c血清型变形链球菌致龋相关基因/DNA片段的批量克隆与高通量筛选

目的筛选含致龋相关基因／DNA片段的阳性克隆，为探究变形链球茵致龋的分子机制奠定基础。方法将抑制消减杂交方法获得的高毒力株特异的消减PCR产物与T／A栽体pCR2．1连接，将连接产物转化E．coli TOP0F’感受态细胞，进行蓝白筛选。对96个转化子进行Colony PCR，将PCR产物点样于同一尼龙膜上，分别与地高辛标记的变形链球茵高、低毒力株基因组DNA／AluI酶切产物杂交，高通量筛选阳性克隆。结果随机挑取了96个白色或白色中央有蓝色的茵落，经过Colony PCR，其中有1个转化子的扩增产物为双带，其余均为0．2～2kb之间的单一条带。经过杂交，以与高毒力株基因组有杂交信号，而与低毒力株基因组无杂交信号或信号明显弱的转化子为阳性克隆。筛选的阳性率为50％左右，阳性克隆中含有c血清型变形链球茵致龋相关的基因／片段。结论对抑制消减杂交方法获得的变形链球茵高毒力株特异的消减PCR产物进行批量克隆和高通量筛选，获得了致龋相关的基因／DNA片段。     

c血清型变形链球菌抑龋相关基因文库的构建

目的: 构建c血清型变形链球菌抑龋相关基因的抑制消减文库,为变形链球菌抑龋基因的筛选奠定基础。方法:从一对c血清型变形链球菌高、低毒力株中提取基因组DNA,AluⅠ酶切,以低毒力株的DNA酶切产物为testerDNA,高毒力株的DNA酶切产物为driverDNA,testerDNA连接接头后与driverDNA进行抑制消减杂交,并检测连接效率与消减效率。将获得的消减PCR产物,即差异基因 /差异DNA片段,与pCR2.1载体连接,转化E.coliTOP10F′感受态细胞,进行蓝白筛选。结果:AluⅠ酶切高、低毒力株基因组DNA,产生的酶切产物位于 0.1~2kb之间。testerDNA与接头的连接效率>25%,抑制消减杂交后消减效率检测显示,同时存在于tester与driverDNA中的 23SrRNA基因在消减组中出现时间较未消减组晚 12个循环,将消减PCR产物克隆后,挑取96个转化子,构建抑龋相关基因的抑制消减文库。结论:利用抑制消减杂交技术进行c血清型变形链球菌高、低毒力株之间基因组DNA的比较,初次构建了抑龋相关基因的抑制消减文库。     

利用抑制消减杂交技术构建变形链球菌高毒力株特异的基因文库

目的　构建c血清型变形链球菌高毒力株特异的基因文库,为变形链球菌毒力基因的筛选奠定基础。方 法　从一对c血清型变形链球菌高、低毒力株中提取基因组DNA,用四碱基限制性内切酶酶切,以高毒力株的DNA 酶切产物为tester DNA,低毒力株的DNA酶切产物为driver DNA,tester DNA连接接头后与driver DNA进行抑制消减 杂交,并检测连接效率与消减效率。将获得的消减PCR产物与pCR2.1载体连接,转化E.coliTOP10F′感受态细胞, 进行蓝白筛选。结果　从识别四碱基序列的限制性内切酶中,筛选出AluⅠ,用于制备变形链球菌基因组DNA的 代表性片段,产生的酶切产物位于0·1~2.0 kb。tester DNA与接头的连接效率大于25%,抑制消减杂交后消减效率 检测显示,同时存在于tester与driver DNA中的23S rRNA基因在消减组中出现时间较未消减组晚6个循环,将消减 PCR产物克隆后,挑取96个转化子,构建高毒力株特异的基因文库。结论　利用抑制消减杂交技术,进行c血清型 变形链球菌高、低毒力株之间基因组DNA的比较,初次构建了高毒力株特异的基因文库。     

牙龈卟啉单胞菌不同毒力株基因差异的比较研究

目的比较牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，Pgingivalis）高毒力株W83与低毒力株标准参考菌ATCC 33277之间的差异基因。方法采用抑制消减杂交技术（SHH）对比牙龈卟啉单胞菌高毒力株W83与低毒力株标准参考菌ATCC 33277的基因差异。以高毒力株W83为被检菌，低毒力株ATCC 33277为参考菌，将提取的基因组DNA用内切酶Rsa Ⅰ酶切，连接特殊设计的接头进行两次消减杂交和PCR扩增，得到消减混合物，与TA克隆载体连接，转化到JM109中，建立消减文库，经PCR筛选鉴定阳性克隆，进而对部分片段进行测序和同源分析。结果经SSH筛选鉴定得到36个片段大小为88～372bp的阳性克隆基因片段。结论从全基因角度研究牙龈卟啉单胞菌高毒力株W83与标准株ATCC 33277之间的分子遗传差异，为牙龈卟啉单胞菌致病基因的筛选及今后牙周病预防、诊治的靶标提供依据。     

变形链球菌gcp基因突变菌株的构建及鉴定

目的:构建变形链球菌gcp基因突变菌株,以便研究变形链球菌gcp基因功能。方法:厌氧培养变形链球菌UA159,以前期研究中pMD19T-gcp为模板,PCR扩增gcp基因内部序列,连接自杀载体pVA8912,酶切鉴定;将鉴定正确的质粒转化变形链球菌UA159,挑取阳性克隆,提取基因组DNA,用PCR结合酶切鉴定。结果:发现PCR产物及插入片段大小与预期值相符,表明成功构建了重组质粒pVA8912/gcp;经PCR鉴定:gcp基因失活株基因组中gcp基因内部成功插入了重组载体片段。结论:成功构建了变形链球菌gcp基因失活株,为该基因功能的研究奠定了基础。     

口腔微生物与免疫学

变形链球菌GbpA的GBD免疫防龋实验研究；附着状态对口腔白色念珠菌ALS基因mRNA的影响；第一恒磨牙窝沟菌群组成；c血清型变形链球菌致龋相关基因，DNA片段的批量克隆与高通量筛选；外源性糖对变形链球菌活性氧代谢的作用。     

口腔链球菌丙酮酸氧化酶调节基因的克隆和功能分析

目的 :阐明体外扩增得到的口腔链球菌丙酮酸氧化酶基因的上游区序列是否即是调控序列 ,是否具有启动子活性。方法 :将口腔链球菌丙酮酸氧化酶基因调节区PCR扩增产物经HindⅢ酶切 ,克隆至载体PKK2 32 - 8,转化E .coliJM 10 9,通过氯霉素抗性筛选阳性菌落 ,重新增菌后取质粒DNA ,再经酶切鉴定。将重组子点种于不同浓度的氯霉素平板上 ,37℃培养 18h ,观察菌落生长情况 ,测定重组质粒转化子对氯霉素的抗性水平。结果 :筛选得到 1个阳性菌落 ,重组质粒DNA的酶切产物经 10 g/L琼脂糖凝胶电泳 ,表明获得片段的Mr约为 1.3kb ,与预计大小相符 ,证实其为阳性重组克隆。测定重组质粒转化子对氯霉素的抗性水平显示其抗性达 10 2 0 μg/mL。 结论 :本研究已成功克隆口腔链球菌丙酮酸氧化酶调节基因。     

口腔扁平苔藓发病相关基因cDNA消减文库的建立

目的：建立口腔扁平苔藓差异表达基因的cDNA文库。方法：采用改良消减杂交技术,以口腔扁平苔藓病变组织总mRNA为实验组,采用改良的SMART PCR cDNA合成技术进行反转录,正常黏膜组织总mRNA为驱动组,进行扣除杂交,筛选出两组差异表达的cDNA,与T载体进行T／A连接构建文库,然后转化高效感受态大肠杆菌DHSa进行文库扩增,随机挑取阳性克隆进行酶切鉴定。结果：扩增消减cDNA文库获得200余个白色阳性克隆,随机挑取的100个阳性克隆酶切后,含500bp以上插入片段的克隆64个,占64％。结论：用改良消减杂交技术成功构建了口腔扁平苔藓差异表达基因的消减cDNA文库,该文库的建立为进一步筛选、克隆口腔扁平苔藓相关基因奠定了基础。     

变形链球菌乳酸脱氢酶基因及同源区的克隆和序列分析

目的：克隆变形链球菌乳酸脱氢酶基因(ldh)及其两侧同源区基因片段。方法：应用PCR技术扩增乳酸脱氢酶及其两端同源区序列片段，插入克隆载体pMD18-T中，转化大肠杆菌DH5α，Amp^ 抗性挑选阳性克隆，经酶切及PCR鉴定后进行序列测定。结果：PCR扩增产物特异；抗性筛选的4株菌落均为阳性克隆；用DNASIS将序列测定的结果与基因Bank中报道的序列对比分析，同源性为99．1％。结论：根据同源性分析的结果，可确定该克隆片段为变形链球菌乳酸脱氢酶及其两侧同源区序列。     

牙根发育不全疾病致病差异表达基因文库的建立

目的：建立先天性牙根发育不全疾病患儿与其正常兄弟间致病差异表达基因的cDNA文库。方法：采用改良消减杂交技术，以先天性牙根发育不全疾病患儿与其正常兄弟外周静脉血的总mRNA为对比材料，筛选出候选相关致病基因差异表达的cDNA，将其与pGEM-T载体进行T／A连接构建文库，然后转化高效感受态大肠杆菌进行文库扩增，随机挑取100个白色克隆进行酶切鉴定。结果：扩增消减cDNA文库获得400余个白色阳性克隆，随机挑取的100个白色克隆经酶切后90％有插入片段。结论：用改良消减杂交技术成功构建了先天性牙根发育不全疾病致病差异表达基因的消减cDNA文库，该文库的建立为进一步筛选、克隆该疾病的候选致病相关基因奠定了基础。     

c血清型变形链球菌低毒力株特异DNA片段的生物信息学分析

目的:发现c血清型变形链球菌低毒力株特异的新基因或已知基因的新功能,推测、鉴定基因所编码蛋白质的功能。方法:对筛选得到的26个变形链球菌低毒力株特异的DNA片段进行序列测定,利用BLAST 2.2.6程序进行核苷酸和含6相位阅读框架编码氨基酸的相似性检索。结果:变形链球菌低毒力株特异的DNA片段大小在113~776 bp之间,平均G C含量为38.27%,其中有8个片段为新的基因片段,在GenBank中登记。结论:发现了8个新的基因片段以及低毒力株特异的DNA片段的主要功能,为下一步的基因功能研究奠定基础。     

变形链球菌高毒力株特异DNA片段的序列测定及生物信息学分析

目的 将筛选得到的变形链球菌高毒力株特异的DNA片段序列与数据库中已知序列进行对比,发现高毒力株特异的新基因或已知基因的新功能,推测、鉴定基因所编码蛋 白质的功能。方法 对筛选得到的c血清型变形链球菌高毒力株特异的31个DNA片段进行序列测定,利用BLAST 2.2.6程序进行核苷酸和含6相位阅读框架编码的氨基酸的相似性检索。结果 变形链球菌高毒力株特异的31个DNA片段中,2个为重复克隆,片段大小在113～776 bp之间,平均G+C含量为38.59%,与已完成测序的变形链球菌UA159基因编码区的G+C含量相近。发现了5个新的基因片段,其余的片段均与变形链球菌UA159基因组中的基因有高度的同源性。依据推测的功能,高毒力株特异的DNA片段主要与信号转导及转录调节、修复应激损伤、生化代谢、外膜蛋白合成及粘附以及目前功能仍未知或不确定的假想蛋白有关。结论 利用生物信息学相关软件及数据库进行c血清型变形链球菌高毒力株特异DNA片段的基因分析、识别及功能预测,发现了5个新的基因片段以及高毒力株特异的DNA片段的主要功能,为进一步的基因功能研究奠定基础。     

Identification of the genes associated with a virulent strain of Porphyromonas gingivalis using the subtractive hybridization technique

Background/aims:  Porphyromonas gingivalis , a major etiological organism implicated in periodontal disease, can be classified into virulent and avirulent strains. Our aim was to identify a gene for the virulence of P .  gingivalis .
Methods:  The subtractive hybridization technique was employed to identify the genes specific to P .  gingivalis W83, a virulent strain. In this study, P. gingivalis W83 was used as the tester strain, and P .  gingivalis ATCC 33277 was the driver strain. The prevalence of W83-specific genes was determined by Southern blot analysis of several P. gingivalis strains.
Results:  We obtained 575 colonies using the subtractive hybridization technique. From among these, 26 DNA fragments were subjected to a homology search using the BLAST program. Compared with strain ATCC 33277, strain W83 contained 12 unique clones. The specificities of the isolated DNA fragments were analyzed among four P. gingivalis strains by Southern blot analysis. Five genes showed specificity for strain W83 compared with strain ATCC 33277. All five genes were also identified in strain W50.
Conclusions:  The subtractive hybridization technique was effective in screening the two strains for specific DNA sequences, some of which might be responsible for determining virulence. The results suggested that several genes specific to strain W83 were associated with its virulence. Further analysis of these DNA fragments will provide important information on the pathogenesis of virulent P .  gingivalis strains.     

PCR同时检测变形链球菌和远缘链球菌

目的:建立一种快速、简便地同时检测变形链球菌和远缘链球菌的方法。方法:以变形链球菌Dextranase基因设计引物,用PCR检测变形链球菌群细菌。结果:变形链球菌(血清型c、e、f)的PCR扩增产物为720 bp;远缘链球菌(血清型d、g)的PCR扩增产物为460 bp;道勒链球菌(血清型h)910 bp;仓鼠链球菌(血清型a),鼠链球菌(血清型b)均为1 270 bp。其它异种菌均不能扩增出产物,因此该PCR检测具有高度的特异性。从细菌纯培养物中PCR检测的敏感性为105菌落形成单位(colony-form ing un its,CFU)。结论:PCR能同时检测变形链球菌和远缘链球菌。该检测方法具有较高的敏感性和特异性,有望运用于临床检测。     

变形链球菌蔗糖酶Ⅱ基因体外扩增片段的Southern杂交、序列分析及意义(二)

将变链菌NG_8ScrA基因432bp扩增片段纯化后,采用随机引物法标记成DNA探针,与13株变链菌相应的扩增产物进行Southern杂交,结果均出现杂交信号。进一步采用不对称PCR法测序,结果与文献报道的序列一致。表明PCR扩增产物特异性好,ScrA基因在变链菌及部分口腔常居菌间存在广泛同源性。     

同一口腔中c血清型变形链球菌高、低毒力株的筛选

目的：由同一高龋者口腔中分离出c血清型变形链球菌高致龋毒力的菌株和低致龋毒力的菌株，为变形链球菌的比较基因组研究奠定基础。方法：从4个方面比较24株c血清型变形链球菌临床分离株对唾液包被羟基磷灰石的黏附能力、产酸和耐酸能力以及合成胞外多糖的能力。结果：筛选出位于同一口腔中的高、低毒力株。结论：同一口腔中存在着2株或2株以上致龋能力不同的c血清型变形链球菌。