tau蛋白的直接细胞毒作用

结果发现,在瞬时转染的293T细胞中GFP全细胞分布,而GFP-tau主要定位于胞浆。tau的过量表达可引起细胞形态改变,如突触减少或消失,细胞分裂受阻及多核巨细胞的形成等,最后导致细胞死亡。在稳转细胞中,tau蛋白的过度表达可诱导细胞出现凋亡的特征性改变。在培养细胞的上清液中加入纯化的tau蛋白,可直接诱导细胞的凋亡。在原代培养的神经细胞中加入纯化的tau蛋白还可以上调内质网应激标志性蛋白CHOP的表达。上述结果提示,非修饰的tau蛋白有直接的细胞毒作用。     

自噬参与神经细胞中过表达tau和异常磷酸化tau蛋白的降解

目的观察自噬对神经细胞内源性tau、过表达tau和异常磷酸化tau蛋白水平的影响,探讨不同形式tau蛋白降解的可能机制。方法体外培养小鼠神经瘤母细胞株N2a和敲除Atg5基因的小鼠胚胎成纤维细胞株MEF,分别转染GFP-tau质粒,并用蛋白磷酸酯酶抑制剂冈田酸(okadaic acid,OA)诱导tau蛋白过度磷酸化,自噬诱导剂雷帕霉素(rapamycin)和溶酶体抑制剂氯化铵(NH4Cl)处理细胞,Western blot法检测tau、磷酸化tau以及自噬相关蛋白LC3和p62的表达;放线菌酮(cycloheximide,CHX)示踪法观察tau和磷酸化tau的降解;GFP-tau和RFP-Lamp1质粒共转染N2a细胞,观察tau和溶酶体的定位;免疫荧光染色和DAB染色观察自噬抑制对表达tau细胞形态的影响。结果与溶媒对照组相比,NH4Cl和rapamycin处理组细胞内源性tau蛋白水平无明显变化;过表达tau的细胞中,NH4Cl能增加tau和OA诱导的磷酸化tau蛋白水平,而rapamycin处理组细胞中tau和磷酸化tau水平降低,尤其是高分子量的磷酸化tau寡聚体明显减少;CHX实验证明自噬抑制能减缓tau和磷酸化tau的降解;tau和溶酶体在细胞内存在共定位;过表达tau的N2a细胞经NH4Cl处理后,胞质中出现大量tau聚集体,细胞核变小、固缩甚至消失。结论自噬参与神经细胞中过表达tau和异常磷酸化tau蛋白的降解,抑制自噬能增加tau的细胞毒作用。     

冈田酸诱导NG108-15细胞tau蛋白过度磷酸化过程中PTEN蛋白水平的变化

目的探讨冈田酸(OA)诱导NG108-15细胞tau蛋白过度磷酸化过程中PTEN蛋白水平的变化。方法20 nmol.L-1OA孵育NG108-15细胞不同时间(0,3,6,12,18,24,36,48 h),倒置显微镜观察细胞形态的变化,免疫印迹法观测各时间点Ser396位点磷酸化tau蛋白及PTEN蛋白水平的变化。结果NG108-15细胞随OA孵育时间的延长逐渐出现细胞胞体变圆,突起回缩,悬浮生长。细胞Ser396位点磷酸化tau蛋白水平于OA作用6 h后显著升高,18 h达高峰,之后逐渐下降,但48 h仍高于基础水平;PTEN蛋白水平于3 h开始上升,18h达高峰,之后逐渐下降,12、18、24 h 3个时间点PTEN蛋白水平显著高于基础水平,36、48 h时间点PTEN蛋白水平与基础值比较差异无显著性。结论OA诱导NG108-15细胞AD样发生中,PTEN蛋白水平可能升高。     

MANF对神经细胞中tau蛋白过度磷酸化的抑制作用

目的观察MANF是否可以抑制冈田酸诱导的N2a细胞中tau蛋白的过度磷酸化,以了解MANF神经保护作用的机制。方法采用体外培养小鼠神经母瘤细胞株N2a,以冈田酸(okadaic aicd,OA)作为诱导剂诱导N2a细胞中tau蛋白过度磷酸化,在加入重组人MANF蛋白干预或转染MANF过表达质粒及siRNA后,用MTT法检测细胞增殖活性的变化,并用AT-8抗体检测tau蛋白ser202/Thr205位点的磷酸化水平变化。结果 N2a细胞在加入重组人MANF蛋白预处理4 h后加入OA诱导24 h后,经Western blot和MTT法检测发现,重组人MANF蛋白能明显抑制N2a细胞中tau蛋白的过度磷酸化,并可促进N2a细胞的增殖活性;在转染MANF过表达质粒后,N2a细胞中OA诱导的过度磷酸化tau蛋白减少,且细胞活性增加;与此相反,转染siRNA下调内源性的MANF的表达则能促进N2a细胞中的tau蛋白过度磷酸化,并抑制细胞活性。结论 MANF可以抑制神经细胞中tau蛋白过度磷酸化,这可能是其发挥神经保护作用的原因之一。     

金钗石斛总生物碱抑制海马tau蛋白的过度磷酸化

目的研究金钗石斛总生物碱(DNLA)对衰老小鼠及痴呆模型大鼠脑内tau蛋白过度磷酸化的影响。方法以SAMP8小鼠作为衰老小鼠模型,SAMR1小鼠作为正常对照,自4月龄始给予DNLA(20和40 mg·kg~(-1)),每天灌胃1次,连续6个月;SD大鼠双侧侧脑室注射链脲佐菌素(STZ)作为痴呆模型,侧脑室注射溶媒大鼠作为正常对照,术后给予DNLA,每天1次,连续28 d。Morris水迷宫及Y迷宫检测各组动物学习记忆功能;HE和Nissl染色观察海马神经元形态及数量;Western印迹法检测海马组织tau蛋白表达及Ser199,Ser396,Ser404,Ser422和Thr231位点的磷酸化水平;GSK-3β蛋白表达及Ser9和Y216位点的磷酸化水平;以及PP2A的蛋白表达水平。结果 DNLA可改善SAMP8小鼠和STZ大鼠的学习记忆功能(P<0.05);减少模型小鼠和大鼠海马组织神经元形态的损伤和数量的丢失(P<0.01);并降低tau蛋白Ser199,Ser396,Ser404,Ser422和Thr231位点的磷酸化水平(P<0.05),提高GSK-3β在Ser9位点的磷酸化水平(P<0.05),对GSK-3β的Y216位点磷酸化、PP2A、总tau蛋白及总GSK-3β的蛋白表达无明显的影响。结论 DNLA对脑内tau蛋白的过度磷酸化的具有抑制作用。     

药物CIG调节tau蛋白磷酸化改善转基因小鼠的tau蛋白病变

目的微管相关蛋白tau在阿尔茨海默病(AD)的发病机制中发挥重要的作用,并且得到了越来越多的关注。过表达P301L突变tau蛋白的rTg4510转基因小鼠具有明显的tau病理表现,广泛应用于AD的基础研究及药理研究中。山茱萸环烯醚萜苷(CIG)为中药山茱萸的有效部位,在我室之前的研究中显示CIG在体外模型中可以降低tau蛋白的磷酸化。方法本研究应用rTg4510小鼠为AD病理模型,给予CIG药物处理3个月后进行行为学检测,之后分别灌注固定取材及新鲜取材。应用Western印迹等方法检测磷酸化tau蛋白、磷酸化调节酶、微管及突触相关蛋白的表达水平;应用免疫荧光等方法观察病理性tau蛋白、微管的形态、突触相关蛋白表达等;应用Serine/Threonine Phosphatase Assay检测磷酸酯酶PP2A的活性。结果 CIG可以增加rTg4510小鼠在Morris水迷宫中的空间和工作记忆,改善在物体识别实验中的物体识别记忆,降低小鼠的过度活跃状态。同时CIG可以改善rTg4510小鼠的脑萎缩,降低海马区域的神经元的丢失;同时CIG可以增加rTg4510小鼠骨架相关蛋白的表达,改善细胞骨架形态;增加小鼠突触NMDA受体及突触相关蛋白的表达,增加突触的数量。其主要的机制为CIG降低了rTg4510小鼠脑内多个位点的磷酸化,降低了病理性tau蛋白的沉积;同时降低了磷酸化的可溶性tau蛋白,降低不可溶性tau蛋白。CIG降低磷酸化的机制,发现CIG可以增加主要的磷酸酯酶PP2A的甲基化修饰,并且可以调节PP2A甲基化调节酶LCMT-1/PME-1的比例。同时,CIG可以增加内源PP2A酶的激活因子PPP2R4的表达,并增加PP2A酶的活性。结论 CIG可以改善rTg4510转基因小鼠的认知能力,改善脑萎缩和神经元的丢失,保护细胞骨架形态和突触。其主要机制为CIG降低了tau蛋白的过度磷酸化及病理性tau蛋白的沉积。进一步研究发现CIG可能通过增加内源性PP2A激活剂PTPA的表达,进而直接或通过调节PP2A的修饰间接地增加PP2A活性。因此本研究提示CIG可能作为一个潜在的以PP2A激活为靶点的抗AD药物。     

阿尔茨海默病与tau蛋白的磷酸化及去磷酸化

本简要介绍了阿尔茨海默病的研究现状以及发病机理和病理学特征，并介绍了作为阿尔茨海默病标志蛋白的tau蛋白的结构、功能，以及其过度磷酸化修饰与阿尔茨海默病发生的关系。同时，总结了近几年来针对细胞内各种蛋白激酶和蛋白磷酸酶在tau蛋白的磷酸化平衡系统中所起作用的最新研究进展，并说明了因蛋白磷酸酶活力缺陷导致的tau蛋白过磷酸化的可逆性。在此理论基础上，扼要介绍了蛋白磷酸酶激活剂在治疗阿尔茨海默病中的研究进展及展望。     

电针对阿尔茨海默病模型大鼠学习记忆及tau蛋白磷酸化的影响

目的 探究电针对阿尔茨海默病（AD）大鼠学习记忆能力改善的情况以及对大鼠海马tau蛋白磷酸化的影响.方法 将雄性SD大鼠30只随机分成正常组、模型组和电针组,每组10只.除正常组外,其余两组侧脑室各注射β淀粉样蛋白多肽片段Aβ25-35制备动物模型.电针组治疗分为3个疗程.以Morris水迷宫来评价大鼠的学习和记忆能力,并且使用Western blot法来检测大鼠海马区Tau蛋白和其丝氨酸198位点、404位点磷酸化水平,利用软件分析测定Western blot图像条带的光密度（OD）值.结果 模型组Morris水迷宫试验逃避潜伏期比正常组长（均P 〈 0.05）,电针组与模型组差异有统计学意义.3个组之间海马区tau蛋白总量的差异无统计学意义,与模型组比较,电针组丝氨酸的198和404位点的tau蛋白磷酸化tau蛋白水平具有降低（均P 〈 0.05）的趋势.结论 电针治疗显著并且能减轻AD大鼠海马tau蛋白磷酸化水平,改善AD模型大鼠学习记忆能力.     

CCR3的缺失导致阿尔茨海默病小鼠模型中β-淀粉样蛋白和过度磷酸化tau蛋白的减少

目的慢性神经炎症可能参与阿尔茨海默病(AD),其特征在于,神经胶质细胞活化和促炎性细胞因子和趋化因子的分泌。趋化因子CCL11已被证明是衰老过程中认知衰退的致病因素,但它是否参与AD的发病却很少被我们所知。在本研究中,我们拟在小鼠模型中回答CCL11及其受体CCR3是否参与AD发病过程的问题。方法我们采用了免疫组化、蛋白印迹和体视学细胞计数等方法来回答上述问题。结果 CCL11特异性受体CCR3的缺失使APP/PS1双转基因小鼠脑内tau蛋白磷酸化,Aβ沉积以及小胶质细胞及星形胶质细胞增生显著降低。结论 CCL11的增加可能是AD的危险因素,并且拮抗CCR3可能给AD带来治疗益处。     

β-淀粉样蛋白对大鼠学习记忆、病理及tau蛋白磷酸化的影响

目的研究大鼠海马区内注射β-淀粉样蛋白（Aβ）的神经毒性,建立阿尔茨海默病（AD）动物模型,探讨Aβ毒性机制。方法选取雌性成年SD大鼠24只,随机分为止常对照组、生理盐水组、AD组,每组8只。Morris水迷宫检测大鼠学习记忆功能,HE染色及B ielschowsk i染色法观察海马神经元形态,免疫组化法观察tau蛋白异常磷酸化变化。结果与正常对照组大鼠相比,AD组大鼠水迷富测试结果明显减退（P〈0.01）;海马CA1区神经元纤维形态紊乱,tau蛋白磷酸化阳性细胞数明显增多（P〈0.01）。结论大鼠海马内注射凝集态Aβ可产生神经毒性作用,能较好地模拟AD行为和病理表现,其神经毒性可能是通过tau蛋白的异常磷酸化起作用。     

基于代谢组学技术研究绞股蓝总皂苷抑制tau蛋白过表达诱导的细胞损伤机制

目的 研究绞股蓝总皂苷(GPs)对tau蛋白过表达细胞代谢的影响,探讨GPs治疗阿尔茨海默病(AD)的机制。方法 通过采用CRISPR/Cas9技术构建微管相关蛋白tau (MAPT)过表达N2a细胞系(MAPT细胞);用CCK-8法检测GPs对N2a、MAPT细胞存活率的影响;体外培养N2a (对照组)、MAPT细胞(模型组),向MAPT细胞中加入GPs (50、100 μg·mL^-1)进行干预,共同孵育24 h后收集细胞,采用Western blotting技术检测总tau蛋白量水平;利用代谢组学技术检测GPs对MAPT细胞内源性代谢产物的影响,明确差异代谢产物及通路。结果 50、100、200 μg·mL^-1 GPs对N2a细胞活力无明显影响;5、50、100、200 μg·mL^-1 GPs对MAPT细胞活力无显著性影响;与对照组相比,MAPT细胞内tau蛋白水平明显增加(P<0.001);与模型组比较,50 μg·mL^-1 GPs可明显减少MAPT细胞内总tau蛋白含量(P<0.05);代谢组学结果显示,按照差异代谢产物数量占比从高到底依次为脂质和类脂分子,有机酸及其衍生物,核苷、核苷酸和类似物等。通过京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析,差异代谢产物主要富集在核苷酸代谢、氨基酸合成、甘油磷脂代谢等通路。与模型组比较,给药后参与甘油磷脂代谢通路的胞磷胆碱和磷脂酰胆碱水平显著增加(P<0.001),甘油磷酰胆碱、甘油-3-磷乙醇胺水平显著降低(P<0.001)。结论 GPs可以减少细胞内tau蛋白的异常过表达,通过增加胞磷胆碱和磷脂酰胆碱水平、减少甘油磷酰胆碱和甘油-3-磷乙醇胺水平调控甘油磷脂代谢通路。     

苯丁酸钠对两种人肝癌细胞抑癌基因表达的影响

乙酰化是一种重要的基因表达调控方式,各种肿瘤的发生往往存在乙酰化的紊乱.去乙酰化酶抑制剂苯丁酸钠(sodium phenylbutyrate,SPB)体外可诱导白血病细胞系和实体肿瘤细胞系发生分化[1～3],但有关SPB对人肝癌细胞的诱导作用以及抑癌基因表达调节的研究国内未见报道.本实验我们对此进行了探讨.     

肝细胞生长因子在LO2细胞表达的实验研究

目的 将肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)真核表达栽体,转染培养的LO2肝细胞,观察其表达。方法 将含肝细胞生长因子cDNA真核表达栽体PEGFP-HCF,脂质体(Lipofectauline)转染培养的LO2肝细胞;PCR鉴定外源基因的导入,绿荧光蛋白检测肝细胞生长因子的表达。结果 (1)重组质粒PEGFP-C1-HGF转染峨肝细胞,5d后,细胞内可检测到绿荧光蛋白。(2)PCR结果显示：转染PEGFP-C1-HGF质粒组可见306bp特征条带与阳性对照大小一样,假转染组与空质粒组无特征条带。结论 人肝细胞生长因子基因真核表达栽体,PEGFP-C1-HGF,能成功转染LO2细胞并获表达。     

苯丁酸钠体外对人肝癌细胞分化、抑癌基因表达的调控

目的探讨苯丁酸钠(SPB)诱导人肝癌细胞Bel-7402生长抑制、分化和细胞周期阻滞,以及对抑癌基因P21WAF1/CIP1、P27表达的影响。方法培养Bel-7402,应用溴化四唑蓝比色法观察SPB对Bel-7402的生长抑制作用,倒置相差显微镜观察细胞形态改变,流式细胞术分析细胞周期,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Bel-7402细胞中P21WAF1/CIP1、P27mRNA表达水平。结果SPB处理后Bel-7402的生长缓慢,处理后的细胞成纤维母细胞样改变,细胞阻滞于G1期(78.8±3.6,50.6±4.0;P<0.05),P21WAF1/CIP1基因表达水平增强(0.08±0.13,0.72±0.14;P<0.05),P27mRNA的表达明显增强(0.09±0.11,0.61±0.12;P<0.05)。结论SPB抑制人肝癌细胞株Bel-7402的生长,诱导人肝癌细胞分化,使细胞阻滞于G1期,SPB诱导抑癌基因P21WAF1/CIP1、P27表达。     

XPD/P44亚复合物对人肝癌细胞的生物学影响

目的:应用P44反义寡核苷酸转染人肝癌细胞SMMC-7721,探讨XPD/P44亚复合物对人肝癌细胞的生物学影响。方法:应用P44反义寡核苷酸转染人肝癌细胞SMMC-7721,同时用未做处理的SMMC-7721作为空白对照。用RT-PCR、Western blot法检测转染P44反义寡核苷酸后细胞内P44,XPD以及cdk7、cdk2、c-myc和cdc25A表达量的变化,并用四甲基偶氮唑盐(MTT)和流式细胞仪检测细胞增殖及其细胞周期的变化。结果:P44基因反义寡核苷酸转染人肝癌细胞SMMC-7721后,人剪切修复基因XPD mRNA及其蛋白的表达量显著减少,同时细胞周期调控基因cdk7、cdk2、c-myc和cdc25A mRNAs及其蛋白的表达量上调,肝癌细胞增殖明显。结论:XPD基因的表达受其分子伴侣P44的调节,XPD的作用需要有P44的参与;XPD/P44亚复合物可能是通过DNA损伤检控点来调控细胞周期的。     

人骨形态发生蛋白—2基因的真核表达载体构建

目的;利用杆状病毒载体,构建可直接转染昆虫细胞Sf9的含人骨形态发生蛋白-2（hBMP-2)基因的重组穿梭载体（bacmidDNA),最终获得重组蛋白。方法：将编码包含hBMP-2 N-端信号肽,中间前肽以及C－端成熟肽共1188bp的cDNA片断,插入真核表达载体pFastBacl的多克隆位点,受控于pPolh启动子,构建成pFastBacl/hBMP-2重组转移载体。重组子转化大肠杆菌DH10Bac。转座后、挑选阳性菌落,提取bacmid DNA,经PCR鉴定后,以重组bacmidDNA转染Sf9细胞。收集重组病毒,扩大转染Sf9,表达产物行SDS－PAGE初步鉴定。结果：获得了含hBMP-2全长cDNA片段的重组bacmid DNA和重组病毒,经SDS－PAGE证实在昆虫细胞中表达了分泌型hBMP-2蛋白,经激光密度扫描仪扫描显示分泌性蛋白表达量占细胞蛋白总量的35．6％。结论：利用杆状病毒载体成功构建了可用于直接转染昆虫细胞而无需同源重组的重组bacmidDNA,并在昆虫细胞中表达了分泌型hBMP-2蛋白。     

苯丁酸钠对人肝癌细胞分化及P~(21WAF1/CIP1)表达的调控

目的:探讨苯丁酸钠诱导人肝癌细胞Bel7402,HepG2生长抑制、分化和细胞周期阻滞,以及对抑癌基因P21WAF1 /CIP1表达的影响。方法:培养Bel7402,HepG2,应用MTT比色法观察苯丁酸钠对Bel7402,HepG2的生长抑制作用,倒置相差显微镜观察细胞形态改变,流式细胞术分析细胞周期,以RTPCR检测Bel 7402,HepG2细胞中P21WAF1 /CIP1基因表达水平,WESTERN印记法检测P21WAF1 /CIP1蛋白的表达。结果:苯丁酸钠 2, 4, 8mmol·L-1处理 72h后Bel 7402, HepG2 的抑制率分别为 28. 43 %,57. 61 %, 71. 32 %和 27. 42 %, 57. 11 %, 70. 31 %处理后的细胞成纤维母细胞样改变,细胞阻滞于G期,P21WAF1 /CIP1基因和蛋白表达水平均增强。结论:苯丁酸钠抑制 2种人肝癌细胞株的生长,诱导部分人肝癌细胞分化,使细胞阻滞于G1期,苯丁酸钠能诱导P21WAF1 /CIP1基因的表达,增加P21WAF1 /CIP1蛋白的表达水平。     

过表达KLF4对棕榈酸所致L6骨骼肌细胞胰岛素抵抗的影响

目的探讨Krtippel样因子4（KLF4）过表达对大鼠L6骨骼肌细胞胰岛素抵抗的影响。方法采用棕榈酸诱导法建立大鼠IJ6骨骼肌细胞的胰岛素抵抗模型,随机分为对照组和转染组。对照组转染腺病毒空载体（Ad）,转染组转染KLF4腺病毒表达载体（Ad—KLF4）。采用Real—timePCR和Western—blot检测两组KLF4、胰岛素受体（IR）和葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）的表达水平,采用葡萄糖氧化酶法检测两组培养液中的葡萄糖浓度。结果与对照组比较,棕榈酸诱导组对葡萄糖的摄取量显著降低（P〈0．05）,KLF4、IR、GLUT4表达显著下调（P〈0．05）。KLF4过表达可显著提高细胞对胰岛素的敏感性,并上调IR、GLUT4表达。结论过表达KLF4可导致IR、GLUT4表达上调,并改善骨骼肌细胞的胰岛素抵抗。     

稳定高效表达人血栓调节蛋白的CHO细胞株的建立

目的:构建稳定高效表达人血栓调节蛋白(human thrombomodulin,hTM)的CHO细胞株,以便于大量生产纯化hTM蛋白。方法:利用脂质体li-pofectamine 2000将包含hTM基因全长序列的重组表达质粒pThr402转染CHO细胞。转染后用G418的选择性培养液筛选、挑取抗性克隆。采用流式细胞术和Western blotting检测hTM在CHO细胞膜表面的表达情况,筛选建立稳定高效表达hTM的CHO细胞株并对其稳定性进行观察。结果:重组表达质粒pThr402转染CHO细胞后,流式细胞术证实hTM稳定高效表达于随机挑选的5个抗性克隆细胞株的细胞膜表面,但表达量有差异。Western blotting分析检测显示hTM表达量较高的CHO-TM1、CHO-TM4与CHO-TM5细胞株的细胞裂解液出现了与预期值相符的约105000的特异性条带。CHO-TM5已经经过冻存复苏前后各20次传代,且无论有无G418选择压力存在,hTM表达水平无明显差异。结论:成功构建了稳定高效表达hTM的CHO细胞株,可望获得大量蛋白,为进一步研究hTM的生物学功能以及制备和筛选抗hTM的单抗开辟新的途径。     

NGF对局灶性脑缺血/再灌注大鼠海马tau蛋白磷酸化作用的影响

目的探讨外源性神经生长因子(NGF)对局灶性脑缺血/再灌注大鼠海马神经元tau蛋白过度磷酸化的影响。方法用线栓法制作局灶性脑缺血/再灌注模型,应用免疫组织化学SABC法、Westernblot和图像分析方法检测大鼠海马CA1区tau蛋白在Ser199/202位点磷酸化程度和总tau蛋白表达,以及NGF对tau蛋白过度磷酸化的影响。结果缺血/再灌注组海马CA1区tau蛋白在Ser199/202位点磷酸化水平和总tau蛋白明显升高(P<0·05);NGF组大鼠海马tau蛋白在Ser199/202位点磷酸化水平明显低于缺血/再灌注组,总tau也下降(P<0·05)。结论NGF明显减轻局灶性脑缺血/再灌注大鼠海马tau蛋白磷酸化程度,降低tau蛋白磷酸化水平可能对缺血神经元起保护作用。