siRNA抑制Ku80表达后对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响

背景与目的:Ku80为细胞受辐射后DNA双链断裂(DNA double strand break,DSB)的主要修复蛋白.现阶段关于Ku80的研究主要集中在DSB修复方面,其他方面研究较少.本研究建立利用siRNA抑制Ku80表达的宫颈癌HeLa细胞模型,以此探讨Ku80在细胞增殖方面的作用.方法:构建靶向抑制Ku80的siRNA表达载体,转染HeLa细胞,筛选稳定表达siRNA的转化克隆;Western blot检测Ku80表达变化:克隆形成实验、MTT法和裸鼠皮下瘤形成实验分别检测细胞克隆形成率及细胞在体外和体内的增殖情况.结果:构建表达质粒pKu80-siRNA与pNeg-siRNA转染HeLa细胞,G418筛选后获得稳定转染克隆,Western blot分析表明转染pKu80-siRNA后的细胞Ku80蛋白表达受到明显抑制,将其命名为HeLa/Ku80-siRNA;转染pNeg-siRNA的HeLa细胞克隆形成率为0.62±0.02,而HeLa/Ku80-siRNA细胞的克隆形成率为0.46±0.05,明显低于对照细胞(t=5.11,P＜0.01);MTT显示细胞培养48 h和72 h时,HeLa/Ku80-siRNA细胞的增殖率均显著低于对照细胞(P＜0.05);裸鼠皮下瘤生长实验示种植25天时,HeLa/Ku80-siRNA细胞种植瘤的平均体积为(18.92±3.60)mm3,明显低于对照细胞种植瘤体积(194.88±30.61)mm3,(t=12.69,P＜0.01).结论:稳定转染及siRNA技术建立的Ku80表达抑制克隆可以成为简单实用的细胞模型:Ku80-siRNA抑制Ku80的表达后可以在体内外抑制HeLa细胞的增殖.     

survivin基因RNA干涉对宫颈癌细胞凋亡和放射敏感性的影响

目的：观察survivin基因siRNA干涉对宫颈癌细胞HeLa凋亡和放射敏感性的影响。方法：通过脂质体介导将含人survivin基因siRNA的重组真核表达质粒pSilencer2.1-s2转染宫颈癌细胞系HeLa,G418筛选阳性克隆,半定量PCR、Western blot分别检测survivin mRNA和蛋白表达,激酶活性检测法测定半胱氨蛋白水解酶-3(caspase-3)活性变化,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,平板克隆形成实验、多靶单击模型拟合细胞存活曲线观察细胞放射敏感性变化。结果：G418筛选形成稳定转染阳性克隆,建立了3组稳定转染细胞系：HeLa-s2(转染重组质粒pSileneer2.1-s2)、HeLa-NC(转染阴性对照质粒pSi- lencer2.1-NC)和HeLa-U6 neo(转染空载质粒pSileneer2.1-U6 neo)。经与HeLa-NC、HeLa-U6 neo和未转染HeLa细胞比较,HeLa-s2 survivin mRNA和蛋白表达明显下降,与HeLa细胞相比,表达抑制率分别为：62.8%和60.1%；caspase-3激酶活性增强,D_(405)达1.26±0.04(P＜0.05)；细胞凋亡率为：(29.2±1.4)%,明显升高(P＜0.05)；同一剂量X线照射下,平板克隆形成率显著降低(P＜0.05)；细胞存活曲线显示：D_0、D_q值显著下降,分别为：3.15、1.21(P＜0.05),放射增敏比分别为：2.01 (D_0值比)、1.77(D_q值比)。结论：survivin基因siRNA干涉可通过阻抑HeLa细胞中survivin表达,增强caspase-3激酶活性,诱导细胞凋亡,并显著提高细胞的放射敏感性。     

Rab11对子宫颈癌HeLa细胞生物学功能的影响

目的：通过调控Rab11在子宫颈癌HeLa细胞中的表达,观察Rab11对子宫颈癌HeLa细胞生物学功能的影响。方法将Rab11 siRNA转染至HeLa细胞,Western blot法检测Rab11蛋白表达变化,以转染阴性对照siRNA细胞为对照组,采用CCK8、克隆实验、EdU实验、Transwell小室法体外检测转染后的HeLa细胞增殖能力、侵袭能力的变化。结果与对照组比较,HeLa细胞转染Rab11 siRNA组Rab11蛋白表达明显下调（1.096±0.091比1.735±0.084,P＜0.01）。与对照组比较,转染Rab11 siRNA组HeLa细胞增殖受抑制（吸光度值48 h：0.721±0.092比1.090±0.099;72 h：0.956±0.105比1.482±0.096;96 h：1.231±0.099比1.720±0.174,P＜0.01）,克隆形成数减少[（36±1）个比（75±8）个, P＜0.01],增殖率降低[（33.880±1.902）%比（45.570±2.025）%,P＜0.05]。Rab11 siRNA转染组较对照组侵袭率降低[（38.6±0.8）%比（100.0±0.2）%,P＜0.01]。结论体外实验证实Rab11表达下调能够抑制HeLa细胞的生长。     

RNAi抑制Ku80表达后促进宫颈癌SiHa细胞的放射敏感性

背景与目的：Ku80为细胞受辐射致DNA双链断裂（DNA double-strand break,DSB）后的主要修复蛋白之一,Ku80的高表达预示着宫颈癌组织对放射线的抵抗,本研究运用RNAi技术抑制Ku80表达,观察宫颈癌SiHa细胞对X线敏感性的变化.方法：构建1个靶向抑制Ku80的siRNA表达载体和1个阴性对照质粒,稳定转染入SiHa细胞后Western blot和RT-PCR检测Ku80表达变化;6 MV X线照射10 Gy后20 h、28 h和48 h收集细胞,流式细胞术检测细胞凋亡率;克隆形成实验检测细胞D0、SF2和α等值.结果：构建表达质粒转染SiHa细胞经筛选后获得2个稳定转染细胞株,Western blot和RT-PCR分析表明转染pKu80-siRNA的阳性克隆Ku80在mRNA和蛋白质水平均受到明显抑制;X线照射28 h及48 h后,Ku80表达受抑细胞其凋亡率均显著高于转染阴性质粒组和空白对照组（P＜0.05）;Ku80受抑细胞的D0和SF2值分别为1.330和0.425,低于转染阴性质粒细胞（1.748和0.580）和空白对照细胞（1.835和0.597）,α值为0.295,高于转染阴性质粒细胞（0.176）和空白对照细胞（0.188）.结论：运用RNAi技术可以有效抑制Ku80的表达从而促进SiHa细胞对X线的敏感性,Ku80可能是一个较理想的肿瘤分子治疗靶点.     

RhoC小干扰RNA抑制胃癌细胞的迁移和侵袭

目的：研究Ras homologyC（RhoC）在胃癌转移中的作用。方法：利用Vector NTI软件设计并构建RhoC的小干扰RNA（siRNA）载体，利用脂质体介导法将一组RhoCsiRNA分别转染胃癌SGC7901细胞。筛选出稳定抗性克隆；Westernblot检测RhoCsiRNA转染后的抑制效应，Cell Counting Kit-8检测RhoC siRNA转染细胞株的生长速度；MTT法检测转染细胞株对化疗药物的敏感性；损伤刮擦实验和TRANSWELL小室实验分别检测转染细胞株的迁移与侵袭能力。结果：在计算机辅助下成功地设计并构建了5个RhoC的小干扰RNA载体，Western blot显示其中一个RhoC的小干扰RNA RhloC-s362对RhoC的表达有明显的抑制作用；尽管下调RhoC的表达对胃癌细胞的生长和药物敏感性元明显影响，但可显著抑制肿瘤细胞的迁移与侵袭。结论：RhoC siRNARhoC-s362能够明显抑制胃癌SGC7901细胞中RhoC的表达，并进而抑制胃癌细胞的迁移与侵袭，提示RhoC可能在胃癌转移中发挥重要作用。     

靶向survivin基因siRNA对宫颈癌细胞放射敏感性影响的实验 

 目的 探讨survivin表达对宫颈癌放射敏感性的影响。 方法 RT-PCR和Western blot法分析survivin基因mRNA和蛋白的表达, 平板集落形成实验检测细胞 增殖,流式细胞术检测细胞凋亡率。 survivin siRNA转染HeLa细胞,比较survivin siRNA对细胞凋亡、增殖以及放射敏感性的 影响。 结果 在宫颈癌HeLa细胞中存在survivin的表达,survivin siRNA可诱导HeLa细胞凋亡并抑制增殖 。 结论 survivin siRNA可通过影响细胞凋亡和增殖来增加HeLa细胞的放射敏感性     

抑制STAT3基因表达对人宫颈癌HeLa细胞定植和侵袭的影响

目的 采用RNA干扰(RNAi)技术抑制人宫颈癌HeLa细胞信号转导及转录活化因子3(STAT3)基因的表达,观察其对HeLa细胞定植和侵袭能力的影响.方法 针对STAT3基因设计并合成编码小干扰RNA(siRNA)的寡核苷酸,克隆入pSilencer2.1-U6-neo质粒中,从而构建针对STAT3基因的短发夹状siRNA真核表达质粒,用脂质体法将其转染人人宫颈癌HeLa细胞.利用RT-PCR技术和Western blot方法分别检测STAT3 mRNA和蛋白表达水平;通过软琼脂克隆形成实验和体外侵袭实验检测HeLa细胞的定植和侵袭能力.结果 针对STAT3基因的短发夹状siRNA真核表达质粒成功转染人宫颈癌HeLa细胞;转染成功的HeLa细胞的STAT3基因mRNA及蛋白表达均下降;HeLa细胞在软琼脂中形成的克隆数和穿透Matrigel膜的细胞数均明显减少.结论 针对STAT3基因的短发夹状siRNA真核表达质粒通过下调STAT3基因表达,抑制宫颈癌细胞的定植和侵袭能力.     

协同抑制Ku80和DNA-PKcs对HeLa细胞放射生物学功能的影响

目的:研究小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)和LY29400抑制单个或多个DNA双链断裂(DNA double-strand break,DSB)修复蛋白后,HeLa细胞放射敏感性和细胞周期的变化.方法:Ku80受抑细胞HeLa/Ku80-siRNA和对照细胞HeLa/Neg-siRNA分别转染可以靶向抑制DNA依赖蛋白激酶催化亚单位(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs)表达的siRNA.或用DNA-PKcs活性抑制剂LY294002处理,经6 MV X线照射后,克隆形成实验检测细胞放射敏感性的变化,FCM法检测细胞周期.结果:DNA-PKcs-siRNA转染后的HeLa/Ku80-siRNA细胞,其2 Gy照射后的存活分数(sur-vival fraction,SF2)为0.08±0.01,LY294002作用后HeLa/Ku80-siRNA的SF2达0.03±0.01,均远低于未处理HeLa/Ku80-siRNA细胞的0.20±0.05.各组细胞照射6 Gy后均出现G2/M期阻滞,转染DNA-PKcs-siRNA的HeLa/Neg-siRNA细胞以及经LY294002处理的HeLa/Ku80-siRNA、HeLa/Neg-siRNA细胞G2/M期阻滞逐渐缓慢出现,照射后72 h仍末达到顶点,而其他细胞G2/M期阻滞均于照射后48 h达到顶点.结论:在抑制Ku80已达95%的基础上,DSB修复功能可以由其他DSB修复蛋白如DNA-PKcs和共济失调毛细血管扩张症突变基因(ataxia-telangiectasia mutant,ATM)代偿,协同抑制上述蛋白可以明显增加,如HeLa细胞的辐射敏感性;Ku80、DNA-PKcs和ATM在细胞的G2/M期阻滞过程中发挥的作用不同.     

DNA-PKcs、Ku80及ATM备选宫颈癌放疗增敏靶点的体外研究

背景与目的:DNA双链断裂(DNA double strand break,DSB)是细胞受辐射后最致命的损伤,而DNA依赖蛋白激酶催化亚单位(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs)、Ku80和ATM(ataxia-telangiectasia mutated)为DSB的主要修复蛋白.宫颈癌是以放疗为主要治疗手段的肿瘤.但其肿瘤细胞对放射线的敏感性不同.本实验拟研究3种DSB修复蛋白的表达与宫颈癌细胞放射敏感性的关系.并探讨DSB修复蛋白成为宫颈癌放疗增敏靶点的可能性.方法:免疫组化法检测41例宫颈癌患者组织中DNA-PKcs、Ku80和ATM蛋白的表达情况;Western blot检测8株肿瘤细胞(包括4株宫颈癌细胞)中3种蛋白的表达,克隆形成实验检测SF2 (suivival fraction at 2 Gv)、α值,分析蛋白表达水平和SF2、α值的关系;利用靶向抑制DNA-PKcs的shRNA表达质粒和小分子抑制剂LY294002,分别抑制HeLa细胞DNA-PKcs蛋白表达和活性后,克隆形成实验和流式细胞仪检测HeLa细胞受6 MVX线照射后的SF2、α值和凋亡率变化.结果:在41例宫颈癌组织中,Ku80、DNA-PKcs和ATM的阳性率分别为70.73%、68.29%和19.51%:8株肿瘤细胞中Ku80、DNA.PKcs和ATM蛋白的相对表达量与各细胞SF2、α值各不相同,作Pearson线性相关分析后得出DNA-PKcs的表达水平与SF2之间有明显的正相关关系(r=0.72,P=0.04);靶向抑制DNA-PKcs的shRNA可以促进HeLa细胞的放射敏感性,其SF2值为0.37,显著低于对照HeLa细胞的0.53(P＜0.05);单独接受50 μmol/L LY294002作用1 h HeIa细胞的凋亡率未见明显增加,但先经LY294002处理再照射6 Gy的HeLa细胞在48 h和72 h的凋亡率比单独照射6 Gy的HeLa细胞凋亡率显著增加(48 h点:t=3.25,P=0.03;72h点:t=3.01,P=0.04).结论:DNA-PKcs在宫颈癌组织中表达较高,且其表达水平可以预示肿瘤细胞的放射敏感性:抑制DNA-PKcs的表达或活性可以促进HeLa细胞的放射敏感性.     

Rab25 siRNA对人卵巢上皮性癌细胞生长和增殖的作用

目的：通过RNA干涉抑制Rab25在人卵巢上皮性癌的过表达,观察Rab25基因的siRNA对肿瘤细胞的生长和增殖作用.方法：构建针对Rab25基因的siRNA重组质粒,稳定转染A2780细胞,通过RT-PCR检测Rab25的表达;MTT法观察细胞增殖,绘制细胞生长曲线;克隆形成实验检测肿瘤细胞的集落形成能力.结果：成功构建Rab25基因的siRNA,稳定转染靶细胞后可显著降低Rab25的表达,细胞生长速度减慢、增殖能力下降.结论：Rab25基因的siRNA对肿瘤细胞的抑制作用,为卵巢癌基因治疗开辟新途径.     

siRNA抑制survivin基因周期的影响表达对HeLa细胞

目的设计靶向survivin基因的干涉片段,构建真核表达载体pSUPER／survivin并转染宫颈癌HeLa细胞,探讨siRNA抑制survivin表达对联合1射线宫颈癌HeLa细胞周期的影响。方法化学合成干涉引物,退火获得survivin基因的干涉片段,连入pSUPER载体并测序。将测序正确的pSUPER／survivin载体转染HeLa细胞株,RT—PCR法和流式细胞术检测HeLa细胞中survivin基因的表达,流式细胞术检测转染联合＇射线照射后各组细胞的细胞周期数据。结果本实验成功的构建了pSUPER／survivin载体。转染pSUPER／survivin的HeLa细胞其survivin基因表达水平明显低于未转染的HeLa细胞及转染空载体pSUPER的HeLa细胞。1射线照射后,转染pSUPER／survivin的HeLa细胞发生了S期细胞比例下降,及G2／M期阻滞。结论成功的构建了pSUPER／survivin载体,siRNA干涉survivin可以作为提高放射敏感性的潜在分子靶点,通过减少S期细胞比例,促进肿瘤细胞凋亡,通过增加G2／M期阻滞增加放射线的杀伤。     

The relationship between the down-regulation of DNA-PKcs or Ku70 and the chemosensitization in human cervical carcinoma cell line HeLa

The aim of this study was to clarify the function of non-homologous end-joining (NHEJ) in tumorigenesis and chemoresistance, and to explore the potential of DNA-PK as a target of reversal of chemoresistance and enhancing the sensitivity of cells to chemotherapeutic agents. Plasmid vectors pSIREN-Ku70shRNA and pSIREN-DNA-PKcssh-RNA, which coded small interfering RNA of Ku70 and DNA-PKcs, were constructed and transfected into human cervical cancer cell line HeLa. The relationship between the down-regulation of Ku70 or DNA-PKcs and tumor cell proliferation and the sensitivity of cells to chemotherapeutic agents were analyzed. Down-regulation of Ku70 and DNA-PKcs expression inhibited cell proliferation, and increased cell apoptosis in DDP-treated HeLa cells. DNA-PK might play an important role in drug resistance, and inhibition of the DNA-PK expression suppressed the growth of tumor cells and enhanced the sensitivity of cells to chemotherapeutic agents.     

Tumor cell radiosensitivity is a major determinant of tumor response to radiation

Substantial evidence suggests that the radiosensitivity of the tumor cells is the primary determinant of tumor response to radiation. More recent studies suggest that tumor stroma radiosensitivity is the principle determinant of response. To assess the relationship between intrinsic tumor cell radiosensitivity and tumor response, we altered the intrinsic radiosensitivity of a cloned tumor cell line and analyzed the effect of this alteration on tumor response. A cloned tumor cell line derived from DNA double-strand break repair--deficient severe combined immunodeficient mice was transfected with the double-strand break repair gene DNA-PKcs. The intrinsic radiosensitivity of the transfected tumor line was decreased by a factor of approximately 1.5. The isogenic lines were used to initiate tumors in NCr-nu/nu mice. When transplanted in the same strain of mice and exposed to the same dose of radiation, the isogenic tumors may be expected to exhibit a similar response to radiation if radiation damage to host stroma is the principle determinant of response. This was not observed. Over the dose range of 20 Gy in four 5-Gy fractions to a single dose of 30 Gy, the 1.5-fold increase in intrinsic tumor cell radioresistance conferred by the introduction of DNA-PKcs caused a 1.5-fold decrease in tumor growth delay. The results show that the intrinsic radiosensitivity of tumor cells is a major determinant of tumor response to radiation.     

The dominant negative mutant Artemis enhances tumor cell radiosensitivity

Background

Tumor radioresistance often leads to treatment failure during radiotherapy. New strategies like developing radiosensitizer are clinically important. Intervention with DNA double-strand break repair is an effective way to modulate tumor cell radiosensitivity. This study focused on the mutant Artemis fragment-enhanced radiosensitivity of human cervical cancer cells.

Material and methods

We constructed two pEGFP-C1-based eukaryotic expression vectors encoding full-length and the mutant Artemis fragment (D37N-413aa), respectively. HeLa cells were stably transfected with these plasmids or vector. Cell survival was measured by the clonogenic assay. The γH2AX foci assay was used to monitor DNA repair after irradiation. Co-immunoprecipitation and Western blot analysis were performed to study protein interaction and phosphorylation of Artemis.

Results

Expression of the mutant Artemis fragment (D37N-413aa) delayed DNA DSB rejoining after irradiation, thereby enhanced radiosensitivity of HeLa cell. Further experiments indicate that this mutant Artemis fragment bind to DNA-PKcs and ATM, inhibited phosphorylation of endogenous Artemis, the key molecule for DNA repair and cell radiosensitivity.

Conclusions

The dominant negative mutant Artemis fragment (D37N-413aa) enhanced tumor cell radiosensitivity through blocking activity of endogenous Artemis and DNA repair. It is the first time to modulate tumor cell radiosensitivity via targeting Artemis. This novel mechanism of radiosensitivity strongly suggests the potential role of Artemis in cancer therapy.     

下调Rab11基因对宫颈癌HeLa/SiHa 细胞侵袭迁移的影响及机制探讨

背景与目的：Rab11基因在宫颈癌细胞中高表达,可能与细胞恶性转化相关。本研究采用RNA干扰技术下调Rab11基因表达,并探讨其对宫颈癌HeLa/SiHa细胞侵袭迁移的影响及可能的相关机制。方法：将HeLa/SiHa细胞分为2组：阴性对照组(转染阴性对照的小干扰RNA)和Rab11 siRNA干扰组(转染小干扰Rab11siR-NA)。蛋白[质]印迹法(Western blot)检测Rab11干扰效果,检测转染Rab11 siRNA后,侵袭相关蛋白Rac1、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP2)和MMP9表达的变化;细胞划痕损伤实验检测细胞迁移;Transwell实验检测细胞侵袭;细胞免疫荧光实验从形态学角度探索在小干扰Rab11后Rac1蛋白在细胞膜上聚集位置的变化。结果：转染小干扰Rab11siRNA到HeLa/SiHa细胞后,Rab11蛋白表达受到高效抑制(P<0.01);细胞迁移、侵袭能力受到抑制(P<0.05),Rac1蛋白表达明显下调(P<0.01),MMP2、MMP9蛋白表达下调(P<0.05), Rab11 siRNA处理组细胞运动前端细胞膜下Rac1蛋白聚集量减少。结论：Rab11基因表达下调可以抑制HeLa/SiHa细胞的迁移和侵袭,其机制可能与Rac1、MMP2和MMP9蛋白表达量下降及Rac1定位的改变有关。     

miRNA-34a过表达对4种人宫颈癌细胞放射敏感性研究

目的 研究miRNA-34a过表达对4种人宫颈癌细胞放射敏感性的影响。方法 运用脂质体2000转染试剂盒将pGenesil-1-miRNA-34a表达质粒转染宫颈癌细胞系C33A、HeLa、SiHa和CaSki,通过G418筛选构建过表达miRNA-34a宫颈癌细胞系(miRNA-34a/C33A、miRNA-34a/HeLa、miRNA-34a/SiHa和miRNA-34a/CaSki)。细胞经不同剂量⁶⁰Coγ射线照射;运用TaqManRT-PCR和蛋白印迹法测定细胞中miRNA-34a表达;运用MTT法和克隆形成实验分别测定细胞增殖抑制率和克隆形成能力,流式细胞仪测定细胞凋亡率和蛋白印迹法测定细胞凋亡相关蛋白表达变化。结果 宫颈癌细胞系中miRNA-34a表达量显著高于阴性对照组(P<0.05),过表达miRNA-34a宫颈癌细胞增殖抑制率显著高于阴性对照组(P<0.05),细胞克隆形成率显著低于阴性对照组(P<0.05)。流式细胞仪结果显示过表达miRNA-34a宫颈癌细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.05)。蛋白印迹法结果显示4 Gy+过表达miRNA-34a细胞中cleaved caspase 9和cleaved PARP蛋白表达量高于过表达miRNA-34a细胞。结论 本研究成功构建miRNA-34a过表达宫颈癌细胞系,miRNA-34a过表达增强宫颈癌细胞放射敏感性,其机制与激活细胞凋亡通路有关。     

RNA干扰技术抑制JEG-3细胞中HMGA1的表达

目的：以人类高迁移率蛋白A1（HMGA1）为靶基因，采用RNA干扰（RNAi）技术特异性地抑制JEG-3细胞中HMGA1的表达。方法：针对HMGA1基因设计、合成一段小干扰RNA（siRNA），用脂质体lipofectamine2000将该siRNA转染JEG-3细胞，采用RT—PCR和Westernblot分别从mRNA和蛋白质水平检测该siRNA对HMGA1表达的影响。结果：针对HMGA1的siRNA能够明显下调JEG-3细胞中HMGA1的表达水平，并具有良好的特异性。结论：在JEG-3细胞系中采用RNAi技术特异性下调了HMGA1基因的表达，为研究HMGA1基因在肿瘤细胞中的作用奠定实验基础，也为进一步研究HMGA1在治疗人类绒毛膜细胞癌的临床应用提供了有益帮助。