HIV-1基质蛋白P17的原核表达与纯化

目的 :HIV- 1p17基因在大肠杆菌中高效表达并纯化目的蛋白。方法 :1PCR法扩增的 HIV-1p17基因片段克隆至 p ET2 8c质粒 ;2重组质粒分别在大肠杆菌 BL 2 1、BL 2 1(DE3)、BL 2 1(DE3) plys S及 HMS174 (DE3)中表达 ;3用 Ni- NTA金属树脂层析法纯化目的蛋白 ;4用酶联免疫法和免疫印迹法检测纯化蛋白的特异性。结果 :重组质粒在 BL (DE3)中表达量最高 ,目的蛋白表达量占全菌体裂解物的32 % ,纯化后其纯度达 95% ,纯化蛋白可与 p17Mc Ab和 HIV- 1阳性血清发生特异反应。结论 :带有HIV- 1p17片段的重组质粒 p ET2 8c在大肠杆菌 BL2 1(DE3)中获得高效表达 ,蛋白表达量可满足其免疫、生物活性的进一步研究 ;用 Ni- NTA金属树脂层析法纯化蛋白 ,方法简便 ,蛋白丢失少 ,纯度高 ;纯化的重组蛋白 HIV- 1p17可用来临床早期诊断 HIV- 1感染者 ,同时可预测患者的临床进程。     

模式抗原破伤风毒素C蛋白的克隆、表达条件优化及免疫原性初步分析

目的 获得高纯度、高免疫原性的破伤风毒素C片段(TTC)蛋白.方法 以PCR从破伤风杆菌质粒DNA中扩增TTC基因片段,将其插入载体pET43.1a( )并导入大肠杆菌BL21(DE3)plysS中表达.用Ni2 NTA琼脂糖柱纯化融合蛋白,经凝血酶酶切,再用Ni2 -NTA琼脂糖柱分离目的 蛋白.SDS-PAGE和免疫印迹分析目的 蛋白的相对分子质量和抗原性,动物免疫实验鉴定其免疫原性.结果 获得1373 bp的TrC基因片段,构建成重组表达载体pET43.1a( )-TTC并在大肠杆菌中表达.TTC-Nus融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的22％,酶切后TTC蛋白可与载体蛋白有效分离,获得纯度为95.5％的TTC蛋白,该蛋白可被破伤风抗毒素识别;将TTC蛋白免疫小鼠后,免疫血清可与破伤风毒素特异性结合,三次免疫后其抗体效价可达1:25 600.结论 所获TTC蛋白纯度高,免疫原性好,为研究体内外抗原提呈、免疫应答提供了良好的模式抗原.     

HtsA表达质粒克隆和蛋白质的纯化

目的克隆HtsA重组表达质粒以获得HtsA表达蛋白。方法通过PCR方法扩增获得A组链球菌HtsA基因完整的序列,将此片段定向克隆到表达载体pET21d质粒中,在E.coli BL21(DE3)中表达融合蛋白,并运用离子交换层析和疏水层析分离纯化HtsA蛋白。结果经琼脂糖电泳证实成功克隆了重组表达质粒pET21d-HtsA,pET21d-HtsA融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中得到表达,SDS-PAGE分析表明纯化的HtsA纯度较高。结论成功构建了A族链球菌HtsA基因重组表达质粒,并纯化获得了目的蛋白HtsA。     

人软骨调节素基因的克隆与纯化

目的克隆人软骨调节素I(CHM-I)cDNA,并在原核表达系统中表达和纯化。方法利用RT-PCR技术从人软骨组织中扩增出CHM-I基因片段,并将其克隆到原核表达载体pET28a中,转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG进行诱导表达;对在N末端融合了6×His纯化标签的表达产物进行Westernblot分析和用Ni2+2NTA离子交换树脂进行纯化;纯化蛋白进行SDS-PAGE纯度分析。结果获得了人软骨调节素cDNA,并成功构建了高效原核表达质粒pET(CHM-I),能有效表达CHM-I蛋白,且CHM-I蛋白的纯度高于90%。结论原核表达系统可有效克隆较高纯度的CHM-I基因。     

人转录因子sp1在大肠杆菌中的表达与体外纯化

目的：在大肠杆菌中表达人源转录因子spl蛋白,并进行体外纯化。方法：首先将人源sp1真核表达质粒pCMV-sp1中的sp1 cDNA用限制性内切酶切开,连入原核表达质粒pET28b,构建原核表达重组质粒pET28b-sp1-699c;然后将重组质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）菌株,经IPTG诱导表达带His-Tag的融合蛋白His-sp1（88-786aa）,通过包涵体的变复性和Ni-IDA亲和层析纯化后,SDS-PAGE鉴定纯化后的蛋白。结果：融合蛋白His-sp1在大肠杆菌内得到高效表达,纯化后可得到较高纯度的蛋白。结论：本研究获得了较高纯度的融合蛋白His-sp1,为进一步研究sp1蛋白对靶基因的转录调控奠定了基础。     

细粒棘球蚴重组延伸因子-1基因的表达、纯化及免疫学鉴定

目的对构建细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)延伸因子-1(Elongation factor1,EF-1)基因的重组质粒,并原核表达、纯化及对其免疫特性进行鉴定。方法从重组质粒EF-1/pGEM-T中酶切出EF-1目的片段,亚克隆入表达载体pET28a,转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)plysS进行融合表达,经His-band树脂纯化试剂盒小量纯化,SDS-PAGE和Westernblot方法鉴定表达产物。结果成功构建Eg.EF-1/pET28a/E.coliBL21基因工程菌株,诱导表达重组蛋白和纯化分离得到31KDaEg.EF-1均能被细粒棘球蚴天然抗原免疫的兔多克隆抗血清识别。结论初步证实该重组蛋白具有较好的抗原性。     

人分化抑制因子3基因原核表达载体的构建及融合蛋白的表达

目的:在大肠埃希菌中表达和纯化人分化抑制因子3(Id3),为进一步研究Id3的生物学活性打下基础. 方法:PCR扩增人Id3基因编码区的DNA片段,将PCR产物克隆至pGEM-T Esay载体中并测序鉴定.将Id3 cDNA片段重组入原核表达质粒pET-32a( ),转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白的表达,表达产物经Western blot 鉴定,并通过镍亲和层析柱纯化His-Tag标记的融合蛋白. 结果:成功地构建了Id3的原核表达载体.Western blot分析证实,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了His-Tag融合蛋白,亲和层析法纯化后获相对分子质量为34 000的Id3融合蛋白. 结论:重组质粒pET32a( )-Id3能在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,镍亲和层析柱可纯化获得融合蛋白.     

截短形式弓形虫SAG1抗原在大肠杆菌中的可溶性高效表达、纯化及免疫反应性鉴定

目的 在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达弓形虫SAG1基因的截短片段，并进行纯化及免疫反应性鉴定。方法 利用，VcoI、HindⅢ双酶切，从本室建立的pET-30a( )-SAG1重组质粒中获取SAG1基因的截短片段，并将目的片段连接到经同样双酶切的质粒pET32a中，构建表达重组质粒pET-32a( )-trSAG1。将重组质粒转入E．coli BL21中并进行诱导表达。表达蛋白经Ni—NTA agarose纯化后，Western—blotting分析其免疫反应性。结果 成功构建重组质粒pET-32a( )-trSAG1，通过IPTG诱导得到了以可溶性形式表达的重组SAG1蛋白，相对分子质量40000，Western—blotting结果显示纯化的重组蛋白具有良好的免疫反应性，ELISA试验表明重组SAG1蛋白能被弓形虫免疫兔血清及弓形虫感染人血清识别。结论 在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达了弓形虫SAG1基因的截短片段，表达蛋白能被弓形虫免疫兔血清及弓形虫感染人血清识别，有望成为一种有价值的诊断抗原。     

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白在pET原核表达系统中的表达与纯化

目的　构建能在pET原核表达系统中表达结核分枝杆菌ESAT -6蛋白的重组表达质粒 ,并对其表达产物进行纯化。　方法　用PCR方法从结核分枝杆菌H3 7Rv基因组中扩增出ESAT -6基因片段 ,克隆至pMD18-T载体 ,PCR筛选阳性克隆并测序 ;用限制性内切酶消化后 ,目的片段亚克隆至表达载体pET -2 3a( ) ,构建pET -ESAT -6重组质粒 ,将其转化入大肠杆菌BL2 1(DE3 ) ;PCR和双酶切鉴定转化菌落 ;将阳性菌株经IPTG诱导 ,SDS -PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达 ;用His·BindTM柱亲和层析法纯化融合蛋白。　结果　从结核分枝杆菌H3 7Rv基因组DNA中扩增出ESAT -6基因片段 ,成功构建重组表达质粒pET -ESAT -6,SDS -PAGE显示表达产物分子量约为 6kD ,经亲和纯化后的ESAT -6重组蛋白纯度高 ,且能被结核病人血清所识别。　结论　利用pET原核表达系统成功表达和纯化了结核分枝杆菌ESAT -6重组蛋白 ,为结核病诊断抗原和疫苗研究奠定了基础。     

弓形虫SAG1基因成熟蛋白编码区在大肠杆菌中的表达

目的：克隆并表达弓形虫SAG1基因成熟蛋白编码区片段，为下一步表达蛋白纯化奠定基础方法：将弓形虫SAG1基因成熟蛋白编码区片段克隆入高效融合表达载体pET32α，转化大肠杆菌B121(DE3)，37℃、IPTG诱导表达，SDS—PAGE分析表达产物结果：成功构建重组质粒pET32α—SAG1，经诱导后表达出含外源基因的融合蛋白，SDS—PAGE分析表达产物分子质量约44kDa，结论：弓形虫SAG1成熟蛋白编码区在原核表达系统pET32α/BL21(DE3)中获得成功表达，为下一步表达蛋白纯化提供试验依据。     

大鼠ANT1蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体的制备

目的：表达和纯化大鼠腺苷酸转运体（ANT1）蛋白并制备其多克隆抗体.方法：通过PCR扩增大鼠脑组织中ANT1的编码区序列,构建ANT基因重组载pET28a-ANT1,转化至E. coli BL21（DE3）,IPTG诱导表达,Ni2＋-NTA离子交换树脂层析纯化;纯化的ANT1蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并亲和纯化,并通过Western Blot法鉴定其特异性.结果：成功构建重组质粒pET28a-ANT1,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达了Mr约为32×10^3的目的蛋白;亲和层析纯化后免疫的新西兰大白兔获得其多克隆抗体;曝光后胶片上均可见Mr32×10^3的阳性条带,与纯化的大鼠ANT1重组蛋白处于同一水平,表明纯化的抗ANT多克隆抗体具有高度的特异性.结论：利用基因重组技术,在大肠杆菌中成功表达了大鼠ANT1融合蛋白并制备了其多克隆抗体,为研究腺苷酸转运体蛋白在癫痫发病过程中的作用机制奠定了基础.     

肠出血性大肠杆菌O157P:H7紧密黏附素的基因克隆、表达及功能研究

目的 获得高纯度的eae基因表达蛋白紧密黏附素(Intimin),研究其黏附作用.方法 从肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7全基因组中扩增出eae基因,T-A克隆后,将eae插入载体pET28a(+),并转化至E.coli BL21(DE3)中表达;用Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化出重组蛋白;SDS-PAGE检测目的 蛋白相对分子质量,免疫印记分析其免疫反应性,免疫荧光检测其黏附性.结果 获得了大小约2805 bp的eae片段;构建r重组载体pET28a(+)-eae,并在E.coli BL21(DE3)中以包涵体形式表达Intimin,Mr约97 000;Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化出Intimin;大肠杆菌O157:H7多抗血清在Mr约97 000处检测出一条特异性Intimin带;Intimin可黏附在HEp-2细胞表面.结论 高纯度的重组蛋白Intimin具有一定的免疫反应性,能与HEp-2细胞黏附,为进一步研究Intimin蛋白与宿主受体蛋白的相互作用奠定基础.     

肠出血性大肠杆菌O157:H7紧密黏附素的基因克隆、表达及功能研究

目的 获得高纯度的eae基因表达蛋白紧密黏附素(Intimin),研究其黏附作用.方法 从肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7全基因组中扩增出eae基因,T-A克隆后,将eae插入载体pET28a(+),并转化至E.coli BL21(DE3)中表达;用Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化出重组蛋白;SDS-PAGE检测目的 蛋白相对分子质量,免疫印记分析其免疫反应性,免疫荧光检测其黏附性.结果 获得了大小约2805 bp的eae片段;构建r重组载体pET28a(+)-eae,并在E.coli BL21(DE3)中以包涵体形式表达Intimin,Mr约97 000;Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化出Intimin;大肠杆菌O157:H7多抗血清在Mr约97 000处检测出一条特异性Intimin带;Intimin可黏附在HEp-2细胞表面.结论 高纯度的重组蛋白Intimin具有一定的免疫反应性,能与HEp-2细胞黏附,为进一步研究Intimin蛋白与宿主受体蛋白的相互作用奠定基础.     

HIV-1 p15（Gag）基因的克隆、蛋白表达及抗体制备

目的:构建HIV-1p15(Gag)原核表达载体,诱导蛋白表达及制备多克隆抗体。方法:用PCR的方法扩增编码p15(Gag)基因序列,将其克隆到原核表达载体pET28a( )中,利用大肠杆菌表达系统表达HIV-1p15蛋白,分别用His抗体和HIV阳性血清做western blot鉴定目的蛋白的免疫原性。纯化目的蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验(ELISA),细胞免疫组织化学法检测抗体滴度及其特异性。结果:原核表达载体pET28a( )-p15(Gag)成功构建,可在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达,得到相对分子质量约20KD的p15(Gag)蛋白,经western blot鉴定正确。纯化蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体具有较强免疫特异性。结论:得到纯化的HIV-1p15蛋白,制备的多克隆抗体能够检测自然状态下病毒蛋白p15(Gag),为进一步研究HIV-1奠定了实验基础。     

结核分支杆菌Ag85B蛋白在大肠杆菌中的高效表达

目的：通过结核分支杆菌Ag85B基因在大肠杆菌中的表达，获得大量纯化的重组Ag85B(rAg85B)蛋白。方法:应用PCR技术扩增结核分支杆菌H37RvAg85B DNA序列；以质粒pET24b为表达载体，构建Ag85B重组质粒，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)；以IPTG诱导转化子，通过SDS—PAGE电泳鉴定rAg85B的表达水平，采用Novagen公司生产的His．Bind蛋白纯化试剂盒纯化rAg85B蛋白。结果:重组质粒PET24b—Ag85B测序表明与报道的序列相同；它在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内以包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的30％左右。纯化后的rAg85B样品经SDS—PAGE和光密度扫描分析表明其纯度约为95％左右，每100ml培养菌可获得10mg左右纯化的重组蛋白。结论:pET24b—Ag85B大肠杆菌工程菌株能高效表达rAg85B蛋白，大量纯化的rAg85B为其进一步的研究与应用奠定了基础。     

绿色荧光标记C-反应蛋白的原核表达和毛细管电泳检测

目的:表达纯化重组的His-EGFP-CRP蛋白,通过毛细管电泳技术对该重组蛋白的生物活性进行评价.方法:用pET14b/EGFP-hCRP原核表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达的重组蛋白通过亲和色谱纯化、梯度透析,获得复性的His-EGFP-CRP蛋白;并用高效毛细管电泳(HPCE)技术对复性的蛋白进行检测,了解蛋白质的等电点及活性.结果:转化实验发现,该质粒pET14b/EGFP-hCRP在BL21(DE3)中能够被诱导表达;通过包涵体变性溶解、亲和色谱纯化可获得纯度较高的His-EGFP-CRP蛋白;HPCE分离发现复性后的His-EGFP-CRP蛋白峰为多个,其在电泳液pH值低于6时易检出,His-EGFP-CRP与THP-1细胞裂解物孵育后的检测峰增多.结论:成功地在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达重组蛋白His-EGFP-CRP,通过包涵体变性溶解及亲和色谱纯化获得该重组蛋白,复性后的His-EGFP-CRP等电点接近于6,以单体或多聚体等结构形式存在,具有结合活性,能与细胞内相关分子结合成复合物,可应用于CRP功能和内化机制的研究.     

人胰岛素样生长因子前体基因的重组、表达及其蛋白纯化

目的：构建含有人胰岛素样生长因子（human insulin-like growth factor-1，hIGF-1）前体编码全长cDNA的重组载体，使其在E-coli BL21（DE3）中表达，并对此表达菌株所表达的重组蛋白进行纯化，同时探讨其抗原性及应用价值。方法：采用PCR法，扩增编码hIGF-1前体cDNA的片段，通过双酶切、胶回收纯化、连接后得到pET32a（＋）／hIGF-1重组载体，然后将其转化入BL21（DE3）中，经IPrG诱导后表达的重组蛋白经镍柱亲和层析纯化，并用Western blot法检测重组蛋白的抗原活性。结果：重组质粒pET32a（＋）／hIGF-1经双酶切鉴定和测序分析后证实构建成功。BL21（DE3）表达的重组蛋白经SDS-PAGE电泳后显示．其表达量占细菌总蛋白量的25％左右．该重组蛋白经镍柱亲和层析纯化后其纯度高达90％以上。Western blot结果显示非常清晰的免疫印迹条带，表明此重组蛋白具有免疫学特异性。结论：pET32a（＋）／hIGF-1重组载体构建成功，并能够高效表达。     

恙虫病东方体56 kD表面抗原基因片段的克隆、表达及纯化抗原在恙虫病抗体检测中的应用

目的　构建恙虫病东方体 5 6 k D表面抗原基因 (sta5 6 )片段的重组表达质粒 ,在 E.coli中表达 Sta5 6重组抗原 ,重组抗原纯化后应用于间接法 EL ISA、金标快速免疫层析法检测恙虫病东方体特异性抗体。　方法　从恙虫病东方体Karp株基因组中扩增出 sta5 6基因的 ORF及其中长 10 5 3bp的大片段 ,用 TA克隆技术将此大片段克隆以该重组质粒为模板 ,扩增出不同长度的截短的 sta5 6片段 ,定向插入p PROEX HTb及 p ET30 a载体 ,转化大肠杆菌 DH 5α或BL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达 ,应用 SDS- PAGE观察重组蛋白表达情况 ,应用 Western blot分析重组抗原的活性 ;采用电洗脱、亲和层析等方法纯化重组蛋白。纯化的重组蛋白直接包被聚乙烯 96孔板 ,用于间接法 EL ISA检测恙虫病东方体 Ig G,或以胶体金标记重组抗原 ,运用金标快速免疫层析法检测恙虫病东方体 Ig M和 Ig G抗体。　结果　 (1)从恙虫病东方体 Karp株基因组中扩增出含 sta5 6基因的 ORF,并成功构建含 sta5 6 ORF大片段的重组质粒 TOPO- sta5 6。(2 )以截短的 sta5 6基因片段构建重组表达质粒 p HTb Ot95 7、p HTb O4 98、 p HTb Ot342和 p ETOt95 7、 p ETOt4 98、p ETOt342 ,各重组子均可在 E.coli中以融合蛋白的形式有效表达 ,SDS- PAGE显示各表示重组子     

HIV-1核心抗原p24基因的表达、纯化及应用研究

目的在原核系统中表达全长HIV-1p24抗原,对其抗原性进行鉴定,探讨其对HIV早期诊断的价值。方法利用PCR技术从含有HIV-1gag基因质粒PTM-1中扩增p24蛋白基因,通过酶切消化后连接到表达载体pET28a上,转化大肠埃希菌BL21（DE3）,经IPTG诱导,表达p24抗原。通过ELISA和Westernblotting（WB）法检测表达产物的免疫反应活性及特异性。结果PCR产物和构建的重组质粒pET28a—p24经双酶切均显示约690bpDNA片段,与预期p24抗原全基因片段大小-致。SDS—PAGE电泳可见纯化蛋白为1条相对分子量约26x10,Mr的外源表达蛋白带,与预期大小-致。ELISA及WB实验证实表达的p24抗原具有较好的活性及特异性。时间分辨荧光免疫双抗体夹心法显示与市售p24抗原线性-致。结论构建了HIV-1p24／pET28a原核高效表达系统,表达产物与市售的p24抗原具有相似的抗原性。     

人可溶性DC-SIGN的原核表达及鉴定

目的 构建可溶性DC-SIGN(sDC-SIGN)原核表达载体,获得不含标签蛋白的sDC-SIGN蛋白.方法 采用PCR方法,从含人DC-SIGN cDNA的重组质粒pGM-DC-SIGN扩增DC-SIGN胞外区基因片段,插入原核表达载体pET17b,构建重组表达载体pET17b-sDC-SIGN,经酶切图谱和测序鉴定,转入E.coli BL21 (DE3)诱导表达蛋白,用抗人DC-SIGN抗体-Sepharose 4B亲和层系纯化表达产物,以SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果 从重组质粒pGM-DC-SIGN扩增获得1 300 bp目的基因片段,构建重组表达质粒pET17b-sDC-SIGN,其酶切图谱和序列与预期相符.纯化表达产物sDC-SIGN,鉴定其分子质量为38 000,Western bolt证明其可与抗人DC-SIGN抗体特异性结合.结论 获得了能高效表达重组人sDC-SIGN的大肠杆菌菌株和不带任何标签蛋白的sDC-SIGN蛋白,为深入研究sDC-SIGN的功能奠定了基础.