耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药性及相关基因研究

目的:研究铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药机制.方法:取69株临床分离的耐亚胺培南铜绿假单胞菌(Imipenem-re-sistant pseudomonas aeruginosa,IRPA),经K-B法检测耐药性;用PCR法对铜绿假单胞菌亚胺培南耐药相关的金属酶IMP、VIM基因和外膜蛋白 OprD2基因等3种主要耐药基因进行了枪测与分析;结果:69株IRPA均为多重耐药菌,对阿米卡星、头孢哌酮/舒巴坦、头孢吡肟敏感性较高;检出金属酶IMP和VIM型金属酶基因阳性的分别有2株(2/69,2.9%)和4株(4/69,5.8%),外膜蛋白通道OprD2基因检测为缺失的有46株(46/69,66.7%).结论:IRPA耐药情况严重.外膜蛋白通道OprD2基因缺失突变是本组铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的重要机制之一.     

耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药特征及产金属β-内酰胺酶基因型分析

目的研究耐亚胺培南铜绿假单胞菌对常用抗生素耐药性以及其产金属β-内酰胺酶(MBL)的基因型。方法收集2016-2017年东莞市人民医院以及东莞市东华医院2家医院的110株耐亚胺培南铜绿假单胞菌临床分离株,采用VITEK2系统分析临床菌株耐药性;采用组合纸片法对亚胺培南耐药菌株进行MBL表型检测,同时采用PCR法检测MBL相关基因(包括IMP型、VIM型、SPM型、SIM型、GIM型和NDM型);比较分析产与不产MBL的耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药谱差异。结果耐亚胺培南铜绿假单胞菌对阿米卡星的耐药率为10.00%,对妥布霉素、庆大霉素、头孢吡肟、哌拉西林/他唑巴坦的耐药率在17.27%～21.82%之间,对头孢他啶、环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率为26.36%～31.82%,对其余β-内酰胺类、氟喹诺酮类、四环素、磺胺类抗生素耐药严重(74.54%～100.00%)。110株耐亚胺培南铜绿单胞菌中筛选出18株(16.36%)MBL表型阳性的菌株,用PCR法也检测出18株MBL基因阳性的菌株(16.36%),其中9株检出是IMP-25(8.18%),8株检出是VIM-2(7.27%),4株检出是SIM-2(3.64%),有3株同时检出VIM-2和SIM-2,其他基因型均阴性。产MBL菌株对所有药物的耐药率高于非产MBL菌株。结论产金属β-内酰胺酶在铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药中发挥重要作用,酶基因型主要为IMP-25、VIM-2和SIM-2。     

铜绿假单胞菌耐亚胺培南临床株的耐药基因的研究

目的 分析耐亚胺培南铜绿假单胞菌临床株的耐药特征和耐药机制.方法 VITEK-compact微生物分析仪进行细菌鉴定和药物敏感试验; PCR法对铜绿假单胞菌亚胺培南耐药相关基因(IMP、VIM、GIM、OXA)和膜微孔蛋白基因oprD2进行检测.结果 66株耐亚胺培南铜绿假单胞菌对舒普深、特治星、阿米卡星的耐药率分别为38.5%、40.0%和44.6%,对头孢他啶、头孢吡肟和环丙沙星的耐药率分别为41.5%、43.1%和47.7%;66株耐亚胺培南铜绿假单胞菌中,IMP阳性11株(16.7%)、VIM 4株(6.0%),oprD2基因缺失5株(7.6%),其余耐药基因未检出.结论 铜绿假单胞菌多重耐药现象较为严重,其耐药机制主要与细菌产IMP型金属β-内酰胺酶以及膜微孔蛋白基因oprD2缺失有关.     

耐亚胺培南铜绿假单胞菌β-内酰胺酶研究

目的分析临床分离的27株耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药性及β-内酰胺酶的类型.方法采用K-B法测定美罗培南等15种抗菌药物对27株铜绿假单胞菌的体外抗菌活性;三维试验、2-巯基丙酸抑制试验、聚合酶链反应(PCR)分析β-内酰胺酶类型.结果阿米卡星敏感性最高为66.7%,其它依次为头孢哌酮/舒巴坦(55.6%)、头孢吡肟(51.9%),美罗培南敏感率为29.6%.三维试验结果表明,12株产碳青霉烯酶中金属酶2株;单产AmpC酶3株.2-巯基丙酸抑制试验筛选金属酶2株阳性,与三维试验结果相符.根据参考文献设计VIM-2特异性引物,PCR反应结果阳性,经克隆测序证实VIM-2型金属酶.结论我院铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药机制中很重要一部分原因是产碳青霉烯酶.     

耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药性及金属β-内酰胺酶基因的检测

目的初步分析铜绿假单胞菌的耐药机制。方法采用纸片扩散法（K-B法）进行药物敏感试验;用2-巯基丙酸（2-MPA）协同试验筛查金属酶;通过改良三维水解试验、聚合酶链反应（PCR）、基因测序等方法,分析本地区铜绿假单胞菌所产的碳青霉烯酶表型及基因类型。结果在20株铜绿假单胞菌中,其中9株（45%）为耐亚胺培南的铜绿假单胞菌;2-巯基丙酸协同试验9株结果为阳性;PCR产物电泳,IMP-1引物有5株菌阳性,IMP-2引物有3株菌阳性,VIM通用引物有4株菌阳性,VIM-2引物有2株菌阳性,OXA-23引物有2株菌阳性,OXA-24引物均为阴性;选取3株产IMP-2条带的菌株基因进行测序,结果为IMP-16金属β内酰胺酶基因。结论铜绿假单胞菌耐药机制复杂,存在多种类型的碳青霉烯酶的流行,在医院病区存在产碳青霉烯酶铜绿假单胞菌克隆株的流行。     

铜绿假单胞菌金属酶的检测及分析

目的了解耐碳青霉烯铜绿假单胞菌的金属酶基因携带情况和基因型,同时探讨金属酶筛选的简便方法。方法对来自广州医科大学附属第一医院临床分离的50株耐碳青霉烯铜绿假单胞菌,采用双纸片增效法进行金属酶表型检测、采用PCR法进行金属酶bla_(VIM)和bla_(IMP)基因检测,并对基因进行序列分析。结果亚胺培南、亚胺培南+乙二胺四乙酸(EDTA)双纸片增效法筛选出11株(22.0%)金属酶表型阳性株,经PCR法确证其中9株产金属酶;碳青霉烯耐药株金属酶基因的携带率为18.0%(9/50),其中IMP型占88.9%(8/9),VIM型占11.1%(1/9)。结论耐碳青霉烯铜绿假单胞菌金属酶携带率高,以IMP型为主;亚胺培南和亚胺培南+EDTA双纸片增效法是金属酶表型筛选简便易行的方法。     

耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药机制研究

目的了解安徽省细菌耐药性监测中心收集的铜绿假单胞菌对常用15种抗菌药物的耐药情况,指导临床合理用药。对临床分离的14株铜绿假单胞菌的耐亚胺培南机制进行研究。方法安徽省细菌耐药性监测中心收集2006年9月份34所医院住院和门诊患者的各种临床送检标本,无重复分离的铜绿假单胞菌共236株。按美国临床及实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standard Institute,CLSI)推荐标准,采用M-H琼脂倍比稀释法对野生菌进行15种抗菌药物的体外药物敏感试验。针对14株耐亚胺培南铜绿假单胞菌,用协同试验筛选产金属酶菌株;聚合酶链反应检测金属酶基因IMP-1、IMP-2、VIM-1、VIM-2、SPM及外膜蛋白OprD基因;氰氯苯腙检测主动外排情况及其对亚胺培南最低抑菌浓度(Minimuminhibitory concentration,MIC)的影响。结果临床分离的236株铜绿假单胞菌在痰及呼吸道分泌物分布率最高,有155株,占65.7%,提示铜绿假单胞菌主要是以引起呼吸道感染为主;在体外药敏试验中,敏感率最高的前5种药物分别为美罗培南(90.3%)、亚胺培南(88.6%)、哌拉西林/...     

耐亚胺培南铜绿假单胞菌CARB-3基因的发现

目的分析我院2005年1~12月临床样本中分离的34株耐亚胺培南铜绿假单胞菌CARB基因携带情况,并对CARB基因分型。方法应用BD phoenix 100全自动微生物分析仪鉴定临床分离的铜绿假单胞菌并筛选耐亚胺培南的铜绿假单胞菌。采用PCR方法筛查耐亚胺培南铜绿假单胞菌的CARB基因,用DNA测序法对阳性扩增产物进行分型。结果34株耐亚胺培南的铜绿假单胞菌中,有32.4%携带CARB基因,测得DNA序列进行BLASTn比对,基因型为CARB-3型。结论我院临床样本中分离的耐亚胺培南的铜绿假单胞菌携带CARB-3型基因,携带率较高,医务工作者应重视和加强耐亚胺培南的铜绿假单胞菌的防治和耐药监测。     

铜绿假单胞菌亚胺培南耐药相关基因的研究

目的：研究铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的遗传学机制。方法：建立检测铜绿假单胞菌编码IMP型金属酶基因和外膜蛋白OprD2基因的PCR法，探讨临床分离的16株纸片协同法产金属酶的铜绿假单胞菌中产金属酶和外膜蛋白OprD2的缺失与亚胺培南耐药的关系。结果：16株产金属酶铜绿假单胞菌IMP基因扩增7株呈阳性，9株阴性；OprD2基因扩增11株呈阴性，5株呈阳性；11株菌既产金属酶，又存在外膜蛋白OprD2基因突变。结论：产金属酶和外膜蛋白OprD2的缺失是铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的重要机制，并可同时并存。     

亚胺培南耐药铜绿假单胞菌整合酶基因研究

目的通过分析耐亚胺培南铜绿假单胞菌(PAE)整合子所携带的耐药基因,探讨其耐药机制,为临床用药、院内感染防控和新药研发提供参考。方法根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)2015年标准,应用纸片扩散法进行药敏试验,采用多重聚合酶链式反应对临床分离的48株亚胺培南耐药铜绿假单胞菌进行整合酶基因(int)检测。结果药敏试验示48株亚胺培南耐药铜绿假单胞菌均为广泛耐株。5株为Ⅰ类整合酶阳性;24株为Ⅱ类整合酶阳性;6株Ⅰ、Ⅱ类整合酶均为阳性;未检出Ⅲ类整合酶。结论亚胺培南耐药铜绿假单胞菌大多具备Ⅰ、Ⅱ类整合酶基因,这是泛耐株的重要耐药机制。     

鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类耐药性及耐药基因型分析

目的:了解南京地区鲍曼不动杆菌耐药特点及分析碳青霉烯酶、金属β-内酰胺酶基因型。方法:K-B法测定临床分离的73株鲍曼不动杆菌对亚胺培南、美洛培南的耐药性;PCR检测碳青霉烯酶(OXA)、金属β-内酰胺酶(IMP和VIM)耐药基因,并对OXA基因进行测序。结果:73株鲍曼不动杆菌对亚胺培南、美洛培南耐药率均为10.9%;8株耐药菌中3株是IMP型,2株是VIM型,4株是OXA型,其中有1株菌含有OXA及IMP两种基因型。4例OXA型标本经测序,在Genbank中进行同源性比对,均为OXA-23亚型。结论:目前南京地区鲍曼不动杆菌的耐药性与其携带OXA-23、IMP和VIM基因相关。     

铜绿假单胞菌亚胺培南异质性耐药的机制

目的: 探讨铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa）亚胺培南异质性耐药的机制。方法: 分别采用常规的KB法和MIC法检测310株铜绿假单胞菌对亚胺培南的敏感性,双纸片协同试验检测金属β 内酰胺酶,实时定量PCR实验检测外排泵基因MexAB和MexCD的表达水平,半定量结晶紫染色法检测生物膜的形成量,PCR扩增法检测细菌膜孔蛋白OPRD2基因是否缺失。结果： 在临床分离的310株铜绿假单胞菌中,检出244株亚胺培南敏感菌株和66株非敏感菌株,244株中有36株铜绿假单胞菌对亚胺培南具有异质性耐药,总体检出率为11.6%。36株异质性耐药铜绿假单胞菌均不产生金属β 内酰胺酶,但高表达MexAB外排泵,且生物膜的形成量也较高,其中6株检出膜孔蛋白OPRD２基因缺失。 结论： 临床存在部分异质性耐药的铜绿假单胞菌,它们通过形成生物膜、高表达多重耐药外排泵基因和基因缺失等机制介导耐药。     

新德里金属β-酰胺酶基因特征

目的:研究新德里金属β-酰胺酶(NDM-1)基因的特征,分析其可能的来源。方法:在美国生物信息中心(NCBI)检索NDM-1基因,使用Blast生物学软件对检索到的基因与GenBank进行比对。使用ClustalW2.0生物学软件,对5条NDM-1基因和30条各亚型β-内酰胺酶基因进行多序列比较。结果:在NCBI中检索到3条NDM-1基因,与GenBank比较后共发现9条基因序列与NDM-1基因同源性较高,其中2条为两株海洋细菌的部分基因序列(同源性达69%和70%)。选择5条NDM-1基因与30条β-内酰胺酶基因进行多序列比较,同源性均很低,在基因进化树上NDM-1基因与β-内酰胺酶基因位于不同分枝。结论:NDM-1基因并非来源于β-内酰胺酶基因,NDM-1基因可能与两株海洋细菌有一定的亲缘关系。     

Metallo beta-lactamase producing pseudomonas species--a major cause of concern among hospital associated urinary tract infection

Multidrug resistant pseudomonas strains are isolated in high frequency from urinary samples in hospitalised patients. With the occurrence of extended spectrum beta-lactamases (ESBLs) and metallo beta-lactamase (MBL)-producing Pseudomonas aeruginosa being increasingly reported worldwide, this study evaluated the resistance pattern of pseudomonad strains to carbapenam and other antipseudomonal antibiotics isolated from patients with hospital associated urinary tract infections along with clinical usefulness of various MBL screening methods (combined disc diffusion test, E-test and modified Hodge test). Presence of ESBL and AmpC beta-lactamases in the isolates was also determined. Of the 87 isolates, 81 (93.1%) were Pseudomonas aeruginosa, 4 (4.6%) were Pseudomonas putida, 2 (2.3%) were Burkholderia cepacia. Thirty-one isolates (35.6%) were resistant to imipenem and 61% of these 31 isolates, were MBL producers by combined disc diffusion test, while 48% were detected by E-test method. Overall, in 30% and 54% strains, production of AmpC and ESBL respectively was observed.     

铜绿假单胞菌耐药性分析及主要β-内酰胺酶基因检测

目的了解临床分离的铜绿假单胞菌对常用抗生素的耐药特征;调查β-内酰胺酶基因在多重耐药铜绿假单胞菌中的流行状况。方法收集广东省两家医院2012-2013年临床分离的铜绿假单胞菌,采用K-B纸片扩散法进行药敏试验,同时,设计合成β-内酰胺酶的引物序列进行PCR扩增和测序分析。结果 230株铜绿假单胞菌对11种抗生素的耐药率为亚胺培南32.17%,美罗培南34.78%,头孢他啶24.35%、头孢吡肟35.65%、庆大霉素51.30%、阿米卡星35.65%、环丙沙星32.17%、左旋氧氟沙星37.39%、氨曲南48.70%、哌拉西林35.65%、哌拉西林/三唑巴坦32.17%,多重耐药菌占34.78%(80/230);80株多重耐药铜绿假单胞菌中PER-1引物扩增阳性25株(31.25%),PSE-1阳性24株(30%),TEM-1阳性12株(15%),OXA-10阳性8株(10%),OXA-1阳性2株(2.5%),另各有2株分别扩出VIM-2和IMP-9基因型。结论铜绿假单胞菌的耐药情况严重,多重耐药铜绿假单胞菌中β-内酰胺酶基因型以PER-1、PSE-1、TEM-1和OXA-10为主。     

铜绿假单胞菌的耐药特征及oprD2基因的检测

目的了解铜绿假单胞菌临床分离菌株的耐药特征及外膜通道蛋白oprD2基因的缺失情况。方法琼脂稀释法检测最低抑菌浓度（MIC）,聚合酶链反应（PCR）检测oprD2基因。结果铜绿假单胞菌检出率最高的是ICU病房和呼吸科病房,分别占50.8%和23.1%;65株铜绿假单胞菌对13种抗生素耐药率最低的是头孢哌酮/舒巴坦（30.8%）,其次是亚胺培南（38.5%）、美罗培南（40.0%）和阿米卡星（46.2%）;在25株耐亚胺培南铜绿假单胞菌（IRPA）中,有19株oprD2基因缺失,缺失率为76.0%。结论铜绿假单胞菌耐药性严重;外膜通道蛋白oprD2缺失可能是铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的重要原因之一。     

不动杆菌属多重耐药及泛耐药的分子机制研究

目的 调查B内酰胺酶、整合子、外膜蛋白（Omp）及外排泵在多重耐药和泛耐药不动杆菌属中所起的作用。方法 收集1999至2004年北京、广州和福州对碳青霉烯类耐药的非重复的90株菌。脉冲场凝胶电泳（PFGE）和随机引物多态性DNA（RAPD）分型确定这些耐药株的亲缘关系，选取7个不同克隆深入研究其机制。等电聚焦电泳测定酶的等电点；碱裂解法提取质粒；对各种B内酰胺酶TEM、SHV、PER、OXA-、IMP-、VIM-进行聚合酶链反应（PCR）及序列分析；对整合子基因进行PCR及序列分析。结果 2004年北京协和医院发生泛耐药株P克隆的暴发流行，此克隆株对常用广谱抗菌药物均不敏感。7个不同克隆株均产多种B内酰胺酶：TEM-1酶、高产AmpC酶、SHV型酶、OXA-23型碳青霉烯酶（6株）及IMP-8型金属酶（1株），1个克隆株还产PER-1型酶。这7个克隆株对大多数超广谱6内酰胺类（包括碳青霉烯类）、红霉素、氯霉素、利福平均耐药，2个克隆株对头孢哌酮／舒巴坦、阿米卡星敏感，4个克隆株对左氧氟沙星敏感。所有7株对米诺环素、黏菌素敏感。发现5种不同结构的整合子，携带水解氨基糖苷类、利福平、氯霉素及碳青霉烯类（bla1MR-8）的耐药基因。结论 不动杆菌产生OXA-23型碳青霉烯酶或IMP型金属酶、通过基因重组获得各种携带不同基因盒的整合子，共同介导其多重耐药性或泛耐药性。泛耐药株对个别不常用的抗菌药物如黏菌素、米诺环素仍敏感。     

海南发现4株产NDM-1多重耐药的肺炎克雷伯菌

目的分离和鉴定海南地区临床上发现的耐碳青霉烯类药物的肺炎克雷伯菌携带新德里金属β-内酰胺酶-1（NDM-1）基因的细菌。方法使用法国梅里埃API20E生化鉴定条和VITEK2全自动细菌鉴定仪及其配套的GNS试剂,鉴定出临床上耐亚胺培南和美洛培南的肺炎克雷伯菌;并经改良Hodge试验和亚胺培南,亚胺培南＋EDTA纸片法协同试验检测产金属酶类碳青霉烯酶,对目的菌株进行NDM-1耐药基因PCR特异性扩增,扩增后产物进行琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定;同时将目的菌株进行质粒接合转移试验分析其耐药机制,并对接合前后的药敏结果进行比较分析。结果从13株耐亚胺培南或美洛培南的肺炎克雷伯菌中,经亚胺培南,亚胺培南＋EDTA纸片法协同试验检出4株阳性,确定为产金属酶类碳青霉烯酶细菌。该4株产金属酶的肺炎克雷伯菌的改良Hodge试验均为阴性,NDM-1基因PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳和测序分析,确认此4株目标菌株均为携带NDM-1的耐药基因的耐药菌株;这4株接合子E．coli J53（NDM-1）对所有β-内酰胺类药物的MIC值较受体菌E．coli J53耐药性均有很大提高,经PCR扩增其接合子NDM-1基因片段分析证实4株接合子均接合成功。结论海南发现的4株耐碳青霉烯酶类的肺炎克雷伯菌为携带blaNDM-1基因,且其NDM-1耐药基因可通过质粒在不同菌株之间传递。     

嗜麦芽窄食单胞菌所产金属β-内酰胺酶基因的克隆及表达

目的　探讨嗜麦芽窄食单胞菌所产金属 β 内酰胺酶的酶学特性及分子生物学特征。方法　以MBL E试验筛查到的一株产金属 β 内酰胺酶 (MBL)嗜麦芽窄食单胞菌 75 0为研究对象 ;MBL的等电点、对酶抑制剂的酶稳定性及抗生素的水解率按常规测定 ;抽提细菌染色体、PCR扩增blaMBL全基因并进行测序 ;构建blaMBL pET32a( )重组体 ,并在大肠杆菌BL2 1(DE3)中进行表达。结果　菌株 75 0仅产一种 β 内酰胺酶 ,其pI为 6 6 ;以对亚胺培南的水解率为 10 0 %计 ,对青霉素、拉氧头孢、头孢他啶、氨曲南的相对水解率分别依次为 14 2 0 %、2 7%、9%和 1% ,酶活性可被EDTA抑制 ,但不受克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦等 β 内酰胺酶抑制剂影响。染色体DNA模板的PCR结果显示 ,酶全基因全长为 86 7bp ,经序列分析和同源性比较 ,与已报道的金属酶L1的编码基因blaS(注册号AJ2 916 72 )和blaL1(AF0 10 2 82 )的核苷酸同源性均为 99 31% ,推定的氨基酸序列同源性分别为 99 31%和 98 96 %。大肠杆菌BL2 1(DE3)转化含酶基因的blaMBL pET32a( )重组质粒后 ,MBL E试验为产MBL阳性 ,对亚胺培南和头孢他啶的MIC分别为 12mg/L和 2mg/L ,对亚胺培南的MIC较母株低 10倍左右 ;SDS PAGE分析发现 ,融合基因表达的蛋白为 4 8kDa ,其中酶蛋白约