深低温角膜保存的研究进展

深低温冷冻保存法是目前保存供体角膜时间最长的保存方法,其保存效果与新鲜组织无异,故越来越受到研究的关注。本旨在对该保存法的研究进展作一综述。     

深低温长期保存活角膜组织

本文对深低温长期保存活角膜组织的历史、保存机理和技术、实验研究和临床研究进行了回顾。采用这种方法保存活角膜组织,不仅保存期限可长达数月,甚至数年,而且保存材料质量优良,细胞活性非常接近新鲜角膜,用于穿通性角膜移植术后,透明率与新鲜角膜相仿,是眼库保存角膜的一种理想方法。此法保存角膜还可计划安排手术,使供体角膜在时间和空间上得到最大限度的利用。这对改善角膜材料来源短缺状况、推动角膜移植的开展和为HLA组织配型,均可创造有利条件。     

深低温长期保存角膜和新鲜角膜移植治疗角膜穿孔

为探讨深低温长期保存角膜移植治疗角膜穿孔的临床价值,本研究应用深低温长期保存角膜和新鲜角膜进行角膜移植治疗各类角膜穿孔60例(60眼),其中新鲜角膜组和深低温长期保存组的供眼摘除时间分别为3.7±2.6小时和1.9±1.2小时,传统湿房保存时间分别为4.9±3.2小时和7.4±3.1小时,深低温保存组角膜深低温保存时间为20天～43个月(平均19.5±13.2个月).术后分别随访7.5±5.7个月和6.9±4.6个月,结果显示术后在感染控制率、角膜植片透明率、移植免疫排斥反应发生率及视力改善方面均无显著性差异,提示深低温长期保存角膜移植治疗角膜穿孔和新鲜供眼角膜移植一样,具有良好的临床应用价值.     

长期低温全眼球保存角膜的实验研究

本研究采用冷冻的方法对用4种不同方法处理的眼球进行保存,使用角膜内皮细胞显微镜(TOMEY EM-1000)对其细胞密度、平均细胞面积、六边形细胞比例3项指标进行定量分析,并行病理切片(HE染色)进行对比观察。1材料与方法1.1实验动物的选择及实验方法取健康家兔20只40眼,随机将兔平均分为4组。眼球处理后将角膜面向上放置冰箱-20℃保存,分别于1、7、14、21、28 d进行各项指标的测定,然后取角膜片行病理切片。第1组:冷冻保存。第2组:放入盛有消毒甘油的无菌盒内冷冻保存。第3组:抽空房水,同时注入1∶6的C3F8与空气的混合物,冷冻保存。第4组同…     

角膜保存的进展

角膜保存的进展刘华综述冯春茂陈家祺审校（中山医科大学中山眼科中心广州５１００６０）角膜保存的目的是为了医生按计划施行角膜移植手术，做好充分的术前准备，避免由于种种原因而造成的角膜浪费。从理论上看，理想的角膜保存方法应该是用最简单的技术，保持角膜组织最...     

深低温长期保存角膜移植

目的　探讨深低温长期保存角膜在临床角膜移植术中的应用价值。方法　应用深低温保存 2 0天～48(平均 2 3± 12 .6 )个月的角膜 42例 (4 3眼 )穿透性角膜移植术和 4例 (4眼 )板层角膜移植术。结果　术后随访 2～30 (平均 6 .6± 3.8)个月 ,角膜植片透明率 81.2 5 % ,视力显著提高。结论　深低温长期保存角膜具有较好的临床应用价值。     

硫酸软骨素在深低温角膜保存中对内皮细胞的保护作用

为探讨硫酸软骨素（ＣＳ）对深低温保存角膜内皮细胞的保护作用及机理，将牛角膜分成对照组及实验组Ⅰ～Ⅴ，每组６只角膜。对照组用７５％二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）为抗冻剂，实验组Ⅰ～Ⅳ除用７５％ＤＭＳＯ外，还分别加用０５％、２５％、５％及７５％ＣＳ，实验组Ⅴ抗冻剂仅有２５％ＣＳ，没有ＤＭＳＯ。采用程序降温法深低温保存角膜，复温后经组织培养６～８小时检测内皮细胞密度及存活率，测量角膜厚度。结果：抗冻剂中含２５％ＣＳ时，保存的角膜内皮细胞密度及存活率最高，且复温后角膜厚度恢复最快。但仅有２５％ＣＳ，没有ＤＭＳＯ时，保存的角膜看不见内皮细胞结构。经含２５％ＣＳ的抗冻剂保存的人角膜行穿透性角膜移植术后透明率高（５／６，８３３３％），但内皮细胞存活率（８１７％）较牛角膜内皮细胞存活率（９４４％）低。结论：ＣＳ能改善深低温保存的角膜内皮细胞活性。它虽不能代替ＤＭＳＯ，但可增强ＤＭＳＯ的抗冻效果。     

深低温保存角膜行治疗性角膜移植

角膜溃疡或化学伤导致角膜大面积溶解。曾有报导用低温保存角膜行板层角膜移植［１］。我们采用深低温保存的眼球,行板层或全厚板层角膜移植,对保留眼球和日后再施行光学性角膜移植术,具有重要意义。现将我院１９９４年１１月～１９９６年１月对１２例１４眼大面积角膜...     

简化四步法低温保存角膜的实验研究

目的 探索简易安全的冻贮角膜技术。方法 对经典的Ｃａｐｅｌｌａ四步冻贮法的冷冻保护液、降温冷冻速率和复温方法３项关键技术做了全面简化和改进。以台盼蓝和茜素红联合染色评价家兔和人尸角膜内皮细胞存活率（ＥＳＲ）主光镜下内皮细胞形态。结果：优选出“简化四步法”冻贮技术：以２０％人血清白蛋白与２％、４％、６％和７．５％二甲基亚砜配制４种冷冻保护液;角膜分别在４种液体中冷平衡１５ｍｉｎ;在简易降温仪内先以１     

培养角膜缘上皮细胞深低温保存后异体移植实验研究

目的深低温保存培养的角膜缘上皮细胞,复苏后进行异体移植实验,为临床应用提供实验依据。方法将浅层角膜基质载体上培养的角膜缘上皮细胞深低温保存,同时制作兔角膜缘干细胞损伤模型,分别用新鲜培养的角膜缘上皮细胞和冷冻复苏后培养的细胞及角膜基质进行异体移植实验。结果角膜缘上皮细胞能成功地培养于载体上,将培养细胞保存于-196℃的液氮罐中二月,可见深低温保存前后细胞的形态结构及生物学特性无显著差异。异体移植实验显示：新鲜培养的细胞及深低温保存后的细胞异体移植后,模型兔角膜表面逐渐正常上皮化,而角膜基质组异体移植后,角膜表面仍结膜化并可见大量新生血管生长,各项检测结果与培养细胞组相比差异显著（P〈0．05）。结论以浅层角膜基质为载体培养的角膜缘上皮细胞深低温保存后仍具有上皮细胞特性并具有高增殖能力,可用以进行异体移植治疗角膜缘干细胞缺陷的角膜病。     

全眼球深低温冷冻保存的角膜内皮细胞活性评价

目的评价两种全眼球深低温冷冻保存法保存角膜内皮细胞活性的效果,为临床应用长期保存材料行穿透性角膜移植奠定基础.方法将60只兔眼球随机分为两组,进行全眼球深低温冷冻保存.一组采用前房注气法,二组采用前房注DMSO法.每组再随机分为3个小组,分别保存7d、30d、60d.通过角膜厚度测量、角膜内皮细胞电镜检查及角膜内皮细胞活性染色,判定两种方法保存的角膜内皮细胞的活性状态.结果①角膜中央厚度前房注气组在复温结束后角膜中央厚度比保存前明显增厚(P＜0.01),7d、30d、60d组保存前角膜中央厚度分别为399.6±26.7μm、406.0±31.6μm、404.8+40.7μm,复温后分别为511.6±69.5μm、515.3±45.7μm、506.2±31.4μm.前房注DMSO组在复温结束后角膜中央厚度比保存前明显变薄(P＜0.01),7d、30d、60d组保存前角膜中央厚度分别为419.2±30.3μm、419.3±41.8μm、403.7±33.0μm,复温后分别为352.2±32.0μm、362.3±64.3μm、346.2+25.2μm,两组差异具有显著性(P＜0.01).同一种方法不同保存时间的角膜厚度变化无显著差异性.②电镜检查两实验组的角膜内皮细胞超微结构改变程度明显不同.前房注气组电镜下见大面积角膜内皮细胞膜破裂,胞核裸露,核染色质固缩,但无核溶解现象.前房注DMSO组电镜下角膜内皮细胞结构完整,细胞器存在,只有少量细胞发生破裂性改变.同一种方法不同保存时间角膜内皮细胞的超微结构改变基本相似.③活性染色前房注气组显示角膜内皮细胞广泛破坏,测不出角膜内皮细胞存活率.前房注DMSO组显示角膜内皮细胞大小均匀,边界清楚,保存7d、30d、60d后,角膜内皮细胞存活率分别为(88.0±6.3)%、(84.8±6.6)%、(86.1±5.7)%,差异无显著性. 结论1.前房注DMSO法深低温保存全眼球可长期保持角膜内皮细胞活性,具备了临床用于穿透性角膜移植手术的条件.2.前房注气法深低温保存全眼球角膜内皮细胞活性基本破坏,不适用于穿透性角膜移植手术.     

兔角膜内皮細胞體外原代培養及形熊學觀察

目的研究培養兔角膜内皮細胞,為實驗提供基礎.方法通過改良的細胞收獲、培養技術,在體外進行兔角膜内皮細胞的培養,細胞的類型由電鏡證實.觀察hEGF不同時間點對角膜内皮細胞生長狀態的影響.結果未加入任何促細胞分裂劑的情况下,細胞在體外生長良好,約一周左右形成密集狀態,形態類似天然細胞,經倒置顯微鏡和電鏡證實為角膜内皮細胞.在有hEGF存在時,細胞生長迅速,3-4天形成單層,各個時間點EGF組的細胞數高于對照組.結論該技術可為角膜内皮細胞的研究提供較多的純内皮細胞.     

建立在体角膜内皮细胞损伤后再生动物模型的实验研究

目的探讨建立在体角膜内皮损伤动物模型的方法及其损伤后再生的潜能。 方法选取2周龄的正常六角龙鱼30只。采用数字表法随机分为正常观察组、NaOH损伤组及机械损伤组,各10只。采用活体共聚焦显微镜检查、组织病理学检查、茜素红-曲利苯蓝内皮染色和氯化金角膜神经染色等方法观察。对正常观察组六角龙鱼,观察其眼球和角膜正常结构;通过NaoH溶液和器械两种方法损伤角膜内皮层,建立角膜内皮细胞损伤模型,观察其角膜内皮细胞再生的情况。对4个时间点角膜内皮细胞的密度进行正态性检验和方差齐性检验,使用重复测量方差分析对不同组别、不同时间点角膜内皮细胞密度的均值进行比较,事前进行Mauchly球形检验,如果检验结果显著,采用多元方差分析,否则选用校正自由的F检验。 结果六角龙鱼角膜厚度约为(75.75±7.51)μm,角膜上皮细胞层较厚,约占角膜厚度的一半。经NaoH溶液和器械两种方法损伤其角膜内皮细胞后,六角龙鱼角膜内皮细胞密度明显降低。NaoH损伤组和机械损伤组在不同时间点,六角龙鱼角膜内皮细胞密度的比较,具有统计学意义(F＝31.38,51.77;P<0.05)。而各个时间点间的差异,两组均无统计学意义(F＝1.37,2.67,0.70,4.14;P>0.05)。在损伤后3 d时,NaoH损伤组六角龙鱼角膜内皮细胞的密度为(128±14)个/mm²,机械损伤组为(113±11)个/mm²。与损伤前比较,其角膜内皮细胞密度的差异均有统计学意义(t＝19.39,8.78;P<0.05);在损伤后7 d时,NaoH损伤组六角龙鱼角膜内皮细胞的密度为(157±20)个/mm²,机械损伤组为(169±19)个/mm²。与损伤后3 d时比较,其角膜内皮细胞密度均有所恢复,差异均有统计学意义(t＝3.75,8.07;P<0.05);在损伤后14 d时,可见NaoH损伤组六角龙鱼角膜内皮细胞的密度为(198±17)个/mm²,机械损伤组为(223±17)个/mm²。与损伤后3 d时和7 d时比较,均有明显恢复,差异均有统计学意义(t＝10.05,8.07;P<0.05)和(t＝4.94,6.70;P<0.05)。随着时间延长,两组六角龙鱼角膜内皮细胞的密度均逐渐恢复。在伤后14 d时,其角膜内皮细胞形态、大小和密度均基本恢复正常状态。 结论使用NaoH溶液和器械两种方法均可成功建立六角龙鱼角膜内皮细胞损伤的动物模型。初步观察结果表明,其角膜内皮细胞具有一定的再生潜能。此方法可为角膜内皮细胞损伤后再生研究提供一种新的动物模型。     

兔角膜器官培养保存与应用的研究

目的探讨建立角膜器官培养保存的方法、保存后角膜的特性及其用于移植的可行性。方法选用特定的胎牛血清保存液,密闭保存36只成年新西兰兔角膜于32％恒温箱中;在保存后1～4周的不同时间点,将角膜从保存液取出转入高渗透压的脱水液中脱水48h备用;而后对比保存前后角膜内皮细胞密度、角膜厚度变化,并观测角膜内皮组织学特性和保存中污染情况;器官培养保存后的兔角膜做同种异体穿透性角膜移植,观测术后1周内植片情况;使用荧光标记的抗MHC-Ⅱ分子抗体标示保存后的角膜中树突状细胞,观测其分布和保存后变化特点。结果成功建立了角膜器官培养保存方法,保存中角膜的污染率约8．3％;保存4周内的兔角膜脱水后均透明;保存第3周时,角膜后弹力层周边区有细小皱褶;保存第4周时,全角膜有明显皱褶;器官培养保存的兔角膜内皮细胞密度随保存时间延长而下降,保存4周后兔角膜内皮细胞密度平均下降15．7％;兔角膜厚度随保存时间延长而增加,保存第4周时,角膜中央厚度可达0．7mm;组织学观察可见角膜内皮细胞与后弹力层贴附紧密;树突状细胞分布于角巩膜缘上皮层,保存至第3周时全部消失;同种异体角膜移植术后7d内植片透明,无原发失败。结论本研究建立的角膜器官培养保存方法可使保存的角膜在一定时间内维持活性,角膜的免疫原性下降。     

骨髓间充质干细胞移植治疗眼表损害的初步实验研究

目的观察体外培养的人骨髓间充质干细胞（hMSCs）移植到碱烧伤的兔角膜表面后,干细胞的成活、迁移和分化情况。方法采用NaOH溶液制作兔角膜碱烧伤模型,1个月后将培养有hMSCs的羊膜缝合到碱烧伤的兔角膜表面,以羊膜作为对照组,在裂隙灯显微镜下观察角膜的临床改变。术后1个月,摘除眼球,石蜡切片,苏木素-伊红（HE）染色观察角膜组织结构的变化,并进行抗人核抗体和细胞角蛋白12（CK12）的免疫组化染色以观察hMSCs的分布和分化情况。结果兔眼碱烧伤1个月后,角膜表面和基质层均可见大量血管,角膜呈瓷白色混浊,表面粗糙干燥,出现大量杯状细胞。hMSCs移植1个月后,角膜表面粗糙程度减轻,新生血管略有减少,但是角膜混浊未见明显改善,角膜表面杯状细胞消失;角膜表面和基质浅层存在抗人核抗体染色阳性的细胞;角膜表面细胞CK12染色阳性,而基质层未见CK12阳性细胞。对照组在羊膜移植1个月后,角膜状况较移植前无明显改善,角膜表面仍可见杯状细胞,角膜各层均未见抗人核抗体和CK12染色阳性的细胞。结论hMSCs移植到碱烧伤兔角膜表面后,能够成活并向角膜基质迁移,未发生移植排斥反应。hMSCs由于所在部位不同,可以在周围组织的诱导下向不同方向发生分化,角膜表面的细胞向角膜上皮细胞分化。而基质层中的细胞未分化为角膜上皮细胞。移植后角膜表面结膜化程度有所减轻。     

培养的兔角膜缘上皮细胞深低温保存后的生物学活性研究

目的探讨深低温保存角膜缘上皮细胞的可行性和效果。方法将兔角膜缘组织培养出的细胞,分别用两组冷冻保护液冻存,0.5、1、2个月后分批取出。将未冷冻的细胞和不同冻存时间、不同冻存保护液的冷冻复苏后细胞传代培养,采用免疫组化、电镜鉴定培养后细胞的性质。通过倒置显微镜、电镜、MTT比色法来比较传代培养的角膜缘上皮细胞深低温保存前后的形态结构和生物学活性。结果AE1和传代细胞鼠抗兔增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体染色呈阳性反应,AE5单克隆抗体染色偶见阳性反应;冻存后的传代细胞贴壁、生长均滞后,而且电镜检查均有不同程度细胞水肿,再培养7d后形态结构均恢复正常;MTT法检测复苏当天冻存后的细胞比未冻存的细胞增殖活性低,差异显著(P<0.05,但培养5d后无显著差异(P>0.05),甘油组和DMSO组间有显著性差异(P<0.05),不同冻存时间的各冻存组测得值无显著差异(P>0.05)。结论冻存的角膜缘上皮细胞传代培养仍保持上皮细胞特性并含有干细胞;DMSO保护液比甘油液低温保存效果好;角膜缘上皮细胞经阶段降温后深低温保存简单可行,选择适当的冷冻保护剂冻存后的细胞再培养,其细胞活性和结构与原代相似。     

实验性角膜新生血管形成的形态学研究

采用氢氧化钠灼伤角膜方法，诱导２０只兔眼角膜新生血管形成，并对其发生、发展过程进行裂隙灯显微镜、光镜和透射电镜观察。结果发现，伤后８小时，角膜缘组织已有中性粒细胞浸润等明显急性炎症变化；渗出于血管外的中性粒细胞胞质内吞噬溶酶体异常丰富。在伤后２天，角膜缘才出现新生血管芽，角膜新生血管周围可见中性粒细胞浸润及其崩解产物。提示白细胞，特别是中性粒细胞，参与角膜新生血管形成过程，并可能起介导作用。