哺乳动物MHC I类分子α链的信号肽预测及保守性分析

目的 主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex,MHC）由一紧密连锁、高度多态的基因座组成,在脊椎动物的移植排斥反应、免疫应答和免疫调控等方面发挥极其重要的作用。MHCⅠ类分子由α链和β微球蛋白以非共价键结合组成,其中α链直接参与抗原肽的呈递,显示极为丰富的多态性。本研究旨在分析哺乳动物MHCⅠ类分子α链的信号肽是否呈现出多态性,并明确其分子生物学特征。方法 利用NCBI网站收集人等8种哺乳动物编码MHCⅠ类分子α链的mRNA序列,采用信号肽在线预测软件SignalP 4.1和LipoP1.0分析α链信号肽存在的概率、长度及信号肽酶切位点;利用Mega4.1软件进行信号肽氨基酸序列比对,分析其保守性。结果 8种哺乳动物MHCⅠ类分子α链N端的前24个氨基酸均为其信号肽区,信号肽酶切位点全部属于信号肽酶Ⅰ型,且信号肽酶切位点的-3、 -1、1、2、3位置上的氨基酸非常保守,是信号肽酶识别的关键位点。氨基酸序列比对分析发现α链信号肽24个氨基酸中有13个位点的氨基酸相同,占信号肽氨基酸总数的54.17%。结论 8种哺乳动物MHCⅠ类分子α链的信号肽具有较强的保守性,这可能与信号肽指导蛋白质分选和蛋白质定位的功能相关。     

HLA-Ⅱ类基因与人类疾病相关性研究

DNA分型技术突飞猛进的发展,如多聚酶链反应(PCR)、限制性内切酶片断段长度多态性分析(RFLP)、寡核苷酸探针杂交分析(SSO)、序列特异性引物分析(SSP)、单链构象多态性分析(SSCP)等推动了HLA-Ⅱ类基因与人类疾病相关性研究。本文将对这方面的工作进行阐述。1 HLA-Ⅱ类分子的结构和功能HLA(human leukocyte alleles)即人类主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC),其基因簇位于第6号染色体短臂(6p21.3),全长(3.5～4)×103kb,占人类整个基因组的1/3 000,至少分为3个区域,即HLA I区、Ⅱ区及Ⅲ区。Ⅱ区包括HLA-DR、DQ、DP基因座,DN、DO假基因座,DM基因座以及LMP1、LMP2,TAP1、TAP2非MHC基因位点。 HLA-Ⅱ类分子主要存在于抗原呈递细胞(APC)如B细胞和巨噬细胞、树突状细胞。Ⅱ类基因复合物长约1,000kb,分为3个亚区,每个亚区含两类基因A和B。A基因编码α链.B基因编码β链,两者构成以非共价键连接的αβ二聚体,后者是表达于APC、B细胞和活化细胞表面的跨膜糖蛋白。这些分子把抗原呈递给T细胞受体,与正常的免疫应答密切相关。由于HLA-Ⅱ类分子分别由不同的MHC基因编码,因而具有多态性。     

BALB/c小鼠MHCⅠ类基因的克隆与逆转录病毒载体的构建

目的：构建BALB/c小鼠MHCⅠ类分子的逆转录病毒表达载体。研究：用RT－PCR从BALB/c小鼠脾细胞基因组中扩增BALB/c小鼠MHCⅠ类分子H－2Dd的编码基因，克隆于载体pGEM-T中。经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后，亚克隆于逆转录病毒载体pMSCV，构建pMSCV-H2Dd4重组逆转录病毒表达质粒，并进行酶切和序列测定鉴定。结果：用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定证实，H－2Dd基因正确插入载体pMSCV,H-2Dd的编码基因经序列测定证实，与文献报道完全一致，阅读框架与设计相符。结论：成功构建BALB/c小鼠MHCⅠ类分子编码基因的逆转录病毒载体，为进一步研究MHC分子在移植免疫中的作用奠定了基础。     

结核分枝杆菌rmlA基因的生物信息学分析

目的:分析结核分枝杆菌rmlA基因及其编码的蛋白质结构和特征,获得其生物学信息。方法:从GenBank中获取rmlA基因的核酸序列,应用DNAMAN、Geneious Pro等软件及生物信息学在线分析工具,预测rmlA基因及其编码的蛋白质基本理化特征、亚细胞定位、二级结构、抗原表位等;建立蛋白质三级空间结构模型;进行多序列同源比对并构建分子进化树。结果:rmlA基因编码α-D-葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶。其具有288个氨基酸残基,理论分子量为31 492.0Da。该蛋白无信号肽,位于细胞质,无明显跨膜结构,存在14个潜在抗原表位。二级结构以α螺旋为主,蛋白序列、结构保守,为分枝杆菌所特有。结论:rmlA基因及其编码的蛋白质可作为研发新型免疫诊断方法、结核疫苗、新药的理想侯选分子靶标。     

HLA-Ⅰ类分子与肿瘤逃逸

在肿瘤免疫应答过程中 ,MHC Ⅰ类分子限制的CD+8细胞毒性T淋巴细胞 (CTLs)在阻止肿瘤的发生、发展过程中起关键作用 ,肿瘤免疫应答刺激信号的产生主要涉及到MHC 抗原肽 TCR三原体结构的生成。其中 ,MHC Ⅰ类分子、LMP、TAP等抗原加工提呈相关分子的改变对肿瘤免疫应答第一信号的产生有直接影响。这些分子的减少或丢失可能反映了肿瘤细胞在MHC Ⅰ类分子向T细胞递呈免疫源性多肽这一作用而选择的一种逃避机制。因此 ,检测HLA、TAP等抗原在肿瘤细胞上的表达成为一个新指标 ,有助于制定肿瘤生物治疗策略。1　MHC Ⅰ类抗原的递呈…     

人重组血清白蛋白基因T载体和pET28a表达载体的构建及鉴定

目的构建重组人血清白蛋白(rHSA)表达基因的克隆载体及表达载体,为下一步的蛋白表达和构建rHSA融合基因打下基础。方法从人胎盘中提取总RNA,利用RT-PCR方法构建cDNA-mRNA杂交链,然后用人血清白蛋白表达基因的特异引物进行PCR,PCR产物回收后与T载体连接,经过转化、质粒酶切、测序等一系列手段对插入情况和序列是否正确进行鉴定。用另一组带有酶切位点的引物和pfu酶进行PCR,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切PCR回收片段及pET28a表达载体,二者经过连接、转化、质粒酶切、测序等手段重新鉴定序列是否正确。结果插入到T载体和pET28a载体中的序列为1 830 bp的带有24个氨基酸信号肽的基因片段,此序列和GenBank中公布的rHSA序列相一致,并显示在485、750、1 685等位点可能有等位基因多态性。结论从胎盘中提取mRNA后,利用RT-PCR构建的人血清白蛋白基因序列完全正确,为下一步的工作提供了基础。     

采用定位基因缺失突变技术在大肠杆菌中高效表达肿瘤坏死因子

肿瘤坏死因子α(TNFα)为157个氨基酸组成的细胞因子,在克隆的全长cDNA的5′端有480bp的非编码区,包括76个氨基酸信号肽编码区。作者采用寡核苷酸指导下的定仁基因缺失突变法,删除了这一非编码区及信号肽序列,并在成熟TNFα分子第一个氨基酸密码前插入TNFα全基因的Ncol-PstⅠ片段,插入     

人胸腺素α原cDNA序列多态性分析

目的:通过对人胸腺素α原(prothymosin-α,ProTα)cDNA测序来分析人胸腺素α原的序列多态性.方法:应用RT-PCR技术从健康人外周血及健康新生儿脐带血中扩增胸腺素α原cDNA,纯化后与克隆载体pMD18-T连接,进行克隆测序,并与标准序列比对,分析其多态性.结果:序列分析结果表明,克隆的ProTα基因的核苷酸序列并不一致.与已报道的胸腺素α原基因(NM-002823)进行比较,发现存在2种变异:Ⅰ类变异包括107位单核苷酸突变(A→G)、110～121位和191～205位的核苷酸片段缺失;Ⅱ类变异为306位单核苷酸(G)缺失,多见于年龄60～80岁者.结论:本研究中ProTα cDNA序列存在2种变异,但并未影响其N-端前28个氨基酸.     

核酸疫苗免疫机制研究新进展

核酸疫苗与传统疫苗相比具有不可比拟的优势,可诱导机体产生细胞免疫和体液免疫,其免疫保护作用主要通过MHCⅠ类分子途径、MHCⅡ类分子途径和B细胞途径等3种途径来实现.通过MHCⅠ类分子途径激活CD8+T细胞,产生特异的CTL效应细胞免疫;通过MHCⅡ类分子途径激活CD4+T细胞,分泌IL-2、INF-γ、TNF-β等细胞因子,辅助机体产生特异性体液免疫;通过B细胞途径刺激并活化B细胞,诱导B细胞增殖分化,产生大量特异性抗体,诱发体液免疫应答.     

树突状细胞在肿瘤免疫治疗中的应用

肿瘤的主动免疫治疗近年来一直是肿瘤治疗研究的热点。随着人们对免疫应答、T细胞活化机制认识的逐渐深入,抗原递呈细胞对肿瘤相关抗原(tumorassociatedantigenTAA)俘获、加工以及激活T细胞,从而启动抗肿瘤免疫反应越来越受到重视。树突状细胞(dendriticcellsDCs)起源于骨髓CD34 造血干细胞,是目前已知体内抗原递呈能力最强的抗原递呈细胞。它们特征性地高水平表达与抗原递呈有关的主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类和Ⅱ类分子,并高水平表达刺激分子CD80(B7 -1)、CD86(B7-2)、CD40、CD50等以及某些粘附分子,其本身也可以产生多种细胞因子如干扰素α(IFN -α)、白介素12(IL -12)、肿瘤坏死因子(TNF)等。DCs介导免疫反应的途径主要有:1.DC摄取、加工抗原,再转运至细胞内主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类和Ⅱ类分子富含区,形成MHC -肽复合体,在细胞表面表达并激活T细胞,CD8 细胞毒T细胞被MHC -Ⅰ类复合物分子激活,CD4 辅助T细胞被MHC -Ⅱ类复合物激活。2.DC可以自身分泌或诱导其他细胞分泌IL -12、白介素15(IL -15)等...     

可溶性单链MHC-肽四聚体的构建研究

目的:构建检测抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的单链MHC-肽四聚体.方法:通过在MHC重链基因中引入生物素化位点.并在轻链和重链基因中引入同一限制性酶切位点连接MHC轻链和重链构建可生物素化的单链MHC分子.结果:重组子以包涵体形式表达得到单链MHC分子.重折叠、生物素化、荧光标记后得到活性单链MHC-肽四聚体.结论:单链MHC分子操作简便,提高了四聚体构建效率.     

滇南小耳猪与云南野猪SLA-DQA基因的多态性比较

目的 分析滇南小耳猪与云南野猪（S.s.silvianus） SLA-DQA基因不同酶切位点的基因型多态性以及等位基因的多态性,检验这些酶切位点上的基因频率是否达到Hardy-Weinberg平衡.方法 采用EcoRⅠ和AluⅠ两种限制性内切酶对滇南小耳猪和云南野猪SLA-DQA第1和第2内含子部分序列以及完整的外显子2进行PCR-RFLP分析.结果 在EcoRⅠ与AluⅠ酶切位点上均得到3种基因型,在这两个酶切位点上版纳系有9种组合基因型,明光系有8种组合基因型,而野猪仅发现4种组合基因型.经x2适合性检验表明：滇南小耳猪SLA-DQA外显子2在EcoRⅠ与Alu Ⅰ酶切位点上均未达到Hardy-Weinberg平衡状态（P＜0.05）,但明光系和云南野猪在两酶切位点均达到了平衡状态（P＞0.05）.结论 滇南小耳猪SLA-DQA在EcoRⅠ与AluⅠ酶切位点均表现为中度多态,云南野猪在EcoRⅠ为中度多态,在Alu Ⅰ酶切位点则为低度多态;滇南小耳猪的HardyWeinberg不平衡主要来自版纳系小耳猪.     

ScFv及重组TNF-α双功能抗体融合蛋白的表达及其软件预测

目的:利用生物信息学网络资源分析融合蛋白的二级结构及其理化性质,以及探讨分泌型抗成骨肉瘤单链双功能抗体基因的表达.方法:采用PCR方法将人工合成的抗体分泌信号肽序列加在抗成骨肉瘤ScFv基因5'端,其3'与人的肿瘤坏死因子TNF-α基因连接构成分泌型单链双功能抗体ScFv-TNF-α基因,将该基因克隆至逆转录病毒表达载体PLxSN,重组质粒pL(ScFv-TNF-α)SN在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,用NIH3T3测定病毒滴度,将重组病毒感染人成骨肉瘤细胞命名为OSC/ScFv-TNF-α, 以PCR, RT-PCR以及Western Blot对ScFv-TNF-α基因修饰的OSC9901细胞进行鉴定. 在构建融合蛋白之后,运用DNA分析软件(DNAssist)和蛋白质分析软件(ANTHEPROT V5)分析融合蛋白的氨基酸序列、二级结构及其理化性质.结果:经酶切分析鉴定,成功地构建了融合基因表达载体pL(ScFv-TNF-α)SN,以及Western Blot分析证明ScFv-TNF-α基因融合蛋白的表达. 运用DNAssist核酸序列分析软件分析ScFv-TNF-αDNA序列翻译并获得了氨基酸序列,运用蛋白质分析软件(ANTHEPROT V5)分析融合蛋白的二级结构及其理化性质.结论:利用生物信息学网络资源进行分析预测融合蛋白的性质,为进一步探讨单链双功能抗体基因融合蛋白提供依据.     

中国恒河猴Mamu-B*1703/EGFP在K562和B16细胞中的表达及分布

目的分析恒河猴主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)Ⅰ类分子重链的亚细胞分布,建立适于体外研究恒河猴MHCⅠ类分子表达和抗原呈递功能的细胞系。方法将含Mamu-B*1703重链基因真核表达载体pEGFP-N1分别转染K562和B16细胞,细胞收集后以W6/32单克隆抗体或抗Mamu-B*1703抗血清及PE标记二抗染色,利用激光共聚焦显微镜和流式细胞术分析Mamu-B*1703复合体在细胞内和细胞表面的表达。结果在K562和B16细胞的细胞质内均可观察到与Mamu-B*1703重链基因融合表达的绿色荧光蛋白激发后的绿色荧光,即2种细胞均可表达外源Mamu-B*1703重链分子;但通过藻红蛋白标记的抗MHCⅠ类分子复合体抗体染色显示,Mamu-B*1703复合体仅表达于K562细胞表面,而不表达于B16细胞表面。结论Mamu-B*1703重链可与人K562细胞而不能与小鼠B16细胞内的βm轻链结合组装成复合体,表达于细胞表面,提示研究恒河猴的MHCⅠ分子表达应利用人类的细胞株。     

四川黑熊线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因的克隆及序列分析

目的 探讨四川黑熊线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因的特征.方法 根据已经报道的细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome c oxidase subunit Ⅰ, COXⅠ)基因设计引物、PCR扩增和直接测序,并用软件对四川黑熊及其他几个物种的COXⅠ基因序列及COXⅠ蛋白的氨基酸序列进行了分析.结果 四川黑熊COXⅠ基因长1605 bp,编码含514个氨基酸残基的前体蛋白.碱基的含量分别为:A: 26.9%, C: 23.1%, G: 18.3 %, T: 31.8 %.起始密码子为"ATG",终止密码子为"TAA".蛋白质等电点为6.29,分子质量为57.2×103.以四川黑熊和已报道的其他6种动物的COXⅠ基因序列为数据构建的分子系统发育树表明在所比较的其他3种熊类中,四川黑熊和美洲黑熊的亲缘关系最近;在牛,狗和大鼠中,四川黑熊与狗的亲缘关系最近.结论 四川黑熊COXⅠ基因的DNA序列和蛋白的氨基酸序列和其他动物的相应序列有很高相似性,表明COX基因在所比较的几个物种中具有高度保守性.     

西藏小型猪SLA-DQA基因外显子2的PCR-RFLP多态性分析

目的分析西藏小型猪SLA-DQA基因第2外显子不同酶切位点的基因型多态性以及等位基因的多态性,检验这些酶切位点上的基因频率是否达到Hardy-Weiberg平衡态。方法采用EcoRⅠ和AluⅠ两种限制性内切酶对西藏小型猪SLA-DQA目的基因的第1和第2内含子部分序列以及完整的外显子2进行PCR-RFLP分析。结果经EcoRⅠ酶切后,以纯合子BB基因型居多,BB、AB、AA基因型频率分布为45.000%、31.667%和23.333%,其中B为优势等位基因（60.833%）;经AluⅠ酶切后,MN基因型频率（50.000%）分别高于MM型（30.000%）和NN型（20.000%）,     

四川黑熊线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因的克隆及序列分析

目的探讨四川黑熊线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因的特征。方法根据已经报道的细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（cytochrome c oxidase subunitⅠ,COXⅠ）基因设计引物、PCR扩增和直接测序,并用软件对四川黑熊及其他几个物种的COXⅠ基因序列及COXⅠ蛋白的氨基酸序列进行了分析。结果四川黑熊COXⅠ基因长1605bp,编码含514个氨基酸残基的前体蛋白。碱基的含量分别为A26.9%,C23.1%,G18.3%,T31.8%。起始密码子为“ATG”,终止密码子为“TAA”。蛋白质等电点为6.29,分子质量为57.2×10^3。以四川黑熊和已报道的其他6种动物的COXⅠ基因序列为数据构建的分子系统发育树表明在所比较的其他3种熊类中,四川黑熊和美洲黑熊的亲缘关系最近；在牛,狗和大鼠中,四川黑熊与狗的亲缘关系最近。结论四川黑熊COXⅠ基因的DNA序列和蛋白的氨基酸序列和其他动物的相应序列有很高相似性,表明COX基因在所比较的几个物种中具有高度保守性。     

日本血吸虫成虫抗原基因的获取及生物信息学分析

目的 筛选新的日本血吸虫（Schistosoma japonicum,sj）候选抗原基因.方法 以Sj雄虫成虫DNA为模板,设计引物扩增并纯化特异性片段,构建pBS-T克隆载体,将其克隆入大肠杆菌DH5α菌株,筛选阳性克隆,初步进行菌落PCR鉴定后测序,与EBI数据库中的已知序列比对分析,并用蛋白质分析软件预测其结构与功能.结果 利用日本血吸虫cDNA序列设计并合成引物,以Sj雄虫DNA为模板,成功地扩增和克隆出一个目的基因.通过菌落PCR检验和测序,BLAST比对分析显示其与日本血吸虫22.6 kDa抗原分子具有很高同源性,氨基酸预测分析其具有潜在螺旋跨膜和酪氨酸激酶磷酸化位点.结论 成功克隆一个目的基因,通过氨基酸预测和功能分析,预测其在血吸虫病免疫防治领域具有一定的意义.