乳牙牙髓干细胞分化前后的外泌体miRNA筛选研究

目的 分析乳牙牙髓干细胞分化前后的外泌体中miRNA差异表达谱。方法 原代提取乳牙牙髓干细胞,在矿化诱导培养基中进行分化。超速离心法提纯外泌体并进行鉴定;利用miRNA基因芯片检测分化前后的外泌体中miRNA的表达谱,验证差异表达的miRNA,预测其靶基因,进行GO分析和KEGG通路的功能分析。结果 在未分化和分化的乳牙牙髓干细胞的外泌体中共发现215个差异表达的miRNA,最相关的KEGG通路为FoxO、Ras和MAPK等信号通路。GO分析包括多细胞生物的发育和结构形态发生的调控。结论 乳牙牙髓干细胞分化前后的外泌体miRNA可能会参加调控成牙本质向分化过程,为牙髓修复提供了理论依据。     

TAG-1与神经干细胞分化的相关性研究

目的研究微环境蛋白TAG-1与神经干细胞分化之间的关系。方法使用免疫荧光染色检测神经干细胞中巢蛋白nestin的表达,并过表达TAG-1后使用实时荧光定量PCR技术分析神经干细胞中分化相关蛋白的表达变化。结果体外培养的神经干细胞中过表达TAG—1以后,干性相关基因nestin和转录因子SOX2（SRY—box2）表达降低,神经元标志物神经元微管蛋白β Ⅲ （neuronalclass Ⅲ β-Tubulin,Tujl）和胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达升高。结论TAG-1可能与神经干细胞的分化存在正相关的关系,其分子调节机制有待进一步研究。     

SVZ神经干细胞分化过程中的Bmp4启动子活性分析

目的　室管膜下层 (Subventricularzone ,SVZ)神经干细胞分化过程中的Bmp4启动子活性分析及其与神经元分化的关系。方法　在构建Bmp4启动子———红色荧光蛋白报告载体基础上转染SVZ神经干细胞 ,动态地观察报告基因在SVZ神经干细胞分化过程中的表达 ,并进行显微计数和神经元标志物流式细胞仪检测。结果　SVZ神经干细胞贴壁分化过程中具有较高的Bmp4启动子活性 ,48h阳性率达到 8.6%,且明显高于皮层神经干细胞。SVZ神经干细胞的Bmp4启动子活性与神经元分化高度正相关 (r =0 .80 5 ,P <0 .0 5 ) ,皮层神经元分化与Bmp4启动子活性相关不明显。结论　采用启动子活体荧光标记 ,能够较好地反映正常情况下内在蛋白的表达情况 ;Bmp4启动子活性与SVZ神经干细胞向神经元的分化高度相关 ,显示Bmp4在SVZ神经干细胞分化过程中的独特作用     

人骨髓间充质干细胞与血管内皮细胞的基因表达差异分析

目的探索人骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化的分子生物学机制及调控靶标。方法应用基因表达谱芯片技术,检测人骨髓间充质干细胞和脐静脉内皮细胞的基因表达差异。结果在检测的3946条基因中,人骨髓间充质干细胞和血管内皮细胞非差异表达基因占84%。差异表达基因中,间充质干细胞高表达283条,低表达344条。这些基因可以划分为5个主要的功能群:①细胞骨架和运动蛋白基因;②细胞受体相关基因;③细胞信号和传递蛋白相关基因;④发育相关基因;⑤蛋白翻译、合成相关基因。结论人骨髓间充质干细胞有潜在的内皮分化能力,分化机制和分化调控与以上五类特异基因的表达有关。     

神经细胞分化中microRNA-134靶基因网络功能分析

目的 检测microRNA-134 在神经细胞分化过程中表达量的变化,分析调控神经分化的分子机制。方法 采用表皮生长因子和成纤维细胞生长因子诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化,实验分为两组：对照组不加任何因子,诱导组加入表皮生长因子和成纤维细胞生长因子。通过形态、免疫组织化学和实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR） 3 种技术鉴定骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的情况,并通 过qRT-PCR 检测microRNA-134 在神经细胞分化中表达量的变化。利用miRWalk、DAVID、STRING和Cytoscape 生物信息学软件分别对microRNA-134 靶基因进行预测,对靶基因进行GO 功能富集分析,筛选与神经分化相关的基因进行蛋白网络功能分析。结果 MicroRNA-134 在神经细胞分化过程中表达量上升,生物信息学分析结果显示 microRNA-134 的靶基因半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3（ CASP3）、整合素 β 亚基 1（ITGB1）、血小板活化因子乙酰水解酶 1b 调控子单元 1（ PAFAH1B1）、蛋白激酶 C（PRKCA）、 膜附着型本体 A（EFNA2）、NK6 同源框 1（NKX6-1）、神经细胞黏附分子（ NRCAM）、突触融合蛋白结合蛋白 1（STXBP1）、钾离子通道相互作用的蛋白2（KCNIP2）、蛋白磷酸酶ABI2、CNTN2 及FOXA1 与神经分化有关。结论 MicroRNA-134 通过作用于靶基因在神经细胞分化中起促进作用。     

DMSO 联合神经营养因子BDNF 诱导BMSCs 向神经样细胞分化

目的：探讨脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）联合二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）诱导骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）向神经样细胞分化的效果,初步检测miRNA-26a 在神经细胞分化过程中的表达量变化。方法：从大鼠股骨抽取骨髓分离BMSCs,DMSO 对其预诱导,随后用含BDNF 的神经细胞培养基培养BMSCs,诱导其分化为神经细胞。免疫组化鉴定分化神经元样细胞特异标记物：神经元特异烯醇酶（neuron specifi c enolase,NSE）。实时定量PCR 法检测神经分化前后酪氨酸磷酸酶蛋白（tyrosine phosphatase protein,PTEN）基因/mTOR 和miRNA-26a 的表达变化。结果：100 ng·mL-1 BDNF 联合3% DMSO 可诱导BMSCs 向神经元样细胞分化,分化后神经细胞标志物NSE 蛋白表达呈阳性,且神经分化过程中miRNA-26a PTEN/mTOR 的含量明显上调。结论：3%DMSO 和 100 ng·mL-1 BDNF 的混合诱导剂可诱导大鼠BMSCs 向神经元样细胞分化,而miRNA-26a 可能通过PTEN/mTOR 调节神经分化。     

人胚胎干细胞向下丘脑神经祖细胞的诱导分化受高雄激素影响

目的：研究体外诱导人胚胎干细胞（human embryonic stem cell,hESC）向下丘脑神经祖细胞分化,并以此为细胞模型,观察不同浓度雄激素对下丘脑神经祖细胞分化的影响。方法：鉴定hESC细胞株CCRM22,体外诱导CCRM22向下丘脑神经祖细胞分化,对其进行初步的细胞生物学鉴定;在分化培养基中添加1×10-8mol/L、1×10-7mol/L睾酮（以无水乙醇为助溶剂对照）,收集不同分化时期细胞,比较分化效率;利用RT?qPCR、流式细胞术、免疫荧光检测等方法鉴定分化细胞,并检测生殖功能调控相关基因的表达。结果：CCRM22分化为下丘脑神经祖细胞的效率超过85%,但睾酮处理降低其分化效率;分化细胞表达神经细胞标志物NESTIN以及下丘脑神经祖细胞特异性标志物NKX2.1,同时表达KISS1和雄激素受体（androgen receptor,AR）,且AR的表达水平与睾酮浓度呈正相关。结论：成功诱导hESC分化形成下丘脑神经祖细胞,高浓度睾酮处理抑制hESC向下丘脑神经祖细胞分化,该细胞模型可应用于后续体外研究多囊卵巢综合征女性孕早期高雄激素环境对后代下丘脑神经细胞分化和发育的影响。     

非甾体类消炎药双氯芬酸抑制间充质干细胞向肌腱细胞增殖分化的研究

目的 探讨NSAIDs对间充质干细胞向肌腱细胞增殖分化过程的影响。方法体外建立鼠间充质干细胞系C3H10T1/2的肌腱细胞分化模型;CCK-8比色法分别检测双氯芬酸(diclofenac,DF)对间充质干细胞增殖的影响;用生长分化因子-7(growth differentiation factor,GDF-7)诱导鼠间充质干细胞系C3H10T1/2分化为肌腱细胞;PCR检测间充质干细胞分化过程中肌腱细胞相关基因(腱调蛋白、胶原蛋白)的表达。PCR分别检测DF对间充质干细胞分化过程中相关基因[腱调蛋白、脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(aP2)]表达的影响。结果成功建立鼠间充质干细胞系C3H10T1/2的肌腱细胞分化模型;DF高浓度时明显抑制间充质干细胞增殖(24 h:t=2.357,3.524,P0.05。72h:t=3.217,3.592,P0.05);GDF-7成功诱导鼠间充质干细胞系C3H10T1/2分化为肌腱细胞,肌腱细胞相关基因表达明显增加(腱调蛋白:t=124.107,P0.05;Ⅰ型胶原蛋白α_1:t=38.107,P0.05);DF对间充质干细胞分化过程中抑制了肌腱基因的表达(DF:腱调蛋白:t=31.758,P0.05),增强了脂肪相关基因的表达[(DF:脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(aP2):t=97.735,P0.05)]。结论高浓度时DF抑制间充质干细胞增殖,改变间充质干细胞分化方向,不利于肌腱细胞再生修复。     

人骨髓间充质干细胞定向内皮分化前后 miRNA的表达差异分析

目的 探讨人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cell, hBMSC)定向内皮分化前后miRNA的表达差异分析,为进一步研究其调控hBMSC内皮分化的分子机制奠定理论基础。方法 根据hBMSC定向血管内皮诱导分化培养方法培养细胞,应用电子显微镜观察细胞分化前后形态的变化,应用细胞免疫荧光法检测内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)的蛋白质表达情况,应用高通量测序分析检测细胞分化前后miRNA表达谱的改变,应用qRT-PCR 验证两组中表达差异明显的miRNA分子。结果 与未分化组hBMSC比较,分化后的细胞形态发生类内皮细胞样改变;eNOS 蛋白的表达明显增加;分化后hBMSC共筛选41个差异性表达的miRNA,其中表达上调的有27个,表达下调的有14个;分化组细胞miR-31-5p上调近21倍,miR-200a-3p下调近15倍。结论 hBMSC定向内皮分化前后miRNA表达发生差异性改变,其改变可能影响干细胞的分化程度,可为进一步研究干细胞在血管内皮功能异常所致的血管性疾病异常机制提供研究方向和理论支持。     

神经干细胞分化过程中NgR表达的变化

目的 检测大鼠脊髓来源神经干细胞分化过程中NgR的表达情况.方法 悬浮培养法培养大鼠脊髓来源的神经干细胞,形成神经球后,以免疫荧光法鉴定神经干细胞,检测神经球及其分化后不同时间点、不同细胞亚型的NgR表达情况.结果 神经干细胞分化前和分化第1天所有细胞都显著表达NgR,NgR表达阳性率在分化第2天降至82.1%±4.14%,分化第3天降至最低点35.3%±4.31%.分化后形成的细胞中只有神经元和少量未分化细胞表达NgR,星形胶质细胞和少突胶质细胞不表达NgR.结论 在神经干细胞分化成星形胶质细胞和少突胶质细胞的过程中NgR基因表达被关闭,而在其分化成神经元的过程中则始终表达NgR.     

神经干细胞分化过程中Eph/ephrin A3的表达及意义

目的探讨海马源性神经干细胞在分化过程中Eph/ephrin A3通路的表达及其意义。方法神经干细胞提取自新生大鼠的海马区,经分离培养及鉴定,用免疫组化方法检测在神经干细胞分化过程中促红细胞生成素肝细胞受体A3(Eph A3)及其配体ephrin A3的表达情况。结果Eph A3表达于神经干细胞的胞质,随着神经干细胞的分化,Eph A3在胞质中的表达稍有减弱;ephrin A3逐渐在分化细胞的胞质和胞膜中出现并且表达增强。结论在神经干细胞的增殖及分化期存在Eph/ephrin A3通路的表达,二者的跨膜信号传导在神经细胞突起的生长中发挥着一定作用。     

全反式维甲酸诱导中脑神经干细胞向多巴胺能神经元分化的作用

目的：观察全反式维甲酸（all-trans retinoic acid,ATRA）体外对大鼠中脑神经干细胞（neural stem cells,NSCs）的诱导分化作用及其可能的分子机制。方法：分离培养孕14～15 d大鼠中脑NSCs,使用1.0μmol/L ATRA诱导1、3、5和7 d,以免疫组织化学染色观察ATRA对NSCs分化为多巴胺能神经元的影响;RT-PCR分析维甲酸（retiadic acid,RA）各受体表达情况。结果：ATRA诱导后多巴胺能神经元特异性酪氨酸羟化酶（TH）染色呈阳性,细胞有多个细长突起,与对照组比较,诱导7 d后多巴胺神经元特异性TH染色阳性细胞率均明显升高（P〈0.01）;各诱导组RA受体βmRNA的表达量均明显升高（P〈0.01）,而且存在时间依赖性。结论：ATRA能显著提高NSCs分化为多巴胺能神经元的比例,同时发现细胞维甲酸A受体（RAR）βmRNA表达增加,RARβ激活可能促进NSCs向多巴胺神经元方向的分化。     

胞嘧啶脱氨酶基因修饰神经干细胞及其表达的离体实验研究

目的 探讨胞嘧啶脱氨酶(cytimidine deaminase，CD)基因修饰神经干细胞及其基因表达。方法 通过构建真核表达质粒pCMVCD，限制性内切酶消化鉴定后，采用Lipofectamine 2000脂质体介导法转染新生大鼠室管膜下区神经干细胞(Neural stem cells，NSCs)，G418筛选阳性克隆，加入不同浓度的5-氟胞嘧啶(5-Flourocytosine，5-FC)，MTT比色法测定NSCs的生存率。结果 本实验成功地培养并鉴定了神经干细胞，并将CD基因成功地转染了神经干细胞，G418阳性NSCs对低浓度5-FC高度敏感。结论 CD基因修饰神经干细胞的离体实验研究为干细胞治疗研究提供依据。     

脊髓损伤后m6A甲基化修饰在神经干细胞自发分化中的调控作用

目的探讨脊髓损伤后mRNA m6A甲基化修饰对神经干细胞自发分化的调控作用。方法8周龄C57小鼠构建脊髓钳夹损伤模型,采用后肢运动功能评分（basso mouse scale, BMS）评价小鼠脊髓钳夹损伤模型构建情况;脊髓组织冰冻切片免疫荧光染色检测脊髓损伤1、3d后,损伤位点周围神经干细胞的数量及m6A甲基化水平;microRNA干扰技术敲低神经干细胞内的METTL14蛋白表达,并利用细胞免疫荧光检测神经干细胞自发分化后,神经元细胞、少突胶质细胞及星形胶质细胞数量;Western印迹法及Northern印迹法检测髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein, MBP）与神经干细胞共培养后神经干细胞内METTL3、METTL14、FTO及ALKBH5蛋白表达情况及细胞内m6A甲基化水平。结果BMS评分结果表明小鼠脊髓钳夹损伤模型构建成功。免疫蛋白印迹结果显示,脊髓损伤后组织内脊髓损伤后星形胶质细胞的细胞标志蛋白GFAP显著增加,神经元标志蛋白NeuN和少突胶质细胞标志蛋白MBP表达显著降低。组织免疫荧光结果表明,损伤早期受损位点周围神经干细胞标志蛋白NESTIN达量增加,但m6A水平减少。细胞免疫荧光结果表明,m6A甲基化水平降低可促进神经干细胞神经向星形胶质细胞的自发分化。免疫蛋白印迹结果显示,MBP处理神经干细胞可使细胞内METTL3/METTL14表达量及细胞整体m6A甲基化水平降低。结论脊髓损伤后mRNA m6A甲基化降低可促进神经干细胞向星形胶质细胞分化。     

神经干细胞的命运决定机制及其靶点调控的研究进展

神经干细胞（neural stem cells, NSCs）是哺乳动物神经系统中神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞的分化来源。近年来对于NSCs的增殖与分化机制及其在临床治疗神经退行性疾病的研究在世界范围内引起了学者们的极大兴趣。多种细胞调节因子存在于微环境中共同调节NSCs的自我更新、迁移及分化。其中Notch通路,NF-κB通路与Wnt通路尤其作为NSCs发育中的“命运决定者”而受到广泛的关注。它们中的每条通路均具有独自控制分化与增殖的能力。本文针对Notch通路、Wnt通路以及NF-κB通路对NSCs增殖与分化的作用机制进行了归纳与阐述,对其中潜在的药物作用靶点与目前最新的内、外源化合物对NSCs增殖与分化的作用进行了总结,希望对今后神经再生方面的研究提供理论指导。     

RNAi技术在神经干细胞相关基因功能研究中的应用

目的:采用RNA干涉(RNA interference,RNAi)技术研究神经干细胞相关基因-AF116909在神经干细胞中的作用。方法:构建含AF116909目的基因特异序列的发夹结构RNA(small hairpin RNA,shRNA)表达载体,转染到神经干细胞(NSCs)后,观察神经干细胞的形态,并进行RT-PCR检测mRNA表达。结果:经观察,试验组分化明显加强,从3d的(12±1.5)%分化率增加到11d的(80±3.1)%,而对照组几乎无分化现象。RT-PCR检测后,发现试验组中AF116909基因mRNA的表达量同对照组相比明显减少。结论:该方法实现了AF116909基因在NSCs中的有效抑制,并表明,抑制AF116909基因的表达,提高了NSCs的分化率,反应该基因具有抑制NSCs分化的功能。     

全反式视黄酸对新生大鼠纹状体神经干细胞向神经元样细胞分化的作用

目的 观察全反式视黄酸(atRA)体外对神经干细胞(NSCs)的诱导分化作用及其可能的分子机制。方法 分离培养新生大鼠纹状体NSCs;以免疫组织化学染色观察不同浓度atRA对NSCs分化的影响;RT-PCR分析视黄酸受体表达情况。结果 atRA诱导NSCs向神经元方向分化,其作用在一定范围内呈剂量依赖性,诱导剂量以1.0μmol/L较为适宜。NSCs的RARβ基因的表达对atRA存在剂量依赖性和时间依赖性。结论 atRA诱导NSCs向神经元方向分化,此作用与atRA上调细胞的RARβ基因转录水平有关。     

全反式视黄酸对新生大鼠纹状体神经干细胞向神经元样细胞分化的作用

目的观察全反式视黄酸（atRA）体外对神经干细胞（NSCs）的诱导分化作用及其可能的分子机制。方法分离培养新生大鼠纹状体NSCs；以免疫组织化学染色观察不同浓度atRA对NSCs分化的影响；RT-PCR分析视黄酸受体表达情况：结果atRA诱导NSCs向神经元方向分化，其作用在一定范围内呈剂量依赖性，诱导剂量以1．0pmol／L较为适宜。NSCs的RARβ基因的表达对atRA存在剂量依赖性和时间依赖性。结论atRA诱导NSCs向神经元方向分化，此作用与atRA上调细胞的RARβ基因转录水平有关。     

体外诱导人胚胎干细胞定向分化为神经干细胞

目的:探讨体外定向诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)生成高纯度神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方法.方法:模拟体内神经细胞分化发育的不同阶段及微环境,分三阶段诱导hESCs定向生成NSCs.形态学观察结合免疫荧光细胞化学、流式细胞术和RT-PCR检测胚胎干细胞标志和神经干细胞标志;NSCs分化实验对所诱导的NSCs的分化潜能进行检测.结果:体外培养的hESCs在胚胎成纤维细胞饲养层上连续传代培养50代,仍保持SSEA-4,TRA-1-81阳性,表达Nanog基因,流式细胞术检测SSEA-4阳性表达率为83.44%;经三步法最终可诱导形成纯度高达90%以上的nestin阳性细胞,表达nestin基因,流式细胞术检测nestin阳性表达率为89.38%;诱导生成的细胞反复传代,仍表现为nestin阳性,并可进一步分化为神经元、星形神经胶质细胞和少突胶质细胞.结论:模拟体内神经分化过程的三步诱导法,可诱导hESCs生成较高纯度的NSCs,并能较好维持其干细胞特性和具有进一步分化的能力.     

Id2在SVZa神经干细胞向神经元分化中的作用

目的研究DNA结合抑制物2(inhibitor of DNA binding2,Id2)在室管膜前下区(anteriorsubventricularzone,SVZa)神经干细胞向神经元分化中的作用。方法体外分离培养P0昆明小鼠SVZa神经干细胞,正义Id2、反义Id2真核表达质粒转染SVZa神经干细胞,采用流式细胞仪检测在Id2作用下SVZa神经干细胞分化为神经元的比例。采用Western blot检测不同浓度的骨形成蛋白2(bonemorphogenenticprotein2,BMP2)诱导下Id2蛋白的表达变化。结果正义Id2真核表达质粒转染组,SVZa神经干细胞分化为神经元的比例小于空白对照组,反义Id2真核表达质粒转染组,SVZa神经干细胞分化为神经元的比例明显高于空白对照组;随着BMP2浓度的增加,Id2的表达增加。结论Id2抑制体外培养的P0SVZa神经干细胞向神经元方向分化,BMP2可以促进SVZa神经干细胞Id2的表达,它们共同参与调控SVZa神经干细胞向神经元分化的过程。