨经慢病毒载体（pLenti6／V5一DEST）介导增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因修饰的人AECs作为组织工程化角膜表层一种新的细胞来源的应用价值。方法利用慢病毒载体携带标记基因EGFP转染人AECs,荧光显微镜下观察转染基因的瞬时表达,倒置显微镜下观察转染细胞的生长形态,用流式细胞仪检测转染细胞中EGFP的阳性表达率,然后应用EGFP基因修饰的人AECs构建复层上皮细胞一角膜基质移植材料。手术切除兔眼的全部角膜缘组织制备角膜缘干细胞缺损动物模型,随机分为2组,实验组兔眼移植EGFP基因修饰的人AECs构建的复层上皮细胞一角膜基质移植材料,对照组兔眼移植无上皮细胞的角膜基质移植材料,每天裂隙灯下观察2组兔眼角膜的混浊、结膜上皮化和新生血管化情况。1个月后处死动物摘除眼球,荧光显微镜下观察角膜植片中EGFP的表达,用免疫组织化学法检测其细胞角蛋白8（CK8）、CKl8和CKl2的表达,以鉴定移植细胞分化为角膜样的上皮细胞。结果大多数转染细胞筛选出的抗性克隆以及培养的克隆细胞与正常体外培养的人AECs形态相似,流式细胞仪检测显示瞬时转染48h的人AECs中EGFP阳性表达率最高,为61．50％,与12、24、96h转染组15．24％、38．27％、39．10％比较差异均有统计学意义（P〈0．05）,与72h转染组的58．36％比较差异无统计学意义（P〉0．05）。实验组10只兔眼中有6只眼角膜恢复透明,组织片在荧光显微镜下观察能发出绿色荧光,免疫组织化学结果显示CK8、CKl8、CKl2表达均为细胞质棕色染色,细胞核蓝染。对照组兔眼角膜均混浊、水肿,荧光显微镜下未见荧光,且部分角膜组织有CK8、CKl8表达,无CKl2表达。结论EGFP基因修饰的人AECs构建的复层上皮细胞一角膜基质移植材料能较好地重建角膜缘干细胞缺乏的兔眼角膜表层,可能是组织工程角膜表层一种新的细胞来源。慢病毒载体是一种安全有效的基因转移工具。     

人类β防御素在角膜组织中的表达

目的观察人类β防御素(humanβdefensins,HBD)在角膜组织中的分布,分析其在眼表疾病中的潜在作用。方法 选取正常供体眼角膜组织15眼,炎症性角膜组织15眼。炎症性样本包含病毒性角膜炎6眼、真菌性角膜炎4眼和细菌性角膜炎5眼。采用免疫组织化学法检测HBD-1和HBD-2,以及逆转录聚合酶链反应检测HBD-1、HBD-2、HBD-3在正常及炎症性角膜组织中的表达。结果 逆转录聚合酶链反应发现HBD-1和HBD-3在所有被检的16眼角膜组织中均显示阳性,HBD-2仅在7眼炎症性角膜被检组织中表达阳性,其余9眼样本均为阴性表达。炎症性角膜组织和正常角膜组织之间存在明显的表达差异(χ2=12.444,P=0.0014),免疫组织化学法也显示了相似的结果(χ2=7.143,P=0.029)。HBD-1表达于所有14眼角膜样本中,HBD-2则仅在6眼炎症性角膜和1眼正常角膜样本中显示阳性,其余7眼均显示阴性。结论 HBD-1和HBD-3表达于角膜组织。HBD-2在正常角膜组织几乎不表达,而是呈诱导式表达于炎性角膜。     

体外培养人角膜基质细胞β1整合素的表达

目的探讨β1整合素在角膜创伤愈合中的作用。方法采用免疫荧光细胞计数仪检测法。结果体外培养的人角膜基质细胞β1整合素表达的阳性率平均为95．7％，阴性表达率为4．3％。结论在角膜创伤愈合中，角膜基质细胞β1整合素的表达可能极高，从而促进角膜基质细胞与细胞外基质的粘附。     

人工角膜植入术后EGF和bFGF局部应用的实验研究

目的 在兔眼局部应用上皮生长因子(EGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，观察对人工角膜植入术后植床角膜的影响。方法 于PMMA襻状支架人工角膜植入兔眼后，结膜下注射EGF或bFGF，术后1月取植床角膜制作石蜡切片，应用免疫组织化学技术ABC法，检测植床角膜组织增生细胞核抗原(PCNA)的表达情况及细胞凋亡情况；并检测c—myc基因的表达情况。结果 bFGF组植床角膜基质细胞可见PCNA阳性表达；EGF组植床角膜上皮细胞及基质细胞均可见PCNA阳性表达；对照组未见PCNA表达；各组植床角膜基质及上皮细胞均可见c—myc基因表达，角膜内皮细胞未见表达；各组均未见阳性凋亡细胞。结论 EGF和bFGF对人工角膜植入兔眼后植床角膜组织细胞的增生过程有促进作用，对减少人工角膜植入术后并发症，提高成功率有积极意义。     

角膜上皮细胞Pax—6基因表达分析

目的检测体外培养角膜上皮细胞Pax-6基因的表达,探讨维持角膜缘干细胞特性的基因因素.方法地高辛标记cDNA探针进行DNA印迹杂交和蛋白质免疫印迹,检测培养的角膜上皮细胞中Pax-6基因表达状况.结果EcoRⅠ酶切角膜缘上皮细胞中9.1kbp的DNA片断与探针序列相同,其中原位和原代培养细胞、传第l代明显测出,角膜中央上皮细胞的原位和原代细胞中也能测出.Western     

视网膜母细胞瘤细胞株SO—RB50中生存素的表达

目的研究凋亡抑制因子生存素（survivin）在视网膜母细胞瘤细胞株SO-RB50中的表达。方法收集培养的SO-RB50细胞,通过RT—PCR、Western blot和免疫组织化学法检测SO-RB50细胞中survivin mRNA和蛋白的表达情况。免疫组织化学法检测survivin在正常视网膜组织中的表达。结果SO-RB50细胞中可检测到survivin mRNA和蛋白的表达,免疫组织化学检测显示survivin在SO-RB50细胞核和细胞浆中均有表达。正常视网膜组织中未见survivin表达。结论Survivin参与了视网膜母细胞瘤的发病。     

穿透性角膜移植术后慢性失功移植片的免疫学研究

目的检测穿透性角膜移植术后慢性失功移植片的免疫与非免疫相关细胞因子表达的变化,探讨免疫与非免疫因素在角膜植片慢性失功中的作用机制。设计临床实验研究。研究对象分为两组,角膜植片慢性失功（CCAD）组：穿透性角膜移植（PK）术后因CCAD导致移植失败的8例患者的角膜植片;正常对照组：由山东跟库提供的正常角膜供体3只。方法免疫组化法检测两组角膜片免疫相关细胞因子表达,结合患者的临床资料进行综合分析。主要指标角膜中CD4^＋、CD8^＋、F4／80、TGF-β、bFGF、α-SMA的表达。结果免疫组化检测显示正常对照组：角膜各层组织 、α-SMA、bFGF表达阴性,F4／80角膜基质偶见表达,TGF-β在角膜上皮层有表达。CCAD组：所有角膜植片全层均术见CD4^＋及CD8^＋T淋巴细胞浸润;5例失功植片基质层F4／80阳性表达,其余3例角膜植片全层表达阴性;所有角膜植片上皮层可见TGF-β阳性表达,基质层内可见TGF-β表达。所有失功角膜片基质层bFGF表达呈弱阳性;所有患者角膜基质内α-SMA表达阳性,后弹力层附近可见较强表达。结论穿透性角膜移植术后慢性失功移植片免疫组化检查未发现支持临床急性免疫排斥反应的证据,抗原递呈细胞及非免疫特异相关细胞因子的异常表达提示免疫与非免疫因素参与了CCAD的发生和发展。