无翅型MMTV整合位点家族成员10A在人牙髓组织和细胞中的表达

目的 观察无翅型MMTV整合位点家族成员10A(wingless-type MMTV integration site family,member 10A,Wnt10A)及Wnt通路相关分子在人牙髓组织和牙髓细胞中的表达特征,为进一步研究Wnt10A在人牙髓细胞增殖分化中的作用提供分子生物学依据.方法 选取因正畸或治疗原因拔除的完整离体双尖牙和第三磨牙,免疫组化法观察Wnt10A在牙髓组织中的定位表达,PCR法观察Wnt10A、Wnt通路下游分子及成牙本质细胞分化标志物(轴心抑制蛋白2、Dickkopf相关蛋白1、低密度脂蛋白受体相关蛋白4、淋巴增强因子1、骨钙蛋白、碱性磷酸酶、牙本质涎磷蛋白)在牙髓组织中的表达.采用酶组织块消化法体外培养人牙髓细胞并传代培养;PCR法分析第1～9代人牙髓细胞中Wnt10A、Wnt通路下游分子及成牙本质细胞分化标志物的表达水平.结果 免疫组化法和半定量PCR法结果显示Wnt10A和Wnt通路相关分子在牙髓组织中均有表达.体外培养的人牙髓细胞培养至第15天汇合并传代,传至第4代,细胞活跃增殖,细胞胞质清亮,伸展均一;至第9代,细胞增殖减缓,部分细胞死亡.Wnt10A和Wnt信号通路下游分子在整个牙髓细胞的体外传代培养中均有表达,牙本质涎磷蛋白在第4代牙髓细胞中表达水平最高(0.4178 ±0.0076),Wnt10A在第5、9代牙髓细胞中的表达水平[分别为(4.97 ±2.83)、(4.70±4.06)]均显著高于第2、4代[分别为(0.84 ±0.66)(0.70±0.45)](P＜0.05).结论 Wnt10A介导的Wnt信号通路在人牙髓组织和细胞中有表达激活,可能参与了成牙本质细胞的分化和牙本质的形成.     

神经营养素3促进人牙囊细胞成骨分化

目的 研究神经营养素3（NT-3）对人牙囊细胞（hDFCs）成骨分化的影响。方法 体外分离并培养hDFCs,免疫细胞化学染色法鉴定细胞来源,CCK-8法检测不同质量浓度NT-3对hDFCs增殖活性的影响,同时检测NT-3对hDFCs的碱性磷酸酶（ALP）活性,以及骨形态发生蛋白-2（BMP-2）、骨钙素（OCN）mRNA相对表达量的影响,并用茜素红染色法检测矿化情况。结果 波形丝蛋白和角蛋白染色结果表明hDFCs为间充质细胞来源。NT-3对hDFCs增殖活性无明显影响;当NT-3质量浓度为25、50、100 ng·mL^-1时能明显增强ALP活性,提高BMP-2、OCN mRNA的相对表达量,与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）,NT-3质量浓度为100 ng·mL^-1时BMP-2、OCN mRNA的相对表达量达到最高。当NT-3质量浓度为50、100 ng·mL^-1时矿化结节数量最多。结论 适宜质量浓度的NT-3能促进hDFCs的成骨分化。     

牙囊细胞成骨分化的研究进展

[摘要] 牙源性干细胞对口腔领域的新型细胞疗法的发展具有重要意义,引起广泛的关注。在牙体组织发育或再生过程中,牙源性干细胞也非常适合研究细胞过程。牙囊中的多能未分化细胞是牙源性干细胞的一种,这些细胞已被用于分化为成牙骨质细胞和成骨细胞的细胞过程的研究,对于牙周组织具有重要意义。本文关于信号通路、转录因子、细胞外基质蛋白对牙囊细胞成骨分化的研究作一综述。     

LIM矿化蛋白1在成骨分化前后人牙囊细胞中的表达

目的：研究人牙囊细胞成骨分化前后LIM矿化蛋白-1的表达。探讨LIM矿化蛋白-1在牙囊细胞向牙周组织分化过程中的作用。方法：组织块加酶消化法分离培养人牙囊细胞,实验组培养液中加入矿化诱导剂,对照组不加矿化诱导剂。培养4周后,免疫细胞化学检测骨涎蛋白的表达;Von Kossa染色检测矿化结节的形成。矿化诱导前后,采用RT-PCR技术检测LIM矿化蛋白-1。结果：培养4周,实验组矿化结节形成,骨涎蛋白免疫细胞化学呈阳性表达, Von Kossa染色阳性;对照组未形成矿化结节,骨涎蛋白表达弱阳性,Von Kossa染色阴性。 RT-PCR结果显示LIM矿化蛋白-1在实验组强阳性表达,对照组弱表达。结论：LIM矿化蛋白-1与胚胎期人牙囊细胞的体外矿化过程相关,提示LIM矿化蛋白-1可能在胚胎期牙囊细胞的分化、矿化中发挥一定作用。     

T型钙通道对人牙囊细胞成骨分化的影响

目的:探讨Ca2+对人牙囊细胞(hDFCs)成骨分化的影响及其分子机制.方法:分离培养hDFCs,免疫荧光染色及流式细胞术检测hDFCs的来源.反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测L型钙通道、T型钙通道、三磷酸肌醇受体以及雷诺定受体在hDFCs的表达及-成骨分化相关基因RUNX相关转录因子2(runt-related...     

无翅型MMTV整合位点家族成员5A/受体酪氨酸激酶样孤儿受体2在大鼠牙囊细胞中的表达及其意义

目的 观察在牙齿正常萌出过程中无翅型MMTV整合位点家族成员5A（Wnt5A）/受体酪氨酸激酶样孤儿受体2（Ror2）信号在大鼠体内外牙囊细胞表达的特点,探讨其与成熟破骨细胞形成及牙齿萌出的相关性。方法 分离出生后1~13 d的SD大鼠下颌骨,苏木精-伊红染色观察牙囊及牙槽骨生长发育过程,免疫组织化学法观察在下颌第一磨牙萌出过程中Wnt5A和Ror2在牙囊细胞中的表达。体外培养出生后5~6 d的SD大鼠第一磨牙牙囊细胞,免疫组织化学法观察Wnt5A、Ror2在牙囊细胞中的表达。结果 SD大鼠出生后第2天牙囊开始分化为牙周组织,1~3 d牙槽骨变化不明显,第4天起,破骨细胞数量明显增多。Wnt5A在出生后第1~3天的大鼠牙囊组织内无明显表达,第4天开始出现阳性表达,并持续表达至第13天。Ror2在出生后第1~3天的大鼠牙囊组织表达呈强阳性,而在第4~13天呈弱阳性。结论 Wnt5A、Ror2在牙萌出过程中有特定的时间分布,提示其可能参与牙齿萌出的调控。     

miR-335对牙囊干细胞成骨分化能力的影响

目的 体外研究大鼠牙囊干细胞成骨分化能力,以及miR 335对牙囊干细胞成骨分化能力的影响。 方法 双向差速法体外分离培养大鼠牙囊干细胞,进行成骨诱导。用茜素红染色检测成骨分化的能力,进而用qRT-PCR检测miR-335的表达,并且在瞬时转染miR-335 mimics和inhibitor后成骨诱导,用PCR和Western Blot的方法检测成骨能力的改变。 结果 双向差速法培养的牙囊干细胞具有成骨样细胞分化能力。成骨诱导的牙囊干细胞中miR-335表达降低,转染mimics后成骨能力降低,转染inhibitor后成骨能力升高。 结论 在体外条件miR-335可以抑制牙囊干细胞成骨分化。     

芒柄花素促进牙囊干细胞成骨向分化

目的:研究芒柄花素对牙囊干细胞(human dental follicle stem cells, hDFSCs)成骨分化的影响。方法:首先对hDFSCs进行分离、培养及鉴定,并使用含不同浓度芒柄花素(0、0.1、1、10μmol/L)培养基培养细胞。通过CCK-8实验、结晶紫染色和活/死细胞荧光染色评估细胞的活性状况;通过细胞骨架荧光染色观察细胞骨架状况;采用RT-qPCR检测细胞成骨相关基因的表达变化;利用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)染色及活性检测法评估细胞成骨分化过程中ALP活性的影响;通过茜素红染色法评估细胞成骨分化过程中钙化结节数量的影响。结果:hDFSCs具有干细胞特性;不同浓度的芒柄花素对hDFSCs活性无显著性影响;1μmol/L的芒柄花素可显著促进Runx2、OCN、Col-Iα1的mRNA表达;并能够提高的细胞内ALP活性和钙化结节的数量。结论:1μmol/L芒柄花素可促进hDFSCs的成骨分化。     

牙囊干细胞成骨分化基因调控网络的生物信息学分析

目的：应用生物信息学分析牙囊干细胞（DFSCs）成骨分化过程中基因调控网络。方法：从 GEO Datasets 数据库获取在 DFSCs 成骨分化过程中差异表达的基因。应用 DAVID 和 GeneMANIA 数据库对这些基因的关系进行分析。结果：从 GEO Datasets 数据库获得了大量 DFSCs 成骨分化过程中差异表达的基因,对差异表达明显（P ＜0．05）的289个基因进行分析,富集到“细胞分化”、“细胞增殖”、“骨骼系统发育”、“钙信号通路”等基因子集。其中 ALPL、CTSK、TUFT1、TGFBR2、FHL2、ROR2、STC1、POSTN,ZBTB16、FRZB、PRELP、IGFBP5等12个基因被富集在“骨骼系统发育”子集,这12个基因通过共表达、共定位、遗传学相互作用等彼此关联并与其它信号通路相联系。结论：DFSCs 成骨分化中许多差异表达的基因间存在相互作用的分子网路。需要从 WNT、TGFbeta、MAPK 等信号通路、同源盒转录因子及成骨分化标记物基因的整体关系上来认识 DF-SCs 成骨分化。     

Notch信号通路对大鼠牙囊细胞增殖和成骨分化的调控作用

目的 探讨Notch信号通路对大鼠牙囊细胞(rDFCs)增殖和成骨分化的调控作用.方法 体外培养rDFCs,经细胞形态、免疫组化鉴定rDFCs后,使用10 ng/L大鼠重组Jagged1蛋白、10μmol/L DAPT溶液、对照组培养液作用于细胞,CCK-8检测增殖能力;利用碱性磷酸酶、茜素红染色分析rDFCs成骨分化能力;Western Blot检测关键蛋白Notch受体胞内段(NICD)、碱性磷酸酶(ALP)、骨形成蛋白2(BMP2).结果 rDFCs呈成纤维细胞形态;rDFCs中波形丝蛋白明显表达,角蛋白未表达;诱导组ALP染色、茜素红染色均强于对照组;Jagged1第4天后能明显促进rDFCs细胞增殖,DAPT第4天后能显著抑制rDFCs细胞增殖(P<0.05).Jagged1组ALP、BMP2的表达趋势下降,DAPT组ALP、BMP2的表达趋势升高(P<0.05).结论 激活Notch信号通路可促进rDFCs的增殖,抑制Notch信号通路可促进rDFCs的成骨分化.     

Expression of odontogenic ameloblast-associated protein in the dental follicle and its role in osteogenic differentiation of dental follicle stem cells

ObjectiveOdontogenic Ameloblast-Associated Protein (ODAM) is encoded by a secretory calcium-binding phosphoprotein cluster gene, which generally plays an important role for mineralization. Dental follicle (DF) is essential in regulating bone formation for tooth eruption. This study aims to reveal ODAM expression in the DFs of developing and erupting molars, and to determine the possible role of ODAM.DesignDFs were collected from human third molars and rat mandibular molars for gene expression assessment and for establishment of cell cultures. RT-PCR and western blot were conducted to determine ODAM expression. Over- or silencing expression of ODAM in the dental follicle stem cells (DFSCs) was done by transfecting the cells with ODAM plasmid or siRNA to evaluate ODAM effects on osteogenesis.ResultsRat DFs weakly expressed ODAM at early-postnatal days, but a chronological increment of ODAM expression from days 1 to 11 was observed. Differences in expression of ODAM were seen in the human DFs of different individuals. In vitro, ODAM was expressed in DFSCs, but almost no expression in DF-derived fibroblast-like cells. Forcing the DFSCs to overexpress ODAM accelerated osteogenesis, whereas continuously silencing the ODAM in the DFSCs reduced osteogenesis only at 2 weeks of osteogenic induction.ConclusionsODAM is differentially expressed in the DFs of different age molars. Its expression is coincident with the increased bone formation of tooth crypt during tooth eruption in rat DFs. Increase of ODAM expression may accelerate osteogenic differentiation of DFSCs. Thus, ODAM expression in the DF may regulate bone formation for timely tooth eruption.     

Endogenous hydrogen sulfide is involved in osteogenic differentiation in human periodontal ligament cells

ObjectiveEndogenous hydrogen sulfide (H₂S) has recently emerged as an important intracellular gaseous signaling molecule within cellular systems. Endogenous H₂S is synthesized from l-cysteine via cystathionine β-synthase and cystathionine γ-lyase and it regulates multiple signaling pathways in mammalian cells. Indeed, aberrant H₂S levels have been linked to defects in bone formation in experimental mice. The aim of this study was to examine the potential production mechanism and function of endogenous H₂S within primary human periodontal ligament cells (PDLCs).DesignPrimary human PDLCs were obtained from donor molars with volunteer permission. Immunofluorescent labeling determined expression of the H₂S synthetase enzymes. These enzymes were inhibited with D,L-propargylglycine or hydroxylamine to examine the effects of H₂S signaling upon the osteogenic differentiation of PDLCs. Gene and protein expression levels of osteogenic markers in conjunction with ALP staining and activity and alizarin red S staining of calcium deposition were used to assay the progression of osteogenesis under different treatment conditions. Cultures were exposed to Wnt3a treatment to assess downstream signaling mechanisms.ResultsIn this study, we show that H₂S is produced by human PDLCs via the cystathionine β-synthase/cystathionine γ-lyase pathway to promote their osteogenic differentiation. These levels must be carefully maintained as excessive or deficient H₂S levels temper the observed osteogenic effect by inhibiting Wnt/β-catenin signaling.ConclusionsThese results demonstrate that optimal concentrations of endogenous H₂S must be maintained within PDLCs to promote osteogenic differentiation by activating the Wnt/β-catenin signaling cascade.     

Collagenous matrix supported by a 3D-printed scaffold for osteogenic differentiation of dental pulp cells

Objective

A systematic characterization of hybrid scaffolds, fabricated based on combinatorial additive manufacturing technique and freeze-drying method, is presented as a new platform for osteoblastic differentiation of dental pulp cells (DPCs).

细胞外基质PDMS硬度对牙髓干细胞增殖和成骨分化的影响

目的:研究细胞外基质聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)硬度对牙髓干细胞(DPSCs)增殖和成骨分化的影响及其机制.方法:收集南京医科大学附属常州市第二人民医院因正畸而拔除的前磨牙作为实验材料,分离、培养DPSCs,制作PDMS基质.根据不同硬度,将PDMS基质分为A组(基料/固化剂=1...     

正畸力调控牙周膜干细胞成骨分化的动物实验研究

目的 研究不同正畸力值对牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)分化的作用及机制.方法 分别用50 g、150 g力值建立大鼠牙齿移动模型,加力7d后分离培养PDLSCs,检测其生物学功能和分子信号通路.结果 相比对照组,加力7d后,50 g力值组大鼠第一磨牙近中移动...     

miR-124对牙髓间充质干细胞成骨分化的影响及机制探讨

目的: 观察微小RNA（miR）-124对牙髓间充质干细胞（DPSCs）成骨分化的影响,并探讨其可能机制。方法: 取对数期DPSCs,分为空白组、空载组、miR-124 inhibitor组和miR-124 inhibitor联合氮-[氮-(3,5-二氟苯乙酰)-L-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸丁酯（DAPT,Notch信号通路抑制剂]组。空白组不处理,空载组转染阴性对照载体inhibitor-NC,miR-124 inhibitor组转染miR-124 inhibitor,miR-124 inhibitor联合DAPT组转染miR-124 inhibitor,并加入DAPT使其终浓度为5 μmol/L。转染48 h后,采用CCK-8法检测增殖能力;经诱导液诱导2周后,采用对-硝基苯磷酸盐（P-NPP）法检测碱性磷酸酶（ALP）活性;茜素红染色法检测钙化结节面积;Western印迹法检测细胞中发状分裂相关增强子1（HEY1）、发状分裂相关增强子2（HEY2）和细胞周期蛋白D1基因（CCND1）蛋白表达量。采用SPSS 19.0软件包对数据进行统计学分析。结果: 与空白组、空载组相比,miR-124 inhibitor组CCK-8 24、48、72 h A₄₅₀值,ALP活性A₄₅₀值,钙化结节面积构成比和HEY1、HEY2、CCND1蛋白表达量显著升高（P<0.05）;与miR-124 inhibitor组相比,miR-124 inhibitor联合DAPT组CCK-8 24、48、72 h A₄₅₀值、ALP活性A₄₅₀值、钙化结节面积构成比和HEY1、HEY2、CCND1蛋白表达量显著降低（P<0.05）。结论: 下调miR-124可促进DPSCs成骨分化,推测其作用机制与激活Notch信号通路有关。