TGF-β3在小鼠放射性肺纤维化中的作用研究

目的观察经60 Coγ射线全胸照射后小鼠肺脏的改变,探究转化生长因子-β3(TGF-β3)在小鼠放射性肺纤维化中的作用。方法180只C57BL/6雌性小鼠随机分为对照组、照射组和TGF-β3组。照射组和TGF-β3组经60 Co γ射线单次全胸照射,照射后每周分别腹腔注射0.5 ml 0.9%生理盐水和TGF-β3(1μg/kg)一次。于照射后3、7、14 d和1、3、6个月活杀,肺脏经HE和天狼星红染色观察病理,检测小鼠肺内循环纤维细胞( CF)的数量。结果建立小鼠放射性肺纤维化模型。照射后6个月时,TGF-β3组肺脏见点状实变,部分成纤维细胞增生,少量胶原纤维沉积。照射后14 d到6个月,照射组肺脏 CF 数量比对照组明显增加( P <0.05)。照射后1个月时,TGF-β3组肺脏CF数量比照射组明显减少( P<0.05)。结论 TGF-β3使CF在肺内的聚集明显减少,其可能在延缓肺纤维化发生过程中发挥重要作用。     

PDTC对TGF-β_1诱导的大鼠纤维化肺成纤维细胞转分化的影响

目的:通过核因子-κB(NF-κB)抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)探讨NF-κB对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的肺成纤维细胞转分化的影响。方法:采用体外细胞培养,免疫细胞化学技术,流式细胞术等技术,检测PDTC对TGF-β1诱导的成纤维细胞表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的影响。结果:TGF-β1诱导肺成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞(MF),表达α-SMA增强(P<0.05),PDTC抑制了TGF-β1的诱导作用(P<0.05),单独应用PDTC对肺成纤维细胞转分化无影响。结论:NF-κB促进TGF-β1诱导肺纤维化模型中肺成纤维细胞转分化成MF。     

Smad3在TGF-β1诱导肌成纤维细胞增殖中的作用

目的 探讨TGF-β1及其信号转导分子Smad3在肌成纤维细胞(C2C12)增殖中的作用.方法 TGF-β1作用C2C12细胞,对Smad3基因进行RNA干扰,用[3H]测定法检测TGF-β1诱导的C2C12细胞增殖.结果 0、1、5和10 ng/mL TGF-β1作用C2C12细胞后,其[3H]值(cpm/min)分别是(630±17),(907±19),(1 493±25),(1 808±24),F=3080.499,P=0.000.经200 pmol/L siKNA-Smad3转染24 h,再用5 ng/mL TGF-β1作用24h,测定细胞增殖,其[PH]值(cpm/min)分别是(464±30)(空白对照组),(1062±50)(内对照组),(428±38)(实验组),F=412.186,P=0.000.结论 TGF-β1通过Smad3信号转导促进C2C12细胞增殖并呈剂量依赖性,siRNA-Smad3可以有效地阻断其信号转导而降低C2C12细胞增殖.     

Notch1在TGF-β1诱导心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞转化中的作用

目的：研究转化生长因子β1（TGF-β1）诱导心肌成纤维细胞（CFs）向肌成纤维细胞（MFB）转分化过程中Notch1的变化情况,探讨在此转分化过程中Notch1的可能作用.方法：体外分离培养CFs,以10μg/LTGF-β1诱导CFs向MFB转分化.实验分为对照组,TGF-β1作用24,48,72h组,采用消化法测定羟脯氨酸（HYP）含量;免疫荧光、免疫印迹法测定α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达;实时定量PCR、免疫印迹法测定Notch1 mRNA及蛋白表达.利用γ分泌酶抑制剂DAPT（75μmol/L）阻断Notch1受体活化.实验分对照组,DAPT作用24,48,72h组,检测SMA及胶原的表达变化.结果：TGF-β1作用后,与对照组相比较α-SMA,HYP表达量随TGF-β1诱导时间的增加呈上升趋势,而Notch1则呈下降趋势,均以72h最显著（P〈0.01）;加入DAPT后,与对照组相比较α-SMA,HYP表达量随DAPT作用时间增加呈上升趋势,以72h最显著（P〈0.01）.结论：TGF-β1可以诱导CFs向MFB转分化,Notch1在此过程中的表达呈下降趋势,而DAPT阻断Notch1活化后可以促进CFs向MFB转分化.     

rhBMP-2诱导的相关信号转导分子在NIH3T3细胞中的表达

目的 :观察NIH3T3细胞中BMP信号转导因子的表达 .方法 :用免疫组化和原位杂交方法检测NIH3T3细胞中BMP ,BMPⅠ ,Ⅱ型受体和Smad1,4 ,5的表达 ,在细胞培养液中加入 5 0 μg·L-1rhBMP 2 ,检测细胞的碱性磷酸酶 (ALP)活性和骨钙素 (OC)含量观察细胞是否有成骨趋向 .结果 :细胞中有BMPⅠ ,Ⅱ型受体和Smad1,4 ,5的表达 ;没有BMP的表达 ;加入 5 0 μg·L-1rhBMP 2后 ,ALP活性和OC含量均增高 .结论 :rhBMP 2作用于NIH3T3细胞后 ,细胞有成骨趋向 .NIH3T3细胞是rhBMP 2的靶细胞 ,细胞中有BMPs信号转导因子的表达     

基因转移人TGF-β1在NIH/3T3细胞中表达鉴定

目的：研究转移人转化生长因子β１（ＴＧＦ－β１）在真核细胞系中蛋白表达。方法：借助真核质粒表达载体,将人ＴＧＦ－β１转移入小鼠成纤维细胞株（ＮＨ／３Ｔ３）细胞中,经Ｇ４１８筛选,克隆扩增,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ、ＰＣＲ、ＰＴ－ＰＧＲ鉴定,并经水貂肺上皮细胞（ＣＣＬ－６４）生长抑制法,对克隆细胞分泌ＴＧＦ－β１蛋白进行活性检测。结果：证实了重组人ＴＧＦ－β１基因在ＮＩ     

TGF-β1/ILK/FSP1信号通路在环孢素诱导肾小管上皮细胞转分化中的作用

目的通过体外特异阻断试验,探讨转化生长因子-β1/整合素连接激酶/成纤维细胞特异蛋白1（TGF-β1/ILK/FSP1）信号通 路在环孢素A致肾小管上皮细胞转分化中的作用。方法构建并鉴定ILK-RNAi慢病毒表达载体ILKshRNA。将NRK52E细 胞培养分为5组,分别为空白对照组;环孢素诱导组：细胞培养液加环孢素A1 mg/L;TGF-β1干预组：阻断剂（SB431542）10 μmol/L 加环孢素A1 mg/L;ILK干预组：阳性转染ILKshRNA后加入环孢素A1 mg/L;阴性对照组：阴性转染ILKshRNA后加入环孢素 A1 mg/L。实时荧光定量PCR检测TGF-β1、ILK和FSP-1 mRNA的表达,Western blot检测TGF-β1、ILK、FSP-1的蛋白表达。免 疫组化检测细胞爬片α-SMA阳性表达细胞数。结果与空白对照组比较,环孢素诱导组细胞TGF-β1、ILK、FSP-1基因及蛋白表 达量均显著增加（P<0.05）;TGF-β1 干预组经SB431542 处理后,TGF-β1、ILK 和FSP1 水平较环孢素诱导组降低（P<0.05）;经 ILKshRNA沉默后,ILK和FSP1水平较环孢素诱导组降低（P<0.05）。α-SMA阳性细胞数经SB431542和ILKshRNA处理后较 环孢素诱导组降低（P<0.05）。结论TGF-β1/ILK/FSP1信号通路激活是环孢素A诱导大鼠肾小管上皮细胞转分化的重要机制 之一,ILK参与环孢素A诱导大鼠肾小管上皮细胞间充质转分化过程。     

Smads信号通路在转化生长因子-β1诱导气道上皮细胞转分化中的作用

目的:探讨Smads信号通路在rhTGF-β1体外诱导气道上皮细胞表型向肌成纤维细胞转分化中的作用.方法:用TGF-β1(10 μg/L)处理气道上皮细胞株16HBE,Western blot法检测刺激不同时间点细胞核蛋白内磷酸化Smad 2和Smad 3(30min、24h和48 h)的表达;脂质体法瞬时转染Smad 7表达载体pCDNA 3.0/Smad 7或空载体,转染20h后,加入TGF-β1处理,RT-PCR法检测刺激不同时间E-钙黏蛋白、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的基因表达,免疫荧光法检测α-SMA的蛋白表达. 结果:①正常对照组核内无磷酸化-Smad 2表达,Smad 3有微弱表达,TGF-β1刺激30min时表达量明显增加,随着刺激时间的延长,表达量进一步增加;②TGF-β1刺激24h,瞬时转染Smad 7组α-SMA表达量低于相应转染空载体组,E-钙黏蛋白表达量明显高于相应转染空载体组,TGF-β1刺激36h后Smad 7组α-SMA、E-钙黏蛋白表达量与相应空载体组相似;免疫荧光显示转染Smad 7组α-SMA阳性细胞数显著低于空载体组(P<0.05). 结论:Smads信号通路参与了TGF-β1诱导的支气管上皮细胞株16HBE向肌成纤维细胞转分化过程.     

金钱鱼凋亡相关基因SaAR对NIH-3T3细胞凋亡的影响

目的观察金钱鱼凋亡相关基因SaAR(Scatophagusargusapoptosis related gene)对成纤维细胞增殖的影响。方法体外培养NIH-3T3细胞,应用脂质体将不同浓度的pcDNA3-SaAR真核表达质粒分别转染细胞并设立对照组进行比较,应用流式细胞术测定细胞凋亡率。结果SaAR基因可显著诱导NIH-3T3细胞凋亡,并呈现剂量依赖性(P<0.05)。结论SaAR基因对体外培养的血管外膜成纤维细胞凋亡有一定的诱导作用。     

阿魏酸钠对NALP3炎性复合体的调节及在肺纤维化中的作用

目的探讨NALP3炎性复合体在肺纤维化过程中的活化情况,并观察阿魏酸钠(sodium ferulate, SF)在肺纤维化过程中对炎性复合体的影响。方法体内实验以博莱霉素(BLM)气管滴注构建小鼠肺纤维化模型(BLM组),治疗组在用BLM建模后第2天以SF（100 mg/kg）每日1次腹腔注射（SF组),对照组(不建模)和BLM组注射等量磷酸盐缓充液,建模后第21天取肺组织行Masson染色,观察肺组织胶原沉积（Ashcroft评分）情况;以碱水解法测定肺组织羟脯氨酸（HYP）含量;体外实验以H ₂ O₂刺激小鼠胚胎成纤维细胞NIH-3T3以构建成纤维细胞氧化应激模型,干预组以SF 400 μg/mL预处理2 h,再用H₂O₂培养细胞,采用Real time-PCR检测小鼠肺组织及体外实验分组处理细胞相关炎性细胞因子NALP3、caspase-1、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、collagen-1、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA）mRNA,Western blot检测小鼠肺组织NALP3蛋白,分组处理细胞NALP3、collagen-1、α-SMA蛋白的表达;ELISA测定肺组织上清及细胞上清中IL-1β质量浓度。结果体内实验 SF处理后,肺纤维化模型小鼠Ashcroft评分及HYP含量较BLM组有所减少（P<0.05）;肺组织NALP3炎性复合体NALP3、ASC、caspase-1mRNA,NALP3蛋白的表达和IL-1β的合成较BLM组均有减少（P<0.05）。体外实验显示H ₂ O₂能有效刺激NALP3炎性复合体NALP3、ASC、caspase-1 mRNA的表达（P<0.05）与IL-1β的分泌（P<0.05）,并且能有效促进成纤维细胞NALP3蛋白、collagen-1和α-SMA的表达（P<0.05）;SF预处理能在基因水平抑制NALP3、ASC、caspase-1、collagen-1和α-SMA的表达（P<0.05）,且在蛋白水平减少NALP3、collagen-1、α-SMA的表达（P<0.05）,降低IL-1β水平（P<0.05）。结论阿魏酸钠可能通过抑制氧化应激诱导的NALP3炎症复合体活化,从而抑制成纤维细胞活化,展现其抗纤维化作用。     

JNK信号通路在TGF-β1诱导肺间质成纤维细胞基质分泌中的作用

目的:探讨C-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase,JNK)、P38信号通路的激活在转化生长因子β1(TGF-β1)体外诱导人肺间质成纤维细胞基质分泌中的作用及意义.方法:将肺间质成纤维细胞株分为TGF-β1组、TGF-β1 SB203580组、TGF-β1 DMSO组、TGF-β1 SB600125组、正常对照组.采用免疫印迹法(Western blot)测定总JNK(T-JNK)、磷酸化JNK(p*-KNK)、总P38(T-P38)、磷酸化38(p*-P38)、纤维连接蛋白(FN)、层连粘蛋白(LN)水平的表达变化,采用3H-thymidine incorporation(3H-TdR)检测细胞增殖水平.结果:正常体外培养的肺间质成纤维细胞经TGF-β1刺激后p*-JNK水平显著升高,p*-P38蛋白表达无明显变化;FN、LN蛋白表达水平在TGF-β1诱导48 h后表达显著升高,JNK的特异性化学抑制剂SB600125可以减少p*-JNK、FN、LN蛋白表达水平和细胞增殖水平,P38的特异性化学抑制剂SB203580对上述指标表达无影响.结论:JNK信号通路在TGF-β1诱导的肺间质成纤维细胞分泌基质过程中被激活,并且参与TGF-β1诱导的肺间质成纤维细胞分泌基质过程.     

miR-107对HepG2细胞增殖和细胞周期的影响

目的探讨miR-107对HepG2细胞增殖和细胞周期的影响,以及对CDK6蛋白表达的调控。方法将50 nmol/L的miR-107 mimics 或阴性对照序列由 Lipofectamine 2000转染入人肝癌细胞株 HepG2中;qRT-PCR 法检测转染后HepG2细胞内miR-107表达水平;四甲基偶氮唑蓝( MTT)法检测细胞增殖能力;流式细胞术分析转染后细胞周期的变化;Western blot法检测CDK6蛋白表达水平。结果转染后24 h,miR-107 mimics转染组细胞内miR-107表达水平较空白对照组明显升高(P<0.05);与空白对照组相比,miR-107 mimics转染组HepG2细胞增殖受抑制( P<0.05),处于G0/G1期的细胞增多( P <0.05), CDK6蛋白表达下调( P <0.05)。结论 miR-107能够抑制 HepG2细胞增殖并诱导HepG2细胞G0/G1期阻滞,这可能与其抑制 CDK6蛋白的表达有关。     

阿托伐他汀对TGF-β1诱导的大鼠肺成纤维细胞分化的影响

【目的】观察阿托伐他汀对肺纤维化大鼠的肺成纤维细胞增殖的影响及其对TGF-β1诱导的大鼠肺成纤维细胞表型分化的影响。【方法】建立Wistar大鼠肺纤维化模型,1周后取肺组织进行成纤维细胞原代培养,细胞经鉴定后以不同浓度的阿托伐他汀对试验组细胞进行干预,采用MTT法测定细胞增殖情况;TGF-β1诱导细胞分化,同时给予不同浓度阿托伐他汀干预,免疫细胞化学染色（SP）法检测药物对肌成纤维标志物-αSMA表达的影响。【结果】MTT结果显示：各剂量组中不同干预天数所测得的OD值之间存在显著差异（P〈0.01）。各时间点所测OD值与不同用药物剂量之间存在交互作用（P〈0.01）。各剂量组对细胞的抑制作用之间存在显著差别（P〈0.01）。免疫细胞化学染色结果显示：药物因素对-αSMA的表达量有影响（P〈0.01）,区组因素对-αSMA的表达量有影响（P〈0.01）。【结论】阿托伐他汀可抑制肺纤维化大鼠肺成纤维细胞的增殖,同时可抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞的分化,这主要表现在抑制细胞增殖、改变其形态、减少肌成纤维细胞的标志性产物-αSMA的产生上。     

JAK-STAT通路参与CTGF诱导人胚肺成纤维细胞转分化的研究

目的研究JAK-STAT信号通路在重组人结缔组织生长因子(recombinant human,CTGF)诱导人胚肺成纤维细胞(HFL-I)转分化过程中的作用。方法将体外培养的HFL-I分为正常对照组、CTGF组及CTGF+JAK-STAT特异性抑制剂通路抑制剂AG490组,选取不同时相点,Western blotting测定平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、磷酸化蛋白(p-STAT3)和总蛋白STAT3的蛋白表达,RT-PCR检测STAT3 mRNA表达。结果正常体外培养的HFL-I有微量的p-STAT3、α-SMA表达,加入20ng/ml CTGF诱导15min后p-STAT3水平明显升高(P<0.05),30min时升至顶峰后逐渐减弱;诱导24h后α-SMA表达显著升高(P<0.05)。AG490 50μmol/L预处理60min,p-STAT3和α-SMA表达明显抑制(P<0.05或P<0.01)。结论 CTGF诱导HFL-I转分化为肌成纤维细胞,JAK-STAT通路参与上述过程,其特异性抑制剂AG490可有效抑制该效应。     

TGF-β1在低氧诱导肺动脉内皮细胞向平滑肌样细胞转分化中的作用

目的研究低氧条件下肺动脉内皮细胞（PAEC）向平滑肌样细胞的转分化及转化生长因子β1（TGF—β1）在此转分化过程中的作用。方法将经免疫磁珠法（用血小板内皮细胞粘附分子1做免疫分选标记）纯化后的原代肺动脉内皮细胞分别在常氧（含21％O2、5％CO2、74％N2）和低氧（含1％O2、5％CO2、94％N2）条件下培养1、4、7d，用核酸干扰法（RNAi）阻断TGF—β1的表达，用逆转录-聚合酶链式反应法（RT—PCR）和Western blot分别检测各组细胞TGF—β1 mRNA和蛋白的表达，并用免疫细胞化学法检测平滑肌细胞标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白（α—SM—actin）的表达，结合形态学观察从而判定有无平滑肌样细胞的转分化。结果低氧可增加肺动脉内皮细胞TGF—β1 mRNA和蛋白的表达（P〈0．05），RNAi沉默TGF—β1基因表达后可明显降低其mRNA和蛋白含量（P〈0．05），随着低氧培养时间的延长，肺动脉内皮细胞转分化为平滑肌样细胞的比率逐渐增加（P〈0．05）；阻断TGF—β1表达后，平滑肌样细胞的转化率明显降低（P〈0．05）。结论肺动脉内皮中存在具有转分化为平滑肌样细胞潜能的细胞；低氧可明显促进转分化，TGF-β1在此转分化过程中起重要作用。     

TGF-β3对增生性瘢痕成纤维细胞的生物学作用

目的：观察外源性TGF－β3对增生性瘢痕成纤维细胞（HSFB）生长增殖的影响，为临床治疗提供理论依据。方法：用MTT比色法检测TGF－β3对HSFB增殖活性的影响，^3H-脯氨酸掺入法检测细胞内胶原合成，免疫组化检测I，Ⅲ型胶原及TGF－β3蛋白表达情况。结果：TGF－β3可抑制HSFB细胞增殖，下调TGF－β1蛋白及I型胶原蛋白表达。结论：TGF－β3具有抗瘢痕形成作用，有望在临床中应用。     

酸性成纤维细胞生长因子诱导大鼠肾小管上皮细胞转分化的作用及机制

目的　探讨酸性成纤维细胞生长因子 (AcidfibroblastgrowthfactoraFGF)在大鼠肾小管上皮细胞株 (NRK)转分化中的作用 ,为肾小管 间质纤维化的防治提供理论依据。方法　在NRK细胞的培养基内加入不同剂量的重组人aFGF ,并在Ⅰ型胶原处理过及未处理的玻璃表面 ,无血清培养 6d。使用透射电镜、免疫细胞化学对肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞形态及表型的转变进行评估。结果　不同剂量的aFGF(1、1 0、50ng/ml)处理后的NRK细胞形态和表型发生不同程度的改变 :体积增大、失去尖端 基底极性和微绒毛、细胞延长、具有浸润特征的前后向双末端极性、出现肌动蛋白中间丝结构。免疫组化和Westernblot分析显示加入aFGF后角蛋白表达减少 ,有肌成纤维细胞的特异性标志物α 平滑肌动蛋白 (α SMA)的表达。α SMA阳性细胞的比例与aFGF的浓度呈正相关 ,亲和抗aFGF抗体可消除这种转分化现象。加入aFGF后 ,在玻璃表面α SMA阳性细胞数 (34 4± 0 0 90 ) %较Ⅰ型胶原处理培养表面α SMA阳性细胞数 (74 6± 0 1 0 1 ) %有显著差异 (P <0 0 5)。结论　aFGF在促进肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞转分化的过程中有重要的意义 ,该过程亦与细胞的生长环境有关 ,提示肾小管上皮细胞的表型转化是肾间质纤维化的重要原因     

胚胎干细胞治疗博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的研究

目的 研究静脉注射胚胎干细胞（ESC）对肺纤维化小鼠的治疗作用。方法 气管内滴注博来霉素8.5mg/kg制作C57/BL6雌性小鼠的肺纤维化模型。治疗组(n=20)静脉注射S8小鼠ESC,对照组(n=10)注射生理盐水。治疗组又分为单次治疗(n=10)和重复治疗(n=10),两者均在造模后1h静脉注射ESC,重复治疗组在造模后3d再次静脉注射ESC。记录小鼠的生存时间,测定小鼠肺组织的羟脯氨酸含量,肺脏病理学观察炎症状态。利用秩和检验统计3组小鼠生存时间,方差分析3组小鼠肺羟脯氨酸含量的差异。结果 接受干细胞治疗后,肺纤维化模型小鼠的生存时间(d)延长,重复治疗组更加明显（对照组、单次治疗组、重复治疗组分别为7.8±2.8、8.4±3.8、13.5±5.6,P<0.01）;肺羟脯氨酸含量(μg/mL)降低 [对照组、单次治疗组、重复治疗组分别为（8.59±1.14）、（8.23±1.09）、（5.51±0.39）,P<0.01）];肺脏病理检查显示肺组织炎症程度降低,结构破坏减轻。结论 静脉注射胚胎干细胞可以减轻博来霉素诱导的小鼠肺部炎症和肺纤维化,延长肺纤维化小鼠的生存时间。