人hsp90β基因的诱导表达与染色质活化的关系

目的 研究人ｈｓｐ９０β基因的热诱导表达与染色质活化的关系。方法 采用有机汞亲和层析柱分离热诱导前后Ｊｕｒｋａｔ细胞内的活性和非活性染色质。然后采用狭缝杂交技术比较热诱地前后人ｈｓｐ９０β基因在活性和非活性染色质中的分布,并用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交的方法研究热休克诱导下的ｈｓｐ９０βｍＲＮＡ表达。结果 发现热休克诱导使细胞内人ｈｓｐ９０β基因在活性染色质中的含量明显增加,并与内源性的ｈｓｐ９０β     

入hsp90p基因的热诱导表达与染色质活化的关系

目的研究人hsp90β基因的热诱导表达与染色质活化的关系.方法采用有机汞亲和层析柱分离热诱导前后Jurkat细胞内的活性和非活性染色质,然后采用狭缝杂交技术比较热诱导前后人hsp90β基因在活性和非活性染色质中的分布,并用Northern印迹杂交的方法研究热休克诱导下的hsp90β mRNA表达.结果发现热休克诱导使细胞内人hsp90β基因在活性染色质中的含量明显增加,并与内源性的hsp90βmRNA表达水平一致.结论首次证实人hsp90β基因的热诱导表达在染色质水平受“基因开关”的调控,为研究人类细胞热应激机制提供了新的模型.     

热休克前后人hsp90β基因DNaseI高敏感位点的研究

１材料与方法１１材料限制性内切酶ＳａｃＩ、脱氧核糖核酸酶Ⅰ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅⅠ，ＤＮａｓｅⅠ）为德国ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ公司产品；Ｊｕｒｋａｔ细胞株、人ｈｓｐ９０β基因组ＤＮＡ１１０２ｂｐ／１７３ｂｐ片段由本...     

p53反式结合hsp90β基因

目的 探讨hsp90β基因中p53结合位点（＋31／＋60）是否参与p53与hsp90β基因的反式结合,以进一步揭示该位点在p53调节hsp90β基因转录中的作用。方法 将含有p53结合位点的hsp90β基因片段插入质粒pBS-SK,然后将综与突变引物和选择引物一起依次退火和延伸,经过两 轮细菌转化,酶切筛选出突变阳性粒后进行序列分析。采用电泳迁移率变更测定（EMSA）检测突变后基因片段与转染p53表达质粒的Jurkat细胞核抽提物的结合。结果 序列分析证实p53结合。结论 hsp90β基因中p53结合位点的核心序列在p53与hsp90β基因的反式结合中关键作用。     

热激活Rac-MEKK-JNK信号通路与hsp90β基因表达

目的探讨Rac-MEKK-JNK(Rac-丝裂原活化的蛋白激酶的激酶的激酶-C-jun N端蛋白激酶)信号通路对热诱导hsp90β基因表达的调控作用以及Hsp90蛋白对Rac信号通路传递的调节过程.方法将载体PcDNA3、显性负突变Rac(DN-Rac),显性负突变MEKK(DN-MEKK)和显性负突变JNK(DN-JNK)表达质粒分别与hsp90β基因转录调控片段介导的氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因质粒β3.1共转染Jurkat和LETPa-2细胞,采用以竞争性RT-PCR为基础的系统检测CAT报告基因转录水平.用Western印迹分析检测转染了DN-Rac、DN-MEKK和DN-JNK的细胞在热刺激前后c-Jun的表达水平和磷酸化状态.用体外激酶活性分析法检测geldanamycin(GA)对热诱导的JNK活性的影响.结果转染DN-Rac、DN-MEKK及DN-JNK均能抑制42℃1 h诱导的β3.1报告基因的表达,Jurkat细胞中CAT的热诱导表达分别为对照组的(72.8±5)%、(60±13.2)%及(47.7±12.1)%;LETPa-2细胞中CAT的热诱导表达分别为对照组的(16.17±5.1)%、(50.2±8.7)%及(47.5±10)%.转录因子c-Jun的表达和磷酸化水平也在一定程度上被抑制.GA处理细胞可明显抑制热诱导激活的JNK激酶活性和c-Jun的磷酸化水平,但不影响JNK和c-Jun的蛋白表达水平.结论Rac-MEKK-JNK通路参与hsp90β基因的热诱导表达,hsp90可能对热激活化的Rac信号通路有调节作用.     

hsp90α基因在染色质模板上的热诱导转录

目的在体外将带有hsp90α基因启动子的报告基因质粒pBLCAT3α1组装为染色质模板,用于研究hsp90α基因的热诱导转录.方法采用竞争性RT-PCR定量检测基因启动子活性的方法,研究染色质模板的体外组装,并比较染色质模板与裸露DNA模板上基因的转录活性.结果优化了热休克处理的HeLa全细胞抽提物在基因转录活性研究中的实验条件:用体外重组表达的染色质组装相关因子与核心组蛋白在体外与hsp90α基因启动子质粒组装成染色质;证明染色质模板的hsp90α基因体外转录水平低于裸露DNA模板,而其热诱导效率显著高于对照组.结论在体外组装的染色质模板具有阻遏hsp90α基因转录的活性,但明显提高了该基因的热诱导表达效率.     

染色质结构与基因活化

核小体是染色质的基本单位。核小体对真核基因转录的阻扼现象是在特定细胞中基因组选择表达特异基因的最重要因素之一。染色质去阻扼后出现的开放构象能促进基因转录。本文讨论梁色质动态调整的本质、组蛋白乙酰基转移酶和云乙酰基酶的作用、以及通过甲基化ＣｐＧ结合蛋白而产生对染色质结构影响的机制等。染色质的顺式元件能参与确定染色体不同节段的功能,它将为生物信息学以及为基因组学与蛋白质组学之间的连接提供不可缺少的重要     

缺氧诱导乳鼠心肌细胞hsp90a表达及变化

目的探讨缺氧后乳鼠心肌细胞中热休克蛋白90a(hsp90a)表达及变化规律,探讨hsp90a在缺氧心肌细胞中发挥的保护作用。方法采用建立的心肌细胞缺氧模型,蛋白免疫印迹法测定hsp90a蛋白表达变化水平,免疫组化法显示心肌细胞中hsp90a表达的定位。结果缺氧后乳鼠心肌细胞中hsp90a的表达明显升高且呈现出一定规律性。结论缺氧可以诱导心肌细胞中hsp90a的表达增加,其主要分布于心肌细胞浆内,作为一个重要的调控分子参与早期缺氧心肌细胞的保护机制。     

STAT1对hsp90α基因表达的负调控作用

目的探讨转录因子STAT1对hsp90α基因表达的调控作用.方法将STAT1表达质粒转染Jurkat细胞,利用竞争性RT-PCR定量检测其内源性hsp90α基因mRNA水平.共转染STAT1表达质粒和hsp90α基因上游调控区不同长度的片段驱动的氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告基因质粒,利用定量RT-PCR检测CAT报告基因转录水平.用Western印迹分析方法检测42℃1h热激前后Jurkat细胞中STAT1酪氨酸磷酸化状态,用电泳迁移率变更分析(EMSA)检测STAT1与hsp90α5′基因上游调控区中含有STAT1特异结合元件的双链寡核苷酸片段特异性结合程度.结果STAT1既可抑制Jurkat细胞hsp90α基因的表达,又能抑制hsp90α基因5′上游调控区驱动的CAT报告基因活性.热激以前Jurkat细胞中的STAT1701位酪氨酸已有一定程度的磷酸化,热激以后其磷酸化程度明显升高,而且STAT1与hsp90α基因5′上游调控区中的STAT1结合元件呈特异性结合.结论STAT1对hsp90α基因的表达具有负调控作用.     

人β珠蛋白基因的表达调控

细胞分化的机制及其调控是生物医学界的一个国际性重要研究课题.哺乳类红细胞的发生是多能干细胞或其祖细胞增生和沿着一定方向进行分化的过程,伴随着红细胞的终末分化,细胞按其固有的基因表达程序,顺序地表达诸多可检测的细胞蛋白质产物和出现类型特征,其中细胞如何按发育阶段启动不同珠蛋白基因表达和出现自然排核现象,一直是吸引着人们用作研究细胞分化和基因表达调控的理想模型.     

人β珠蛋白基因的表达调控

细胞分化的机制及其调控是生物医学界的一个国际性重要研究课题。哺乳类红细胞的发生是多能干细胞或其祖细胞增生和沿着一定方向进行分化的过程，伴随着红细胞的终要分化，细胞按基固有的基因表达程序，顺序地表达诸多可检测的细胞蛋白质产物和出现类型特征，其中细胞如何按发育阶段启劝不珠蛋白基因表达和出现自然排核现象，一直是吸引着人们用研究细胞分化和基因表达调控和理想模型。     

人热休克蛋白hsp90β基因的染色体定位

目的：研究ｈｓｐ９０β基因的染色体定位。方法：以３ＨｄＣＴＰ和３ＨｄＧＴＰ标记的ｈｓｐ９０β基因－１１０２／＋６８ｂｐ片段为探针，进行染色体原位杂交。结果：分析了２５７个杂交分裂相，１９６５个杂交银颗粒在各条染色体上的分布，发现５号染色体上有杂交银颗粒１８５个，占全部杂交银颗粒的９４１％（Ｐ＜００１）；在５ｑ１３５ｑ２２之间有杂交银颗粒８２个，占全部杂交银颗粒的４１７％，占５号染色体上杂交银颗粒的４４３％。结论：ｈｓｐ９０β定位于５ｑ１３５ｑ２２。由于使用了ｈｓｐ９０β基因上游片段作为探针，本文结果只反映活性基因的定位，可排除假基因的影响。     

BTB/POZ结构域蛋白GRP对热休克中hsp90α基因表达的增强作用

目的探讨人BTB/POZ结构域GAGA元件结合相关蛋白(GRP)在hsp90α基因表达中的作用.方法用正义或反义GRP真核表达质粒或空载体,分别与装有hsp90α基因启动子(-1756- 37)的pREP4 episomal vector质粒和对照质粒pMCAT共转染Jurkat细胞,提取总RNA,用竞争性半定量RT-PCR测定hsp90α-氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因相对启动子活性.结果热休克时,GRP明显促进pREP4 episomal vector质粒上hsp90α-CAT报告基因启动子活性.结论GRP可能通过参与染色质动态调整促进pREP4 episomal veetor质粒上hsp90α CAT的表达.     

BTB／POZ结构域蛋白GRP对热休克中hsp90a基因表达的增强作用

目的 探讨人BTB／POZ结构域GAGA元件结合相关蛋白(GRP)在hsp90a基因表达中的作用。方法 用正义或反义GRP真核表达质粒或空载体,分别与装有hsp90a基因启动子(-1756- 37)的pREP4 episomal vector质粒和对照质粒pMCAT共转染Jurkat细胞,提取总RNA,用竞争性半定量RT-PCR测定hsp90a-氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因相对启动子活性。结果 热休克时,GRP明显促进pREP4 episomal vector质粒上hsp90a-CAT报告基因启动子活性。结论 GRP可能通过参与染色质动态调整促进pREP4 episomal vector质粒上hsp90a CAT的表达。     

热休克蛋白90β基因上游片段的转录调控活性研究

以人工合成的一对寡核苷酸为引物和人外周血淋巴细胞γＧＥＭ－１１基因文库为模板，通过ＰＣＲ护增并克隆了人ＨＳＰ９０β基因上游－１１０２／＋６８ｂｐ片段。将该片段删虍后克隆在报告基因－－荧火虫荧光素酶基因５｀上游，转染Ｊｕｒｄａｔ细胞后测定不同刺激条件下细胞裂解液中的荧光酶活性并同时测定荧光酶ｍＲＮＡ水平。结果表明，ＨＳＰ９０β基因上游片段在正常生理状态下通过启动子介导较高水平的基础转录；热休克时该片     

HSP90α、HSP90β在人胃癌组织中的表达

目的 探讨HSP90α、HSP90β蛋白与mRNA在人胃癌组织中的表达及其与胃癌生物学行为的关系.方法 采用免疫组化SP法检测两者蛋白在胃癌组织及癌旁正常组织的表达.采用RT-PCR法检测两者的mRNA在胃癌组织及癌旁正常组织的表达.结果 HSP90α、HSP90β主要定位于细胞质,其阳性率分别为82.9％和80.0％ (P ＜0.01),与胃癌分化、浸润、分期、转移相关.HSP90α、HSP90β mRNA在胃癌中的表达明显高于癌旁正常组织(P＜0.01),并与胃癌的分化、分期、淋巴结的转移相关.结论 HSP90α、HSP90β蛋白在胃癌组织中的阳性表达以及其与胃癌生物学行为的关系提示HSP90α、HSP90β可能作为判断胃癌恶性程度的重要指标.HSP90α、HSP90β mRNA的高表达,且两者均与胃癌的发生、发展关系密切,可能与胃癌组织中的转录调控相关.     

人热休克蛋白90β基因沉默质粒的构建及转染效率的观察

目的:构建能表达小发夹RNA,从而特异、有效抑制人Hsp90βmRNA水平的质粒,比较该质粒对不同细胞株的转染效率。方法:合成3条对应于靶基因3个区域的64nt寡聚核苷酸,插入pSUPEREGFP1质粒,用DH5α细菌扩增,用酶切和测序法鉴定。以绿色荧光蛋白表达为标记,比较不同比例脂质体和质粒条件下,HepG2、HUVEC、HeK2933种细胞株的转染效率。结果:构建的pSuper-Hsp90β1、pSuper-Hsp90β2、pSuper-Hsp90β33个重组沉默质粒,插入片段碱基完全正确。在相同条件下,所构建的质粒对HeK293细胞转染效率最高,HepG2细胞最低。结论:利用pSUPER质粒可成功构建人Hsp90β基因沉默质粒,该质粒对细胞株的转染效率可因细胞的不同而有显著差异。     

HSP90β基因突变与糖皮质激素治疗敏感性的关系

目的:筛选肾病综合征患者热休克蛋白90β(heat shock protein 90, HSP90)基因突变,并分析该突变与糖皮质激素治疗敏感性的关系.方法:提取300例经糖皮质激素治疗的肾病综合征患者血液DNA,采用聚合酶链反应 (polymerase chain reaction)和自动荧光测序方法, 对HSP90基因intron 9, exon10, intron 10, exon11,3'非编码区域DNA 序列进行突变分析,结合临床资料探讨突变与糖皮质激素治疗敏感性的关系.结果:在肾病综合征患者中发现了2个HSP90β基因点突变,分别为intron 10的7489 C＞T和3'非编码区的7612 C＞T,其发生频率在糖皮质激素敏感和不敏感患者中分别为(2.44%,3.68%)和(2.44%,2.94%),两组患者的突变频率无统计学差异(P＞0.5).结论:在肾病综合征患者中发现9例7489 C＞T和8例7612 C＞T突变,在敏感和不敏感组的发生频率无显著差异,提示HSP90β表达量与GC治疗敏感性无显著相关.     

人β2m基因的克隆及表达

目的 克隆和表达HLA Ⅰ类分子轻链(β2m)基因，为人工制备HLA Ⅰ类分子提供基础。方法 利用逆转录PCR技术从Jeg-3细胞株中克隆β2m基因，与质粒pET22b( )重组，构建原核表达载体pET22b( )-β2m，转化宿主菌E．coli BL2l(DE3)，诱导β2m基因高效表达，并采用双抗体夹心ELISA法对表达产物进行抗原性和功能鉴定。结果 酶切和测序证实β2m基因克隆和载体构建成功，目的蛋白在宿主菌中高效表达于包涵体中；通过包涵体的分离和纯化获得初步纯化的β2m，所制备的β2m能够与特异性抗体结合，并能与HLA 0281类分子重链形成具有天然构象的HLA 0281类分子。结论 人β2m基因能够在原核宿主中高效表达，表达产物具有形成HLA Ⅰ类分子的功能。