抗丙型肝炎病毒非结构蛋白NS_3单链抗体的制备及免疫组织化学研究

研制抗丙型肝炎病毒非结构蛋白ＮＳ3的人源噬菌体单链抗体 ,并探讨其在临床诊断中的应用价值。以重组的丙型肝炎病毒非结构蛋白ＮＳ3为固相抗原 ,利用亲和层析的原理 ,从噬菌体抗体库中经过 5轮“吸附—洗脱—扩增”的筛选过程及酶联免疫吸附试验、斑点免疫杂交试验和ＤＮＡ序列分析 ,获得ＨＣＶＮＳ3的人源单链抗体 ;用该抗体与不同来源的ＨＣＶＮＳ3抗原进行反应 ;对 10例石蜡包埋的丙型肝炎患者肝组织进行免疫织组化学鉴定。ＥＬＩＳＡ结果表明 ,制备的ＨＣＶＮＳ3人源单链抗体能与不同来源的ＨＣＶＮＳ3抗原特异性结合。免疫组织化学结…     

抗丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A单链抗体的制备及免疫组织化学研究

目的：研制抗丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A的人源噬菌体单链可变区抗体，并探讨其在临床病理学诊断中的应用价值。方法：以大肠杆菌表达的重组HCV非结构蛋白NS5A为固相抗原，利用抗原—抗体亲和性结合的原理，从半合成的人源可变区噬菌体抗体库中经过5轮“吸附—洗脱—扩增”的筛选过程及酶联免疫吸附试验(ELISA)和DNA序列分析，获得HCV NS5A的人源单使抗体；用该抗体对772l转染全长HCV cDNA后筛选的阳性克隆细胞中的HCV NS5A抗原进行免疫组化鉴定。结果：ELISA结果表明，制备的HCV NS5A人源单链抗体能与HCV NS5A抗原特异性结合；免疫组化结果表明，该抗体能够特异性识别HCV NS5A抗原，与正常肝细胞无交叉反应。结论：此法制备的单链抗体亲和性好，特异性强，且制备方法简便，周期短，为HCV NS5A病原的检测提供了新的有效的检测手段。     

丙型肝炎病毒核心蛋白人源单链可变区抗体的筛选与鉴定

目的 筛选、鉴定抗丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白的人源单链可变区抗体（ScFv)。方法 采用噬菌体表面展示技术，以重组的HCV核心蛋白为包被抗原，从噬菌体单链可变区抗体库中经过3轮“吸附－洗脱－扩增”筛选过程，获得抗原结合活性较强的HCV核心蛋白特异性人源单链可变区抗体片段阳性克隆，并对其进行免疫学及核苷酸序列测定。结果 筛选得到的ScFv片段具有抗HCV核心蛋白的特异性，基因序列分析结果表明符合人源单链可变区抗体基因序列的结构特征。结论 利用噬菌体抗体库技术，成功获得HCV核心蛋白的特异性人源单可变区抗体的编码基因。     

全人源肝癌噬菌体单链抗体基因的克隆及活性分析

从噬菌体单链抗体库中筛选克隆全人源肝癌抗体基因并进行活性鉴定.PCR鉴定阳性重组菌中人肝癌ScFv的插入率,以肝癌细胞SMMC-7721为抗原对所建抗体库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"的亲和筛选.将筛选后的ScFv采用ELISA法鉴定其与人肝癌细胞的结合活性.ScFv基因插入率为70%.在亲和筛选过程中,肝癌噬菌体单链抗体得到富集,收获率逐轮提高,第4轮为第一轮的381倍.利用噬菌体抗体库技术筛选出了肝癌噬菌体单链抗体,且筛选后的抗体片段与人肝癌细胞有特异性的结合活性.     

可溶性HCV非结构蛋白NS3人源单链可变区抗体在大肠杆菌中的表达

目的 获得可溶性的抗丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS3的人源单链可变区抗体(ScFv),为得到纯度高、活力强的NS3 ScFv和进一步HCV的治疗奠定基础。方法 采用噬菌体表面展示技术,以重组的HCV非结构蛋白NS3为包被抗原,从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程,获得抗原结合活性较强的HCVNS3人单链抗体ScFv片段克隆,并对其进行DNA序列及免疫活性测定。从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒转化琥珀突变非抑制型大肠杆菌HB2151;IPTG诱导表达HCV NS3可溶性单链抗体;ELISA和dot blot检测其抗原结合特异性。结果 克隆了HCV NS3的单链可变区抗体基因,经DNA酶切和序列分析表明,该抗体基因由747个碱基组成。ELISA和dot blot结果表明,在大肠杆菌HB2151中经IPTG诱导表达的可溶性HCV NS3的单链可变区抗体,具有结合丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3的特异性和免疫活性。结论 克隆、鉴定并在大肠杆菌HB2151中表达了可溶性的ScFv-NS3。     

抗细粒棘球蚴人工重组B抗原人源单链可变区抗体的筛选与在原核系统中的表达

目的 筛选并表达抗细粒棘球蚴人工重组B抗原（r-AgB)的人源单链可变区抗体（SCfv)。为细粒棘球蚴B抗原蛋白质功能的研究及包虫病的基因治疗开辟新途径。方法 采用噬菌体表面展示技术，以重组纯化的细粒棘球蚴B抗原为固相抗原，经过5轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程，从半合成的噬菌体抗体库中获得了抗原结合活性和特异性较强的含抗r-AgB的ScFv基因片段的阳性克隆，提取质粒，经SfiⅠ/NotⅠ酶切鉴定后，亚克隆到pCANTAB5E载体上，转化大肠杆菌XL1-Blue，经IPTG诱导，表达可溶性ScFv。结果 筛选得到的ScFv片段基因为768bp，经SDS-PAGE鉴定，在大肠杆菌XL1-Blue中表达的ScFv分子质量约28ku，经过ELISA和Western-Blot检测，该单链抗体具有较强的抗原结合特性和特异性，结论 细粒棘球蚴重组B抗原人源单链可变区抗体筛选和表达成功，为今后包虫病人源抗体的研究和应用奠定了基础。     

乙型肝炎病毒表面抗原人源单链可变区抗体基因的克隆与鉴定

目的 筛选,鉴定抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）表面抗原（ＨＢｓＡｇ）蛋白的人源单链可变区抗体（ＳｃＦｖ）的编码基因,为细胞内表达小分子单链抗体的研究及抗ＨＢＶ的基因治疗研究奠定基础。方法 采用噬菌体表面展示技术,以氯化铯超速离心法纯化的ＨＢｓＡｇ蛋白为固相抗原,从噬菌体单链可变区抗体半合成库中经过５轮“吸附－洗脱－扩增”淘洗过程,获得抗原结合活性较强的ＨＢｓＡｇ人源单链可变区抗体阳性克隆,并对其进行免疫     

丙型肝炎病毒NS3蛋白人源基因工程单链抗体的表达

目的在大肠杆菌XL1-Blue中表达可溶性的抗HCV非结构蛋白NS3的人源单链可变区抗体（single-chainvariablefragmentantibody,ScFv）。方法以重组的HCVNS3为抗原,利用噬菌体抗体库技术筛选含有抗-HCVNS3ScFv基因的噬菌体克隆。从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒,经SfiI/NotⅠ酶切鉴定后,亚克隆到pCANTAB5E载体;转化大肠杆菌XL1-Blue,提取质粒进行DNA序列测定;异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG）诱导表达HCVNS3可溶性单链可变区抗体。ELISA和斑点吸印杂交检测其与不同来源的抗原的结合活性。结果筛选到的HCVNS3的单链抗体基因,经限制性内切酶酶切和序列分析表明,该抗体基因由750bp组成,ELISA和斑点吸印杂交结果表明,在大肠杆菌XL1-Blue中表达的HCVNS3的单链抗体,可与不同来源的NS3抗原结合。结论大肠杆菌XL1-Blue表达的NS3-ScFv具有结合不同来源的HCVNS3的活性和特异性。     

抗TNF-α蛋白Fab抗体的制备和鉴定

目的制备人源性抗肿瘤坏死因子（TNF）-α蛋白的可溶性Fab抗体。方法用固相化的TNF-α蛋白从人天然Fab噬菌体抗体库中筛选出表达抗TNF-α蛋白Fab抗体的阳性克隆,经酶切及连接反应构建可溶性表达噬菌粒并转化至大肠杆菌BL21（DE3）pLysS中,IPTG高效可溶性表达,SDS-PAGE及Western blot分析鉴定抗体表达情况,ELISA鉴定其抗原结合活性和特异性。结果筛选并表达了人源性抗TNF-α蛋白的Fab抗体,在非还原SDS-PAGE中形成相对分子质量47 kD的条带;Western blot分析证实表达的蛋白即Fab抗体;ELISA筛选出的2株抗体（TA-04、TA-13）具有良好的抗原特异性和抗原结合活性,与小牛血清白蛋白无交叉反应。结论成功制备并鉴定了人源性抗TNF-α蛋白的可溶性Fab抗体。     

Preparation of human single chain Fv antibody against hepatitis C virus E2 protein and its identification in immunohistochemistry

AIM：To screen human single chain Fv antibody(scFv)against hepatitis C virus E2 antigen and identify its application in immunohistochemistry.METHODS:The phage antibody library was panned by HCVE2 antigen,Which was coated in microtiter plate.After five rounds of bipanning,56phage clones were identified specific toHCVE2antigen,The selected scFv clones were digested by SfiI/NotI and DNAwas sequenced.Then it was subcloned into the vector pCANTAB5Efor expression as E-tagged soluble scFv.The liver tissue sections from normal person and patients with choronic hepatitis B and chronic hepatitis C were immunostained with HCVE2 scFv antibody.RESULTS:The data of scFv-E2DNAdigestion and DNA sequencing showed that the scFv gene is composed of 750bp.ELISAand immunohistochemistry demonstrated that the human single chain Fv antibody against hepatitisCE2 antigen has a specific binding character with hepatitis virus E2antigen and paraffin-embedded tissue,but did not react with liver tissues from healthy persons or patients with chronic hepatitis B.CONCLUSION:We have successfully screened and identified HCVE2 scFv and the scFv could be used in the immunostaining of liver tissue sections from patients with chronic hepatitisC.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白3人源单链抗体的筛选与鉴定

目的 筛选、鉴定抗丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）非结构蛋白（ＮＳ）３的人单链抗体（ＳｃＦｖ）,以解决鼠单抗蝗免疫原性问题,为ＨＣＶ的基因治疗研究开辟新途径。方法 采用噬菌体表面展示技术,以重组的ＨＣＶＮＳ３为包被抗原,从噬菌体单链楞变区抗体库中经过５轮“吸附－洗脱－扩增”筛选过程,获得抗原结合活性较强的ＨＣＶＮＳ３人单链抗体（ＳｃＦｖ片段）阳性克隆,并对其进行免疫体及序列测定。结果 筛选出来的ＳｃＦｖ片段     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定

目的：制备丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NSS（NS5）的抗独特型单链可变区抗体scFv(抗－Id scFv)，为研制HCV NS5的抗－Id scFv疫苗奠定基础。方法：采用噬菌体表面展示技术，将HCV NS5单克隆抗体固相包被于Nunc板，从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮“吸附－洗脱－扩增”筛选过程，随机挑选80个克隆，利用酶联免疫吸附试验（ELISA）、交叉反应和竞争抑制实验，对其进行免疫学检测，获得与HCV NS5单克隆抗体结合活性较强的抗－Id scFv阳性克隆，并对HCV NS5特异性抗－Id scFv的编码序列进行序列测定分析。结果：筛选得到的HCV NS5抗－Id scFv片段由786bp组成，具有结合HCV NS5单克隆抗体的生物学活性和特异性。结论：用噬菌体抗体库技术能够成功地获得HCV NS5的抗－Id scFv。本实验结果为开展用抗－Id scFv防治丙型肝炎的研究创造了条件。     

人源性抗-HBc单链噬菌体抗体库的构建

目的 构建人源性单链噬菌体抗体库，为筛选人源性抗—HBc单链抗体奠定基础。方法 利用逆转录—聚合酶链反应(RT—PCR)和噬菌体表面展示技术，直接从乙肝病毒核心抗体(抗—HBc)阳性患者淋巴细胞中提取总RNA，逆转录成cDNA；合成全套人抗体可变区引物扩增抗体可变区基因，并将重、轻链可变区基因进行拼接装配成单链抗体(ScFv)基因，重组于噬菌粒载体叶pHEN1，转化抑制型大肠埃希菌E.coliTG1，以辅助噬菌体援救后，构建成人源性单链噬菌体库。结果 成功地构建了人源性抗—HBc单链噬菌体库，库容量达10^6。结论 利用RT—PCR和噬菌体表面展示技术可以成功构建人源性单链抗体库，并达到建库标准，可进一步从中筛选人源性单链抗体。     

人源性抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体文库的构建

目的 构建人源抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体文库,为结核特异性单链抗体的筛选奠定基础. 方法 从抗结核分枝杆菌抗体阳性患者淋巴细胞中提取总RNA,逆转录成cDNA,PCR扩增获得抗体的重、轻链可变区基因,然后拼接装配成单链抗体基因,重组于噬菌粒载体pCANTAB5S,转化大肠埃希菌E.coli TG1,以辅助噬菌体拯救后,构建人源性抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体库. 结果 成功构建人源性抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体文库,库容量达107. 结论 以结核患者淋巴细胞免疫球蛋白可变区基因片段和噬菌粒展示载体pCANTAB5S为基础,成功构建人源性抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体库,并达到建库标准,可进一步从中筛选获得结核特异性单链抗体.