降钙素基因相关肽对大鼠成骨细胞增殖和分化的影响

目的 探讨外源性降钙素基因相关肽（CGRP）对大鼠颅盖骨来源成骨细胞的影响，以进一步了解CGRP促进成骨的作用机制。方法 利用二次酶消化法培养的成骨细胞，加入含不同浓度CGRP的条件培养液，24小时后通过MTT比色，^3H-TdR掺入以及细胞内碱性磷酸酶（ALP）含量的测定来观察CGRP对成骨细胞增殖和分化的影响。结果 CGRP可以明显促进成骨细胞增殖，而且作用呈剂量依赖性。CGRP对细胞内ALP含量无明显影响。结论 CGRP能够直接作用于成骨细胞并通过促进其增殖而有利于骨形成。     

胶原蛋白肽含药血清促进成骨细胞增殖和分化

目的牛骨胶原蛋白肽(collagen peptides,CP)化合物能够显著增加股骨骨密度,并改善股骨的微结构,在骨质疏松症的预防和治疗中发挥重要的作用,它通过口服给药的形式吸收入肠。然而,此过程的分子机制尚不清楚。因此,本研究以阐明牛骨CP化合物血清对成骨细胞增殖与分化的影响。方法制备牛骨CP化合物大鼠血清,牛骨CP化合物处理的实验组和未经处理的对照组大鼠血清浓度为3%、6%、10%,加到无血清的DMEM溶液中,用MTT法和流式细胞术分别检测牛骨CP血清对MC3T3-E1细胞增殖和细胞周期的影响。茜素红矿化染色检测牛骨CP血清对成骨细胞矿化,用Pro Plus 6图像软件定量分析茜素红染色的含量。结果 MTT结果表明,3%、6%及10%的CP化合物含药血清与对照组相比,能够显著促进MC3T3-E1细胞增殖(P0.05)。然后将3%CP化合物含药血清,对照组(control,CN)血清分别作用于MC3T3成骨细胞,培养3 d,流式细胞术测定细胞周期。结果表明,与3%CN血清相比,3%CP血清组G1期比例显著减少,G2/S期比例显著增加(P0.01),表明牛骨CP通过促进G2/S期的百分含量而促进细胞的增殖。矿化染色结果表明CP血清处理21 d后能显著促进成骨细胞的矿化(P0.05)。结论牛骨CP血清在成骨细胞增殖与分化中起重要作用,为骨质疏松症的防治提供了理论依据。     

缺氧对成人成骨细胞增殖及分化的影响

目的:在缺氧条件下体外培养成人成骨细胞,探讨缺氧对成骨细胞增殖及分化的影响。方法:将手术中取得的成人髂骨骨块,使用酶消化法进行培养,当细胞传至第2代时,建立成骨细胞缺氧模型,用MTT法观察各组成骨细胞增殖活力的变化;用骨钙素放射免疫法分别检测各组骨钙素含量;用激光共聚焦显微镜对两组培养前3 d细胞血管内皮生长因子(VEGF)光密度值作定量分析。结果:正常组细胞增殖活力较缺氧组强;缺氧组细胞VEGF的光密度值及骨钙素含量均高于正常组。结论:缺氧抑制成骨细胞增殖,缺氧(1~3 d)诱导成人成骨细胞VEGF的高表达并促进成骨细胞的分化。     

骨胶原肽对老年骨质疏松症患者骨密度和骨代谢指标的影响

目的观察骨胶原肽对老年骨质疏松症患者的骨密度和血清骨代谢指标水平的影响。方法 138例老年骨质疏松症患者纳入本研究,将其随机分为治疗组和对照组,每组各69例。对照组患者应用阿仑膦酸钠治疗,治疗组患者给予骨胶原肽联合阿仑膦酸钠治疗,治疗为期12个月。检测治疗前和治疗12个月后两组患者腰椎正位(L1-L4)、左股骨颈的骨密度、血清血钙、血磷、骨碱性磷酸酶(bone alkaline phosphatase,BALP)和抗酒石酸酸性磷酸酶-5b(tartrate-resistant acid phosphatase-5b,TRAP-5b)水平变化情况以及治疗有效率和不良反应。结果治疗12个月后,治疗组腰椎正位、左股骨颈的骨密度患者均明显高于对照组,差异均有统计学意义(P0.05);治疗12个月后,两组患者血清BALP及血磷水平较治疗前明显降低,血清TRAP-5b及血钙水平均较治疗前明显升高,和治疗前比较差异均有统计意义(P0.05);而治疗组较对照组改善更为明显(P0.05)。治疗组的患者治疗有效率优于对照组(P0.05),而不良反应无明显差异(P0.05)。结论骨胶原肽联合阿仑膦酸钠能安全有效提高老年骨质疏松症患者的骨密度,改善骨代谢。     

阿司匹林联合辛伐他汀对成骨细胞增殖及分化的影响

目的探索阿司匹林(aspirin,ASP)联合辛伐他汀(simvastatin,SIM)对成骨细胞增殖和分化的影响,为临床上两者联合使用的可行性提供细胞学基础。方法获取SD大鼠成骨细胞,随机分为对照组(CON)、ASP组、SIM组和ASP-SIM组等4组,培养基中分别添加安慰剂、ASP、SIM和ASP联合SIM干预,培养7 d后,通过MTT法检测细胞的增殖情况,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)及茜素红染色观察细胞的功能状态,蛋白电泳观察骨钙素(osteocalcin,OCN)及Runx2蛋白的表达情况。结果 ASP及SIM单独作用于成骨细胞时,都可以明显促进成骨细胞的增殖,增加ALP活性及矿化能力,同时明显促进OCN及Runx2蛋白的表达;联合使用效果明显优于单独使用,比较差异有统计学意义(P0.05)。结论 ASP及SIM都可以明显促进成骨细胞增殖和分化,且联合使用效果更佳。     

不同强度正弦交变磁场对体外培养成骨细胞增殖与分化影响

目的研究频率为50Hz的不同强度正弦交变电磁场对体外培养成骨细胞(Osteoblasts,OB)的影响。方法原代培养大鼠颅骨成骨细胞,传代后随机分为9组,每组分别暴露在频率50Hz,磁场强度为0(对照组)、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1、2.4、2.7、3.0mT的正弦交变磁场中,30min/次/d。倒置相差显微镜下观察细胞形态,48h后测定细胞增殖情况,第3、6、9、12、15d测定碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)活性,第10d进行ALP组织化学染色,第12d进行茜素红钙化结节染色。结果成骨细胞于磁场暴露处理3d～4d后呈漩涡样分布;与对照组相比,0.9、1.2、1.5、1.8、2.1、2.7和3.0mT组均显著抑制细胞增殖(P0.01或P0.05),2.4mT组无明显影响(P0.05);除3.0mT组外,其它各组的ALP活性均高于对照组(P0.05),尤以1.8mT组最高(P0.01);1.2、1.5、1.8、2.1和2.4mT组的ALP阳性克隆数明显多于对照组,1.8mT组最多,0.9、2.7和3.0mT组与对照组无明显差别;茜素红钙化结节计数结果与ALP组织化学染色结果的趋势相一致。结论 50Hz,0.9mT～3.0mT的正弦交变磁场(2.4mT除外)均抑制体外培养成骨细胞的增殖,但能促进其分化成熟与钙化,尤以1.8mT效果最为明显。     

兔成骨细胞和脂肪细胞横向分化的研究

目的 探讨兔成骨细胞和脂肪细胞两者横向分化的能力和方法.方法 选取3个月龄新西兰大白兔,获取、分离培养脂肪细胞,天花板贴壁法使其去分化,去分化脂肪细胞进行成骨诱导3周后行茜素红、碱性磷酸酶(ALP)和Ⅰ型胶原酶免疫组织化学染色.另选取出生7d内的乳兔,取颅骨骨块利用酶消-组织块培养法培养成骨细胞并传代培养,对其进行成脂诱导3周后行油红O染色、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ) mRNA的表达.结果 提取的成熟脂肪细胞去分化后为长梭形成纤维细胞状;成骨诱导后,Ⅰ型胶原免疫组织化学染色显示实验组细胞内表达出Ⅰ型胶原,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05);各组细胞第3天、第7天、第14天不同时段的ALP活性实验组较对照组高(P＜0.05),分别为0.165±0.007、0.253±0.005、0.345±0.007和0.067±0.004、0.076±0.006、0.082±0.003,且随着培养时间的延长实验组ALP活性逐渐增强(组内比较P＜0.05);提取的乳兔颅骨成骨细胞呈短梭形,成脂诱导3周后油红O染色阳性,PPARγmRNA表达阳性,对照组为阴性,实验组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 成熟脂肪细胞可以通过体外培养实现去分化,脂肪细胞和成骨细胞在一定条件下可以相互转化.     

大鼠雪旺细胞对两种来源的成骨细胞增殖分化影响的研究

目的 研究应用雪旺细胞(SCs)对两种来源的成骨细胞(OB)的增殖与分化的影响,为构建神经化组织工程骨提供体外实验理论依据.方法 通过采用股骨、胫骨髓腔冲洗法获得SD大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs),采用胰蛋白酶消化新生鼠颅骨获得OB及采用消化后组织块法获得SCs.将BMSCs在成骨诱导液作用3周,鉴定BMSCs向OB分化.采用96孔共培养板将第2代SCs种植于上室,颅骨来源OB种植下室,共培养为实验组,无SCs干预共培养为对照组.将诱导分化的OB种植于下室,第2代SCs种植于上室,共培养为实验组,无SCs干预共培养为对照组,分别于共培养后1、3、5、7、9d采用甲基噻唑基四唑(MTT)进行增殖比较.采用6孔共培养板,实验组上室种植SCs,下室分别种植颅骨来源及BMSCs来源的OB,不加SCs的两种来源的OB作为对照组,分别共培养后于3、7 d检测两种来源OB的碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白、骨形态发生蛋白-2 mRNA表达.结果 SCs对颅骨来源的OB在共培养3、5、7、9 d 4个时间点均有明显促增殖作用,在碱性磷酸酶、骨桥蛋白、骨形态发生蛋白-2mRNA在各个时间段均起到抑制作用.SCs对大鼠BMSCs来源的OB在共培养1、3 d无明显促增殖作用,在5、7、9 d有明显促增殖作用,在成骨培养基的环境里,SCs可促进BMSCs诱导的OB分化.结论 选择BMSCs来源的OB 与 SCs共培养更适合用于构建神经化组织工程骨.     

成骨细胞条件培养液对BMSCs诱导分化作用研究

目的 探讨大鼠成骨细胞条件培养液对同种大鼠BMSCs的成骨诱导分化作用,为骨组织工程种子细胞的获得寻找一种新方法 . 方法 健康1周龄SD大鼠10只,雌雄不限,体重20～30 g,采用贴壁法和酶消化法分别获得BMSCs和成骨细胞,并进行鉴定.无菌条件收集第1～5代成骨细胞培养液上清,与完全培养基1:1混合,制备成骨细胞条件培养液,与第2代BMSCs共培养为诱导组,相同代次BMSCs与完全培养液共培养为对照组.倒置相差显微镜下观察共培养后BMSCs形态变化,MTT法检测BMSCs生长情况,免疫组织化学染色检测共培养后BMSCs的ALP、Col Ⅰ、骨钙素(osteocalcin,OCN)蛋白的表达,采用RT-PCR检测Col Ⅰ、OCN mRNA的表达. 结果 诱导组共培养7 d BMSCs体积变大,细胞由长梭形展开为扁平形和多边形,并带有突起;9 d细胞呈集落状生长.细胞生长曲线示BMSCs数量随培养时间延长而增加,对照组增殖能力较诱导组强;诱导培养4～7 d,对照组细胞数量与诱导组比较差异有统计学意义(P<0.05).诱导组培养12 d,ALP染色呈阳性表达;18 d 出现钙结节;21 d Col Ⅰ和OCN呈阳性表达;对照组均呈阴性表达.RT-PCR检测示诱导组培养21 d有Col Ⅰ、OCN mRNA表达,对照组未见表达. 结论 体外大鼠成骨细胞条件培养液有明显的诱导同种大鼠BMSCs向成骨样细胞分化的作用.     

乳铁蛋白对大鼠成骨细胞增殖与分化的影响

目的观察乳铁蛋白(Lf)对大鼠成骨细胞增殖分化的影响,初步探讨Lf对成骨细胞的作用机制。方法用不同浓度的Lf干预成骨细胞,在不同时间分别测定细胞数目的增殖、细胞内碱性磷酸酶活性,并用半定量RT-PCR法检测成骨细胞内RANKL/OPG mRNA基因的表达。结果Lf呈时间和浓度依赖性地促进大鼠成骨细胞增殖及碱性磷酸酶活性,每组实验在不同时间的差异均有显著的统计学意义(P<0.05),其中400μg/ml组在72h时细胞增殖数目达到最大。在碱性磷酸酶活性方面,400μg/ml组在72h时则有所下降。不同浓度Lf、不同作用时间均能促使成骨细胞中OPG mRNA表达增加,同时抑制RANKL mRNA表达。结论Lf能促进成骨细胞的增殖分化,并且能够调节成骨细胞RANKL/ OPG mRNA表达,从而抑制破骨细胞介导的骨吸收。     

牛骨胶原蛋白肽促进HOB增殖

目的 研究牛骨胶原蛋白肽(Bovine Collagen peptides,BCP)对人成骨细胞(Human Oseoblast,HOB)增殖的影响.方法 分离培养HOB,茜素红染色鉴定HOB的成骨特性,利用MTT实验检测胶原蛋白肽对HOB的增殖,流式细胞仪测定胶原蛋白肽对HOB细胞周期.结果 茜素红矿化染色结果表明,HOB具有成骨能力.MTT实验表明0.3 mg/ml胶原蛋白肽能显著促进细胞的增殖,并能增加G2 +S期的百分含量.结论 牛骨胶原蛋白肽能够促进HOB增殖,为骨质疏松的预防和治疗提供理论依据.     

铁饱和乳铁蛋白对大鼠成骨细胞增殖与分化的影响

目的 探讨铁饱和乳铁蛋白对体外培养的大鼠成骨细胞增殖和分化的影响.方法 用酶消化法分离大鼠颅盖骨成骨细胞进行原代培养;乳铁蛋白螯合Fe~(2+)获得铁饱和乳铁蛋白;将其稀释到不同浓度作用于成骨细胞,四唑盐比色法(MTT)测定细胞增殖;碱性磷酸酶法(ALP)测定细胞碱性磷酸酶活性.结果 随着时间的增加,各浓度组均可促进成骨细胞增殖及增强碱性磷酸酶活性.其中100 μg/mL浓度组在72 h时细胞增殖数目最大、碱性磷酸酶活性最高,较对照组有统计学意义(P＜0.01).结论 铁饱和乳铁蛋白能促进大鼠成骨细胞的增殖和分化.     

山茱萸新苷Ⅰ对成骨细胞的增殖及成骨分化的影响

目的基于Wnt信号通路及内质网应激研究山茱萸新苷Ⅰ对大鼠原代成骨细胞的增殖及成骨分化的影响。方法提取原代成骨细胞,CKK8实验检测在药物浓度下山茱萸新苷Ⅰ对成骨细胞增殖的影响;碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色检测不同浓度山茱萸新苷Ⅰ干预下成骨细胞ALP的活性情况; Real-time PCR检测Wnt2、β-catenin、BMP2、OPG、NOX4、PERK基因mRNA的表达; Western blot检测Wnt2、β-catenin、PDI、CHOP和BIP蛋白表达量。结果 CKK8实验及ALP染色表明山茱萸新苷Ⅰ对成骨细胞增殖及分化有一定影响,不同浓度山茱萸新苷Ⅰ干预下成骨细胞出现不同程度的增殖;与空白对照组相比,山茱萸新苷Ⅰ组的Wnt2、BMP2、β-catenin、OPG、NOX4的mRNA表达水平显著升高(P0. 01),而PERK明显降低(P0. 01)。与空白对照组相比,山茱萸新苷Ⅰ组的成骨细胞Wnt2、β-catenin、PDI蛋白表达量显著升高(P0. 01),CHOP表达亦有轻微上升,但不明显(P0. 05),而BIP的蛋白表达水平明显降低(P0. 01)。结论山茱萸新苷Ⅰ浓度为1 mmol/mL时在促进成骨细胞的增殖分化的作用上表现最佳,其能显著升高成骨细胞Wnt2、BMP2、β-catenin、OPG和NOX4的mRNA表达水平,而降低PERK的mRNA表达水平,升高Wnt2、β-catenin、PDI的蛋白表达量,降低BIP的表达量,在山茱萸新苷Ⅰ的干预下,Wnt信号通路及内质网应激途径对成骨活动的发生发展起着重要作用。     

吲哚昔芬对大鼠成骨细胞增殖和Ⅰ型胶原合成的影响

目的研究吲哚昔芬对大鼠成骨细胞增殖和Ⅰ型胶原合成的影响。方法分离、培养大鼠头盖骨成骨细胞,分别采用四唑盐(MTT)比色实验和3H-Proline(3氢-脯氨酸)法测定成骨细胞增殖和Ⅰ型胶原合成的情况。结果吲哚昔芬作用大鼠成骨细胞48、72h,1×10-10 mol/L吲哚昔芬与对照组比较,MTTA490nm值显著升高(P<0.05),1×10-9、1×10-8 mol/L的吲哚昔芬使MTTA490nm值进一步升高(P<0.01)。经1×10-10 mol/L吲哚昔芬作用72、96h,3H-Proline掺入值显著升高(P<0.05),1×10-9、1×10-8 mol/L的吲哚昔芬使3H-Proline掺入值进一步升高(P<0.05)。分别用1×10-10 mol/L吲哚昔芬和雌二醇作用大鼠成骨细胞72h,二者的MTTA490nm值和3H-Proline掺入值均显著高于对照组,且吲哚昔芬MTTA490nm值和3H-Proline掺入值显著高于雌二醇(P<0.05)。结论吲哚昔芬发挥抗骨质疏松作用在短期主要促进成骨细胞增殖,中期既促进成骨细胞增殖又促进Ⅰ型胶原合成,而长期效应主要是通过促进胶原合成实现,并且其效应显著强于雌二醇,提示吲哚昔芬对骨质疏松的防治作用可能优于雌二醇。     

痩素在骨髓基质干细胞向成骨细胞分化早期的作用研究

目的 研究小鼠骨髓基质干细胞体外增生及向成骨细胞定向分化早期瘦素(Leptin)的作用。方法 取雄性6周ICR小鼠股骨骨髓基质细胞进行原代和传代培养，在传代细胞培养时加入Leptln(实验组)或保持基础培养条件(对照组)，分别检测两组的细胞增生情况。半定量RT-PCR方法检测成骨细胞相关基因Cbfal和Cbtb等在两组细胞分化过程中的表达。结果 实验组在细胞培养24和48h细胞数量明显少于对照组，显示时间与Leptin剂量依赖特性。Leptln在传代细胞培养中促进成骨细胞特异性转录因子Cbfal和Cbtb的表达。结论 Leptin抑制骨髓基质干细胞体外增生并促进早期成骨细胞相关基因的表达。     

MAPKs通路在MSCs的增殖及向成骨细胞分化过程中的作用

间充质干细胞（MSCs）是一种多潜能成体干细胞,在体外诱导剂的作用下能向成骨细胞分化。在MSCs向成骨细胞分化过程中,受到MAPKs、BMPs、Notch和Wnt等多种信号通路的调控。其中MAPKs信号通路研究比较深入,近年来研究表明在MAPKs信号通路的五种途径中,ERKs、p38MAPK和JNKs途径参与了成骨细胞增殖和分化的信号转导。现对MAPKs通路与其参与的MSCs增殖和成骨分化过程简要综述。     

淫羊藿苷对钛颗粒作用下成骨细胞增殖和分化的影响

[目的]研究淫羊藿苷(icariin,ICA)对钛(titanium,TI)颗粒作用下成骨细胞增殖和分化的影响。[方法]多次酶消化法体外分离新生大鼠颅骨成骨细胞,进行原代培养。双重荧光染色激光共聚焦显微镜下观察成骨细胞吞噬钛颗粒后的组织形态学改变。CCK-8法检测0.01、0.05、0.1、0.5、1mg/ml钛颗粒对成骨细胞增殖能力的影响,并筛选出半数致死浓度。在此浓度作用下分别加入10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10mol/L的淫羊藿苷进行干预,观察淫羊藿苷对钛颗粒作用下成骨细胞增殖能力的影响,找出最佳药物浓度。以最佳药物浓度干预钛颗粒作用下的成骨细胞,于第3、7、14 d ELISA法检测各组细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,观察药物对成骨细胞分化功能的影响。[结果]激光共聚焦显微镜下可见吞噬了钛颗粒的成骨细胞皱缩变形,微丝(F-actin)排列紊乱。不同浓度的钛颗粒均可抑制成骨细胞增殖,呈浓度依赖性,与对照组相比有显著差异(P<0.05),0.5mg/ml为钛颗粒的半数致死浓度。10-10-10-6mol/L的淫羊藿苷均能促进钛颗粒作用下的成骨细胞增殖(P<0.05),与钛颗粒组相比具有显著差异(P<0.05),10-9mol/L为淫羊藿苷的最佳作用浓度。在此浓度下的淫羊藿苷可以显著抑制钛颗粒引起的成骨细胞ALP活性下降(P<0.05)。[结论]淫羊藿苷可以在体外逆转钛颗粒对成骨细胞增殖和分化的抑制作用,有望成为防治人工关节无菌性松动的有效药物。     

辛伐他汀在骨髓基质干细胞向成骨细胞分化过程中的作用

目的 通过对小鼠骨髓干细胞体外培养的观察，研究辛伐他汀在骨髓基质干细胞向成骨细胞定向分化过程中的作用。方法 取雄性6周ICR小鼠股骨骨髓基质细胞进行原代和传代培养，应用组织化学及yon Kossa方法检测细胞碱性磷酸酶染色和细胞外基质矿化；在细胞培养早期加入辛伐他汀(实验组)或保持基础培养条件(对照组)，应用半定量RT-PCR方法分别检测两组Ⅰ型胶原蛋白(COL1)、碱性磷酸酶(ALP)、转录因子CBFA1和Osterix(OSX)在成骨细胞分化过程中的表达。结果 小鼠骨髓基质细胞经体外诱导后分化为具备碱性磷酸酶活性和矿化细胞外基质的成熟成骨细胞。实验组COL1、ALP和CBFA1表达在细胞培养第3，5天均高于对照组，OSX表达差异不明显。结论 辛伐他汀在成骨细胞分化过程中促进其相关基因的表达。