超声辅助转基因治疗缺血性心脏病的骨髓间充质干细胞的实验研究

目的血管内皮生长因子（VEGF）基因转染骨髓间充质干细胞,探讨骨髓间充质干细胞定向分化血管内皮细胞的可行性研究。方法VEGF165基因的质粒PEGFP-C1,采用超声辅助电穿法转染骨髓间充质干细胞,转染后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）表达情况。结果超声辅助转染后5h可见细胞内有GFP表达,10h后出现表达高锋,持续3d左右,其后有些细胞荧光开始减退。结论VEGF基因转染骨髓间充质干细胞后,骨髓间充质干细胞内有GFP表达,提示细胞转染成功,骨髓间充质干细胞定向分化为血管内皮细胞具有可行性。     

VEGF165在恒河猴骨髓间充质干细胞中的表达及鉴定

目的 探讨血管内皮生长因子（VEGF165）转染恒河猴间充质干细胞（MSCs）后的表达情况, 以及转染后对 MSCs 功能的影响。 方法 通过 Ficoll 法分离并培养恒河猴骨髓 MSCs, 进行细胞表型鉴定。 转染 pcDNA-eGFPVEGF165至 MSCs, 荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白（eGFP）表达情况, 同时流式细胞技术对转染成功的细胞进行细胞表型及 eGFP 表达鉴定, RT-PCR 法检测转染后 VEGF165表达情况。 结果 成功分离到纯度较高的 MSCs, 转染后的 MSCs 及子代细胞均有 eGFP 和 VEGF165 的表达, 且保留了 MSCs 的特性。 结论 VEGF165 基因转染 MSCs 后可以稳定表达外源基因, 且可以维持 MSCs 的特性。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞为血管内皮细胞的研究

目的研究骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）定向分化为血管内皮细胞，为组织工程血管化及细胞移植修复损伤组织提供理想的细胞来源。方法贴壁法分离SD大鼠MSCs进行体外培养和连续传代，采用第四代MSCs，以血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth facotr，bFGF）进行体外诱导，免疫荧光染色方法鉴定内皮细胞，并通过透射电镜观察内皮细胞W-P小体。结果免疫荧光染色证实实验组细胞阳性表达，透射电镜观察到内皮细胞特有的WP小体。结论MSCs可以在体外定向分化为具有血管内皮细胞特性的细胞。     

慢病毒介导HO-1基因转染猪骨髓间充质干细胞的表达

目的探讨重组血红素氧合酶1(HO-1)基因体外转染猪骨髓间充质干细胞(MSCs)应用于基因治疗的可行性。方法体外分离、培养并鉴定MSCs。采用具有高效转染非分裂期细胞的慢病毒载体系统将HO-1基因导入MSCs中;采用RT-PCR和绿色荧光蛋白(GFP)荧光技术检测目的基因的表达,台盼蓝染色及MTT法检测转染后细胞的增殖能力。结果慢病毒感染MSCs的感染复数为20,最佳感染率可达80%;MSCs表面高表达CD44和CD105;GFP荧光表达自96h开始逐渐增强;转染细胞中显示目的基因mRNA的表达;转染对MSCs存活及增殖几乎无影响。结论慢病毒载体可成功转染猪MSCs,并使其HO-1表达增高,转染对MSCs存活及增殖基本无影响。     

PDGF-B 基因转染骨髓间充质干细胞的实验研究

目的:探讨血小板源性生长因子-B(PDGF-B)基因转染修饰大鼠骨髓间充质干细胞(bone m arrow m esenchym alstem cell,M SC)的可行性。方法:应用FAM标记重组真核表达载体系统(pcDNA3-PDGF-B),以脂质体法转染原代骨髓间充质干细胞,观察转染结果、表达情况及对靶细胞活力的影响。结果:经荧光显微镜下观察证实:成功地对骨髓间充质干细胞实现了基因转染,持续表达时间超过了8周,没有发现明显的细胞毒作用及对细胞活力的显著影响。结论:采用真核转染技术可以介导外源基因转染骨髓间充质干细胞,M SC是一种理想的基因载体细胞,可用于PDGF-B的基因治疗。     

AKT1基因过表达骨髓间充质干细胞的建立

目的 使用慢病毒系统建立AKT1基因过表达的稳转骨髓间充质干细胞.方法 扩增AKT1 cDNA基因,并构建AKT1-cDNA表达载体,再结合穿梭质粒pCDH1-AKT1转染人胚肾293T细胞进行扩增后,使用慢病毒转染系统进行基因重组,并以其为载体转染猪的骨髓间充质干细胞,观察其荧光表达,采用Western blot和RT-PCR分别检测AKT1蛋白和mRNA表达水平.结果 双酶切鉴定和测序结果表明,所获取的cDNA为AKT1的蛋白质编码功能区基因.293T细胞和骨髓间充质干细胞的转染效率均达到90％以上.Western blot和RT-PCR结果表明,稳转细胞的AKT1蛋白和mRNA表达水平均明显高于原代细胞.结论 成功构建AKT1-cDNA表达载体;通过使用慢病毒系统,猪骨髓间充质干细胞能长期稳定过表达AKT1.     

骨内应力环境下复合血管内皮生长因子骨髓基质干细胞修复创伤性股骨头坏死的实验研究

目的探讨骨内应力对转染VEGF基因的骨髓间充质干细胞修复创伤性股骨头坏死的作用。方法设计制作能骨内加压的空心螺钉,骨髓间充质干细胞培养并转染VEGF基因,20只实验犬通过手术截断股骨颈方法造模,根据术后不同的处理方法分为四组:A组(单纯空心螺钉固定);B组(空心螺钉加人工骨填塞);C组(空心螺钉加复合转染VEGF的骨髓间充质干细胞的人工骨填塞);D组(空心螺钉加复合转染VEGF的骨髓间充质干细胞的人工骨填塞,同时加压)。造模20周后,行大体观察、X线及组织学、免疫组化及Western blot检测骨修复效果。结果通过手术方式成功制作出创伤性股骨头坏死的动物模型;在造模20周后,D组血管计数和VEGF的蛋白含量明显高于其他三组(P<0.05);C组血管计数和VEGF的蛋白含量高于A组和B组,有显著性差异(P<0.05),低于D组比较有显著性差别(P<0.05);A组和B组血管计数和VEGF蛋白水平远低于C组和D组,差异有统计学意义(P<0.05)。A组和B组血管计数和VEGF蛋白水平之间的差异无统计学意义(P>0.05)。结论骨内加压能显著提高转染VEGF的骨髓间充质干细胞对创伤性股骨头坏死的再血管化,适当的应力刺激有利于骨组织的修复。     

脂肪干细胞分化成血管内皮细胞前后miRNA的差异表达

目的：探讨人脂肪间充质干细胞向血管内皮细胞诱导分化前后microRNA （miRNA ）的差异表达,预测其靶基因。方法对人脂肪间充质干细胞诱导成的血管内皮细胞进行鉴定后,提取人脂肪间充质干细胞向血管内皮细胞诱导分化前后的 miRNA ,微阵列芯片检测表达谱的变化,对有显著差异的miRNA进行实时荧光定量PCR验证,通过TargetScan、Miranda、PITA 、RNAhybrid和microTar五个数据库预测靶基因。结果筛选、验证出四个显著差异表达的miRNA。其中,miR‐29b‐3p和miR‐5096为显著上调,miR‐143‐3p和 miR‐145‐5p为显著下调。预测到 OCT4、SOX2、KLF4、TGFB2、IGF1、TAF11、TMEM169、UHRF1和OSBPL6等相关靶基因。结论人脂肪间充质干细胞向血管内皮细胞诱导分化前后存在显著差异性表达的miRNA ,提示这些miRNA在其分化中有重要的调控作用。     

鹿茸精诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的:探讨鹿茸精体外定向诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。方法:通过贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞,体外扩增培养。鹿茸精定向诱导分化为类神经元样细胞。光镜下观察细胞形态,免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志物神经元烯醇酶(NSE)、巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果:大鼠骨髓间充质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。鹿茸精诱导3小时后大部分骨髓间充质干细胞转变为神经元样细胞,出现胞体和突起,免疫细胞化学染色NSE及Nestin呈阳性,GFAP阴性。结论:鹿茸精可在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。     

腺病毒介导血管内皮生长因子转染脐带间充质干细胞的实验研究

目的探讨腺病毒载体介导血管内皮生长因子(VEGF)转染脐带间充质干细胞(UCMSCs)的可行性,以及VEGF转染对UCMSCs功能的影响。方法构建VEGF165-EGFP基因重组腺病毒载体,分离和培养UCMSCs,携增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的腺病毒载体转染UCMSCs,倒置荧光显微镜下观察细胞转染效果,流式细胞仪检测细胞转染率,确定最佳病毒感染复数(MOI)。将细胞分为VEGF-EGFP转染组、EGFP空载组及对照组3组,依据最佳MOI值转染并收集细胞,采用蛋白印迹法(Western blotting)检测VEGF及Akt表达变化;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测VEGF蛋白表达情况。采用CCK-8法评价转染对UCMSCs增殖的影响。结果腺病毒介导的VEGF165-EGFP基因能够成功转染UCMSCs,且VEGF基因在细胞内能够转录和表达,并能分泌到细胞外。转染后48 h VEGF-EGFP转染组VEGF、Akt水平显著高于EGFP空载组和对照组(P<0.05);转染后48 h采用ELISA法在VEGF-EGFP转染组细胞培养上清中即检测到VEGF的表达和分泌,在转染后第4天达到高峰,且VEGF表达显著高于EGFP空载组及对照组(P<0.01),以后逐渐下降,并稳定表达一定时间。CCK-8法检测结果显示,介导VEGF基因转染的腺病毒对UCMSCs增殖无明显影响。结论腺病毒介导VEGF基因能够成功转染UCMSCs,保持其原有生物学特性,并能持续高效表达VEGF,为通过VEGF基因联合UCMSCs治疗获得糖尿病下肢血液循环重建的可行性提供理论依据。     

VEGF基因转染间充质干细胞移植与单纯间充质干细胞移植对大鼠心肌梗死的疗效对比

目的探讨VEGF基因转染骨髓间充质干细胞与单纯骨髓间充质干细胞移植对大鼠心肌梗死的疗效。方法将SD大鼠建立心肌缺血模型,1周后随机取30只采用随机分组法分为3组,A组为联合移植组,B组为单纯干细胞移植组,C组为对照组,通过一系列检测,对比3组的疗效。结果 A组的疗效优于B组和C组,B组的疗效优于C组（P〈0.05）。结论 VEGF基因转染骨髓间充质干细胞移植比单纯骨髓间充质干细胞移植的综合疗效好。     

转染bFGF基因对人骨髓间充质干细胞增殖特性的影响

目的 探讨作为组织工程种子细胞的人骨髓间充质干细胞,在体外培养条件下转染bFGF基因对其增殖特性的影响.方法 利用脂质体将含人pcDNA3.1-bFGF质粒转染到生长良好的P3代人BMSCs,G418筛选获得抗性克隆.采用荧光定量PCR和免疫荧光检测转染bFGF的骨髓间充质干细胞bFGF基因及其产物的表达,MTY法检测和流式细胞仪检测细胞的增殖情况和细胞增殖周期,并将转染和非转染BMSCs分别成骨诱导分化,对其碱性磷酸酶活性进行测定.结果 脂质体介导pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒转染BMSCs,经荧光定量PCR和免疫荧光检测.证实转染细胞表达bFGF.转染细胞增殖活力加强,处于增殖周期的细胞比例更高（P〈0.05）.碱性磷酸酶活性检测结果表明转染细胞的碱性磷酸酶活性高于非转染细胞（P〈0.05）.结论 用脂质体转染法能将pcDNA3.1-bFGF成功导入体外培养的hBMSCs,bFGF基因改良的BMSCs可以改善其生存状态、促进其增殖,并可促进向成骨细胞分化.     

龟板提取物对骨髓间充质干细胞中分化抑制蛋白1表达的影响

目的观察不同剂量的龟板提取物对骨髓间充质干细胞中分化抑制蛋白1（inhibitor of differentiation 1,Id1）的作用。方法将构建成功的PGL3-Id1启动子用磷酸钙共沉淀法转染大鼠骨髓间充质干细胞,龟板提取物分别作用于转染后的骨髓间充质干细胞12、24、36 h,选取作用最为明显的36 h,每组分别加入0、1、3、30、100μg/mL龟板提取物,药物作用36 h后收集细胞分别应用萤光素酶报告基因系统、RT-PCR和Western blotting检测Id1的表达。结果早期、小剂量龟板提取物对Id1的影响不大;随着时间和剂量的增加,Id1的表达水平也逐渐升高。结论龟板提取物促进了骨髓间充质干细胞中Id1的表达,剂量越大,作用时间越长,促进作用越明显。     

小檗碱联合骨髓间充质干细胞对高糖损伤下血管内皮细胞能量代谢的影响

目的研究黄连的主要有效成分小檗碱联合骨髓间充质干细胞对于高糖作用下血管内皮细胞能量代谢的影响。方法 1 MTT法检测细胞增殖以及活性情况;2流式细胞术检测细胞周期;3彗尾法检测细胞DNA损伤情况;4HPLC测定细胞中ATP、ADP、AMP含量,能荷EC值;5 RTPCR法测定CCR、COX mRNA表达;6 Western blot法检测COX、CCR的蛋白表达。结果 1高糖干预损伤后的血管内皮细胞活性明显降低、增殖能力减弱,S+G_2期的细胞数量明显减少,出现一定程度的DNA损伤,而小檗碱、骨髓间充质干细胞及其联合使用均能不同程度提高细胞活性和增殖能力,增加S+G2期的细胞数量,促进DNA的修复(P<0.01),且小檗碱联合干细胞组的效应优于单用组;2血管内皮细胞经高糖干预损伤后ATP和ADP含量减低、AMP含量增多、EC值明显降低,小檗碱、骨髓间充质干细胞及其联合使用均能提高ATP和ADP含量(P<0.01);且小檗碱联合干细胞的效应优于单用组;3血管内皮细胞经高糖干预损伤后,COX、CCR mRNA和蛋白表达明显降低,经小檗碱、骨髓间充质干细胞及其联合使用干预后,CCR、COX mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.01或P<0.05),且小檗碱联合干细胞的上调作用最为明显。结论小檗碱、骨髓间充质干细胞以及两者联合使用对于高糖损伤后血管内皮细胞能量代谢的改善具有促进作用,其机制可能是小檗碱、骨髓间充质干细胞可上调COX和CCR mRNA和蛋白的表达,从而介导葡萄糖类氧化物的水解,改善血液环境,增加血管内皮细胞的葡萄糖供应和摄取,从而改善高糖损伤后血管内皮细胞的能量代谢。     

CXCR4基因转染对骨髓间充质干细胞体外生物学行为的影响

目的观察对转染CXCR4基因的骨髓间充质干细胞体外生物学行为的影响。方法将培养的骨髓间充质干细胞分为3组,GFP组、CXCR4~+组、CXCR4~-组,转染趋化因子受体CXCR4,并用免疫荧光细胞化学法、流式细胞仪法及Transwell小室细胞趋化实验,体外研究了CXCR4高表达及低表达对MSCs增殖、分化与迁移能力的影响。结果 CXCR4高表达及低表达均不影响MSCs的增殖能力,对其向肺组织分化的能力也没有影响。与GFP-MSCs组相比,CXCR4~+-MSCs组迁移的细胞数量明显升高,而CXCR4~--MSCs组迁移细胞数量差异无显著性。结论 CXCR4高表达及低表达不改变MSCs的增殖、分化能力,然而CXCR4高表达明显增强MSCs向炎症病灶的迁移能力。说明CXCR4高表达的MSCs移植入体后将会更快速、更大量地到达病变区域参与组织修复,明显增强疗效。     

血管内皮细胞生长因子-165和血管形成素-1促进干细胞动员

目的 研究缺血肌肉转染腺病毒(Ad-)携带人血管内皮细胞生长因子-165(VEGF-165)和人血管形成素-1(Ang-1)基因后引起的细胞动员效应。方法 制作大鼠下肢血管闭塞模型,肌肉内注射Ads-VEGF-165和／或Ad5-Ang-1,以Western法检测生长因子蛋白表达、免疫组化检测基因导入后在缺血肌肉引起的效应。结果(1)局部转基因肌肉组织高表达人VEGF-165蛋白和人Ang-1蛋白;(2)与对照组相比,接收两因子转染后的骨骼肌纤维间溴化脱氧尿嘧啶(BrdU)阳性的浸润细胞显著增多,呈协同效应。有细胞同时表达内皮细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞标志性抗原。部分细胞表达CD117^ 并分化为新生微血管的内皮细胞。结论(1)两因子能促进CD117^ 骨髓干细胞动员到缺血组织部位并分化为内皮细胞参与血管新生;(2)两因子可能协同动员召集能在缺血部位聚集并分化为其它类型细胞的干／祖细胞;(3)两因子可能同时作为血管生成因子和细胞动员剂用于缺血性疾病的干细胞移植治疗中,以增强缺血损伤修复效果和节省干细胞用量。     

自体脑脊液定向诱导骨髓间充质干细胞分化为神经干细胞

目的 探讨自体脑脊液定向诱导骨髓间充质干细胞分化为神经干细胞的可行性.方法 采用自体脑脊液为诱导剂,体外诱导骨髓源性间充质干细胞.从形态学、免疫组化法、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法对诱导后细胞进行鉴定.结果 自体脑脊液诱导后的间充质干细胞呈现神经干细胞改变,可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,并表现相应的特征结构和生物学特性.结论 白体脑脊液能定向诱导骨髓间充质干细胞向神经样细胞转化.     

牡荆苷对骨髓间充质干细胞成脂分化的影响简

目的 探讨牡荆苷对大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化的影响.方法 采用细胞的增殖检测（MTT）法检测骨髓间充质干细胞生存率,油红O染色检测细胞成脂分化,实时荧光定量PCR检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）和CCAAT增强子结合蛋白α（C/EBPα） mRNA表达.结果 牡荆苷浓度在1～50 μmol/L范围内对骨髓间充质干细胞生存率无显著影响;牡荆苷可抑制骨髓间充质干细胞成脂分化及PPARγ和C/EBPαmRNA表达.结论 牡荆苷可抑制骨髓间充质干细胞成脂分化,其作用机制可能与抑制PPARγ和C/EBPα基因表达有关.     

rAAV2介导bFGF修饰的骨髓间充质干细胞与PDLLLA／HA的复合实验研究

目的探讨载bFGF基因腺相关病毒（rAAV2-bFGF）感染后的骨髓间充质干细胞与PDLLLA／HA的复合情况,为颅颌面骨基因治疗提供实验依据。方法rAAV2-bFGF转染至第3代骨髓间充质干细胞,在无菌情况下将bFGF基因腺相关病毒（rAAV2-bFGF）感染后的骨髓间充质干细胞与聚D,L-乳酸／羟基磷灰石（PDLLA／HA）支架材料充分混匀,4℃过夜,在扫描电镜下观察载骨髓间充质干细胞与支架材料的复合情况。结果rAAV2-bFGF成功转染至第3代骨髓间充质干细胞;扫描电镜下观察发现,BMSCs可以在PDLLA／HA上黏附、增殖、分泌细胞外基质。结论载bFGF基因腺相关病毒（rAAV2-bFGF）感染后的骨髓间充质干细胞可以在合成的PDLLA／HA上黏附、增殖、分泌细胞外基质,PDLLA／HA可以作为转基因细胞的支架材料。     

山柰酚体外促成骨分化作用研究

目的 探究不同浓度的山柰酚对骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响。方法 使用含不同浓度山柰酚的培养基培养骨髓间充质干细胞,通过CCK8检测细胞增殖情况,碱性磷酸酶活力检测细胞的碱性磷酸酶表达水平,茜素红染色观察钙化结节形成情况,实时荧光定量聚合酶链式反应检测细胞Runx2、OCN成骨相关基因的表达水平。结果 10^-4mol/L山柰酚对骨髓间充质干细胞增殖分化有明显抑制作用(P <0.05),10^-5、10^-8mol/L山柰酚对骨髓间充质干细胞增殖分化无影响(P> 0.05),10^-6、10^-7mol/L山柰酚对骨髓间充质干细胞增殖有明显促进作用(P <0.05),其中10^-6mol/L山柰酚还可促进骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶表达、成骨矿化以及Runx2、OCN成骨相关基因的表达。结论 10^-6mol/L山柰酚可以促进骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化。