放射性核素反义技术在肿瘤治疗中的研究

放射性核素反义治疗是放射性核素产生辐射生物效应杀伤病变细胞与反义寡核苷酸链阻断基因表达相结合而达到治疗疾病的目的,具有特异性强、靶向性高和损伤性小等优点,为肿瘤的治疗提供了新方法。     

反义核酸技术及其应用——反义寡核苷酸(文献综述)

根据杂交互补原理寡核苷酸可特异地结合基因组DNA/RNA,从而抑制和(或)阻断其复制、转录或翻译,这一寡核苷酸被称为反义寡核苷酸(简称asON)。通过适当修饰可增加asON的稳定性、生物活性或生物利用度等,从而使asON作为药用成为可能。本文综述了近几年来asON的研究进展,如分类、修饰、作用机制、生物活性及其影响因素等,并对asON的发展前景及存在问题进行了简单的讨论。     

肿瘤反义显像技术中的若干问题

反义显像是用放射性核素标记人工合成的反义寡核苷酸、经体内核酸杂交而显示特异基因表达或过度表达的组织。反义显像具有不引起免疫反应、探针分子小，易进入瘤细胞等优点。反义是要求标记的反义核酸易于透过细胞膜、在细胞内稳定、不易分解、并能特异性聚集于靶组织。因此，须对反义寡核苷酸进行化学修饰，增强其通透性和膜内稳定性；利用受体或脂质体介导使反义寡核苷酸定向导入靶细胞；选择合适的放射性核素采用标记简单、标记率     

反义显像技术的研究

反义显像是利用放射性核素标记的反义寡核苷酸,通过体内核酸杂交而显示目的基因表达的一种显像方法,具有设计简便,合成简易,安全性高,免疫原性低等特点,成功的反义显像要求反义寡核苷酸易被细胞摄取,耐酸酶,杂交稳定,标记简单,脂质体,受体等介导的反义RNA转移,反义寡核苷酸的化学修饰以及标记方法的改进将大大加快反义显像的临床应用。     

脂质体介导的99Tcm-反义寡聚核苷酸在荷瘤裸鼠体内分布及显像研究

目的：研究脂质体介导的^99Tc^m-反义寡聚核苷酸在荷瘤裸鼠体内的分布及反义显像诊断结肠癌的可能性,为反义显像和反义治疗的临床应用提供实验依据。方法：制作荷瘤裸鼠模型,每只小鼠尾静脉注射约0.30MBq脂质体包裹的^99Tc^m-反义寡聚核苷酸,于不同时间眼眶静脉采血后处死小, 测定不同组织中及标准源的放射性计数。荷瘤裸鼠尾静脉注入脂质体介导的^99Tc^m-反义寡聚核苷酸（30－90mg),于注射后不同时间显像,观察其在肿瘤组织的浓聚情况,并以脂质体介导的^99Tc^m标记的正义和无义寡聚核苷酸为对照。结果：胃、网状内皮系统和肿瘤组织放射性浓聚较高,其次为心和血,余组织中放射性分布较少。肿瘤组织中放射性在2h时达到高峰,以后迅速降低。在2h时,脂质体介导的^99Tc^m-反义寡聚核苷酸能清晰显示肿瘤部位,而对照组则不能。结论：脂质体介导的^99Tc^m-反义寡聚核苷酸可用于结肠癌的诊断,但临床应用前还需进行大量的研究。     

反义显像技术在肿瘤诊断中的应用

反义显像技术以放射性核素标记的人工合成的寡核苷酸为显像剂，通过体内核酸杂交而显示特异性癌基因过度表达的癌组织。肿瘤癌基因的特异性、放射性核素的选择以及标记化合物的稳定性、比放射性等诸参数均影响显像效果。成功的反义显像要求寡核苷酸探针具有容易大量合成、体内稳定、能与靶序列结合并且不发生非序列性特异性结合等特点。反义显像以癌基因为基础，使肿瘤显像进入基因水平     

反义技术及其在基因治疗中的应用

反义技术是近年来国内外抗病毒、抗肿瘤研究和基因调节研究的中心课题之一，已经取得了很大进展和成就。反义技术作为抗病毒和抗肿瘤等基因治疗的有力武器已被越来越多的学者所认识和应用。本文就反义技术及其在基因治疗上的应用和前景作一介绍。反义技术的原理和研究途径自从1953年Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构以来，基因表达的分子生物学进展迅速。目前已经明确基因和蛋白质之间的线性关系，即蛋白质中氨基酸序列的变化受基因的支配，基因中核苷酸序列的变化导致蛋白质结构的变化。基因表达就是指基因转录成mRNA及mRNA翻译成蛋…     

肿瘤反义显像技术中的若干问题

反义显像是用放射性核素标记人工合成的反义寡核苷酸，经体内核酸杂交而显示特异基因表达或过度表达的组织。反义显像具有不引起免疫反应、探针分子小、易进入瘤组织等优点。反义显像要求标记的反义核酸易于透过细胞膜、在细胞内稳定、不易分解、并能特异性聚集于靶组织。因此，须对反义寡核苷酸进行化学修饰，增强其细胞通透性和膜内稳定性；利用受体或脂质体介导使反义寡核苷酸定向导入靶细胞；选择合适的放射性核素采用标记简单、标记率高、非特异性结合低且不影响反义寡核苷酸生物活性的标记方法，使其合乎显像要求。成功的反义显像对肿瘤的诊断具有重要意义。     

99Tcm标记MDM2反义寡核苷酸的实验研究

目的研究^99Tc^m标记小鼠双微体扩增基因（MDM2）mRNA的反义寡核苷酸（ASON）显像诊断乳腺癌的价值。方法以联肼尼克酰胺（HYNIC）为螯合物对ASON、错义寡核苷酸（ASONM）进行^99Tc^m标记，检测标记率、放化纯及其与互补正义链（SON）的结合能力。阳离子脂质体（1ipofectamine 2000）包裹反义探针及错义探针转染人乳腺癌细胞（MCF-7），通过RT-PCR和West-em．blotting法观察乳腺癌细胞MDM2mRNA和蛋白表达。建立荷人乳腺癌MCF-7裸鼠肿瘤模型，分别进行体内分布和肿瘤显像研究。结果ASON的标记率为（57．24-2．98）％（n=5），ASONM的标记率为（56．3±3．01）％（n=5），经纯化后放化纯可达95％以上，且仍保持与互补链的结合能力。不同浓度反义探针作用于乳腺癌细胞24h后，各浓度组MDM2mRNA和蛋白的表达量差异均有统计学意义（P〈0．01），而错义探针对MDM2mRNA和蛋白的表达没有明显影响。体内分布显示，反义及错义探针主要经肝、肾排泄，注射反义探针后，肿瘤／血液和肿瘤／骨骼肌放射性比值随时间的推移而增加。注射反义探针后1h肿瘤显影，肿瘤／对侧肢体放射性比值随时间推移而增加，各时间点错义探针在肿瘤内的聚集量均明显少于反义探针，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论^99Tc^m标记的MDM2ASON可在荷人乳腺癌MCF-7裸鼠肿瘤模型的肿瘤组织中特异性聚集，为乳腺癌的特异性诊断提供了一种可能的新方法。     

C-myc反义寡核苷酸对胃癌荷瘤裸鼠抑瘤作用的研究

目的:探讨C-myc反义寡核苷酸(ASODN)对胃癌荷瘤裸鼠的抑瘤作用。方法:将21只裸鼠建立人胃癌MKN-45细胞移植瘤动物模型。成瘤后动物随机平均分为3组,分别由皮下瘤体内注射脂质体(lipofectin,Lip)、C-mycSODN/Lip、C-mycASODN/Lip,每周1次,共3次。观察肿瘤抑制率、肿瘤体积和动物存活情况。免疫组化ABC法检测各组肿瘤的C-myc蛋白表达情况。结果:ASODN/Lip组肿瘤体积明显减少,肿瘤生长抑制,抑瘤率达41.5%;ASODN/Lip组裸鼠生存期较SODN/Lip组和Lip对照组延长明显(P<0.05);ASODN/Lip组肿瘤的C-myc蛋白表达明显降低。结论:C-myc反义寡核苷酸可以有效抑制人胃癌裸鼠皮下肿瘤的生长,延长动物生存期,为胃癌的治疗提供新的思路。     

反义核酸治疗恶性肿瘤的可能性

反义核核酸略被广泛用于研究白细胞的基因财控，证实多种基因与肿瘤的发生及增殖相关。某些癌基因的反义寡核苷酸能有效地抑制白血病细胞的增殖和肿瘤生长，基础及临床研究结果表明，反义寡核有可能成为恶性肿瘤基因治疗的一类新药。     

125I标记反义寡核苷酸及其识别淋巴瘤细胞的实验研究

目的　探讨用1 2 5I标记免疫球蛋白重链V1家族框架区 (IgHV1FR)mRNA反义寡核苷酸(1 2 5I FR ASON)作为反义显像剂和反义治疗药物的可能性。方法　用DNA合成仪将含酪胺 (tyramine)的单体连接在 18聚体寡核苷酸的 5′端 ,再用氯胺 T法进行1 2 5I标记。用阳离子脂质体DMRIE C包裹1 2 5I ASON转导Namalwa细胞 (B淋巴瘤细胞系 )和HL 6 0细胞 (人髓系白血病细胞系 ) ,测定转导效率 ,同时比较未用脂质体情况下的转导效率。质量分数为 2 0 %聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)测定tyramine ASON与血清保温后的稳定性。结果　标记率为 80 .7% ,放化纯为 98.7% ,2 4h放化纯仍高于 90 %。脂质体介导ASON转导Namalwa细胞的效率为 (2 6 .8± 1.5 4 ) % ,是未用脂质体的近 18倍 ,转导HL 6 0细胞的效率是 (13.6± 2 .5 4 ) % ,两组比较差异有显著性 (P <0 .0 1)。质量分数 2 0 %PAGE于2、6和 2 4h时点未见异常条带。结论　通过连接酪胺碘标记寡核苷酸法是比较成功的方法。1 2 5I FR ASON对Namalwa细胞具有较强的特异性 ,可用于淋巴瘤反义显像和反义放射治疗的研究。     

^99Tc^m—survivin mRNA反义肽核酸基因显像在肿瘤与炎性反应模型中的对比研究

目的研究^99Tc^m-survivin mRNA反义肽核酸（PNA）显像在肿瘤特异性诊断中的价值。方法用^99Tc^m标记人工合成的12碱基单链survivin mRNA反义PNA。20只荷瘤（A549）裸鼠按随机数字表法分为4组,每组5只。每只裸鼠经尾静脉注入^99Tc^m-survivin mRNA反义PNA,3组进行体内分布研究,其余进行显像研究。用同样方法对20只炎性反应（金黄色葡萄球菌）小鼠进行分组、体内分布和显像研究。采用SPSS13．0软件进行统计学分析,组间计量资料比较采用t检验。结果^99Tc^m-survivin mRNA反义PNA在肝内分布最高,其次是肾,注射后4h肿瘤组靶／非靶（T／NT）比值明显高于炎性反应组,分别为3．69±1．13,2．03±0．47,差异有统计学意义（t=3．01,P=0．02）。肿瘤组在注射药物后0．5h即可见肿瘤清晰显影,至4h时显影仍较清晰,而炎性反应部位始终未见明显显影。结论^99Tc^m-survivin mRNA反义PNA基因显像可通过其在肿瘤组织中的特异性浓聚区分肿瘤与炎性反应,为肿瘤的特异性诊断提供了一种可能的新方法。     

脂质体包99 Tcm标记Survivin反义寡核苷酸的制备和体外研究

目的研究脂质体包裹99Tcm标记Survivin反义寡核苷酸(ASON)的制备方法及其在肝癌细胞中的表达.方法合成20碱基单链Survivin ASON,全程硫代修饰,5'末端经氨基修饰,以双功能联结剂联肼尼克酰胺(HYNIC)为螯合剂,ASON与HYNIC偶联后用99Tcm标记,经P4柱纯化后,用阳离子脂质体(lipofectamine2000)对纯化产物进行包裹,并对其标记率、放化纯、比活度、稳定性、细胞摄取率进行研究.结果99TcmO-4比活度为18.5、14.8和7.4 MBq/μg时,标记率分别为(63.10±1.15)%、(62.40±1.05)%和(58.90±3.01)%.脂质体包裹的99Tcm-HYNIC-ASON放化纯为(99.47±3.32)%,以生理盐水、新鲜人血清孵育4 h后放化纯分别为92.51%和92.70%.转染后6 h,经脂质体包裹99Tcm-HYNIC-ASON的肝癌细胞摄取率达(66.21±0.46)%,明显高于未经脂质体包裹的ASON[(25.17±1.08)%,t=23.979～98.858,P＜0.01)].结论以HYNIC作为螯合剂标记ASON方法可行,脂质体能明显增加细胞摄取ASON.     

99Tcm—survivinmRNA反义肽核酸制备及荷瘤裸鼠基因显像研究

目的制备99Tcm标记的survivinmRNA反义肽核酸（PNA）探针,并进行荷瘤裸鼠体内基因显像,研究其对肿瘤早期诊断的价值。方法化学合成survivinmRNA的反义、无义PNA,在5’端连上4个氨基酸[Gly一（D）Ala—Gly—Gly],形成1个类似N。结构的强螯合基团;为消除空间阻碍,引入1个1一氨基丁酸（Aba）作为隔离物,利用配体交换法进行99Tcm标记。用HPLC及ITLC对标记物的标记率、放化纯进行鉴定。并对反义、无义组各5只人肺癌A549荷瘤裸鼠行99Tcm一survivinmRNA反义、无义PNA体内显像。注药后1,2和4h分别显像,利用ROI测得肿瘤与对侧组织的rr／NT比值。结果分析采用SPSS13．0软件进行成组t检验。结果99Tcm一survivinmRNA反义PNA即刻标记率为（95．48±1．92）％,放化纯〉95％,且标记物体外稳定性好,与血清保温24h后标记率仍〉85％。无义PNA标记率与之基本一致。99Tcm一survivinmRNA反义PNA在肿瘤组织内特异性浓聚,随时间延长,浓聚程度逐渐增加,1,2和4hT／NT值分别为2．70±0．28,3．44±0．35和4．21±0．63。无义PNA在肿瘤组织中稍有浓聚,但在4h内变化不大,4h时T／NT值（3．12±0．50）与反义组差异有统计学意义（t=2．918,P：0．019）。结论99TcmsurvivinmRNA反义PNA即刻标记率高,稳定性好,无需纯化即可用于显像,在肿瘤组织中特异性浓聚,对肿瘤的早期诊断有潜在价值。     

反义显像技术的研究进展

反义显像是利用放射性核素标记的反义寡核苷酸 ,通过体内核酸杂交而显示目的基因表达的一种显像方法 ,具有设计简便、合成简易、安全性高、免疫原性低等特点。成功的反义显像要求反义寡核苷酸易被细胞摄取、耐核酸酶、杂交稳定、标记简单。脂质体、受体等介导的反义 RNA转移 ,反义寡核苷酸的化学修饰以及标记方法的改进将大大加快反义显像的临床应用。     

反义肽核酸对促甲状腺激素受体mRNA表达的影响

目的探讨反义肽核酸（asPNA）对大鼠甲状腺细胞的细胞膜表面促甲状腺激素受体（TSHR）表达的影响。方法设计两种与TSHRmRNA不同片段互补的asPNA,分别为核定位信号-asPNA1（NLS—asPNA1）和NLS．asPNA2,另外合成一段非相关的干扰肽核酸（NLS—scrPNA）序列,用荧光显微镜观察NLS—asPNA能否进入细胞,采用噻唑蓝法检测asPNA对细胞是否具有毒性作用,然后用实时定量RT—PCR检测NLS—asPNA对TSHRmRNA表达的影响。结果荧光显微镜观察发现,asPNA可以进入到细胞中去。噻唑蓝法检测发现asPNA对细胞没有毒性作用。实时定量RT—PCR结果显示,NLS—asPNA1和NLS—asPNA2可以抑制TSHRmRNA表达,表现为随着NLS—asPNA与细胞培养时间的延长,TSHRcDNA的拷贝数逐渐下降,且呈现时间依赖性,而NLS．scrPNA对TSHRtuRNA的表达没有明显的影响。结论NLS—asPNA可以进入到细胞中去,并且能够下调TSHRmRNA的表达。