大鼠源卡氏肺孢子菌p55抗原基因克隆和序列分析

目的克隆大鼠源卡氏肺孢子菌55kDa抗原（p55）基因。方法取肺孢子菌病大鼠肺组织制备肺孢子菌DNA，并以此模板扩增p55基因，将PCR产物与pGEM—T载体连接．转化E．coli DH5a．在含氨苄青霉素（Amp）的LB培养基上筛选出重组子，提取质粒进行PCR扩增、酶切鉴定、序列测定及序列比较分析。结果p55基因体外扩增产物长度为l286bp，重组质粒经PCR及酶切鉴定结果表明获得正确重组子，测序结果与文献报道同源性为99．8％。结论成功扩增了p55基因，并插入克隆载体pGEM—T中。p55基因的克隆为进一步建立基因分型、疫苗等研究打下基础。     

乙型肝炎病毒S基因的克隆

目的:对乙型肝炎病毒S基因进行克隆。方法:依据S基因两侧序列设计引物并引入酶切位点;聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因;对PCR产物和载体质粒pCMV-tag2B分别作EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后,T4连接酶连接;将连接产物转化为大肠杆菌DH5α;增菌培养后提取重组质粒;对重组质粒作PCR、酶切及测序鉴定。结果:PCR扩增出目的基因片段;目的片段与载体连接后成功;获得含重组质粒的DH5α阳性克隆;经鉴定和测序,重组质粒含有完整正确的S基因序列。结论:成功构建了S基因的克隆载体,获得大量S基因片段,为研究S基因对HBsAg检测的影响奠定了基础。     

重组人GDNF基因逆转录病毒真核表达载体的构建及表达

目的 构建含有胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和加强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)的逆转录病毒载体,将其导入包装细胞PT67,检测基因在细胞中的表达.方法 PCR法扩增GDNF基因及IRES2-EGFP基因,测序验证正确后与逆转录病毒载体pLXSN连接,构建重组逆转录病毒质粒pLXSN-IRES2-EGFP-GDNF.EcoR I酶切鉴定重组质粒.脂质体Lipofectamine 2000介导下转染包装细胞PT67,G418筛选并检测病毒滴度.流式细胞仪和荧光显微镜分别检测转染效率和基因表达.结果 PCR扩增得到大小约558 bp和1 308 bp的特异性条带,测序证实,获得正确的人GDNF序列和EGFP序列.经EcoR I酶切鉴定,成功构建重组质粒pLXSN-IRES2-EGFP-GDNF.荧光显微镜检测显示GDNF基因获得良好表达,流式细胞仪检测转染效率为24.4%.结论 正确克隆了人GDNF基因全序列并构建重组逆转录病毒pLXSN-IRES2-EGFP-GDNF质粒.基因转染包装细胞PT67获良好表达.     

刚地弓形虫RH株ROP18-ROP12复合基因真核表达载体的构建

目的构建刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)棒状体蛋白18(ROP18)与ROP12的复合基因真核表达重组质粒,并检验其在真核细胞中的表达情况。方法重组质粒p VAX1-ROP18和p VAX1-ROP12分别经Bam HⅠ和XbaⅠ双酶切,将ROP12基因克隆至p VAX1-ROP18重组质粒。经菌落PCR、酶切及测序鉴定正确的重组表达质粒p VAX1-ROP18-ROP12转染至He La细胞。同时设空质粒组、p VAX1-ROP18转染组和p VAX1-ROP12转染组。提取各组He La细胞的总RNA并逆转录为c DNA,分别进行管家基因β-肌动蛋白和ROP18-ROP12复合基因的RT-PCR鉴定;同时,采用间接荧光免疫法和蛋白质印迹(Western blotting)法检测重组质粒p VAX1-ROP18-ROP12瞬时转染He La细胞后蛋白的表达情况。结果重组质粒p VAX1-ROP18-ROP12的菌落PCR电泳显示在约2 373 bp处出现特异性扩增片段,与预期大小相符。提取重组质粒经HindⅢ、Bam HⅠ和XbaⅠ单酶切、双酶切及三酶切鉴定均正确。测序结果显示,p VAX1-ROP18-ROP12重组质粒与已发表的弓形虫RH株ROP18基因(登录号为AM075204.1)序列一致性为100%,与弓形虫RH株ROP12基因(登录号为DQ096559.1)序列一致性为99%。脂质体转染后各组β-肌动蛋白的RT-PCR扩增产物均为613 bp,与预期大小相符。p VAX1-ROP18-ROP12转染组的ROP18-ROP12复合基因扩增产物大小为2 373 bp,而其他组未见条带。间接荧光法检测显示,在重组质粒转染的He La细胞胞浆中观察到黄绿色荧光,而对照组无黄绿色荧光。Western blotting法检测显示,融合蛋白ROP18-ROP12相对分子质量(Mr)约为85 000。结论构建了重组质粒p VAX1-ROP18-ROP12,该质粒能在真核细胞中表达。     

BCG_3174基因敲除卡介苗菌株的构建及鉴定

目的为了证实BCG_3174是BCG基因组中存在的潜在抑制凋亡功能基因,拟构建BCG_3174敲除菌株并进行鉴定。方法以BCG中国株的基因组DNA为模板,PCR扩增BCG_3174基因,扩增产物用Van91Ⅰ酶切并回收产物。载体p0004S转化E.coli DH5α培养,用Van91I酶切载体p0004S。将酶切BCG_3174基因片段的左、右臂以及酶切载体p0004S的3.6 kb和1.6 kb两个片段连接,转化入DH5α中培养,筛选阳性克隆并测序鉴定,构建重组质粒p0004S-ΔBCG_3174。将载体phAE159转化E.coli HB101培养,提取phAE159后以PacI酶切,同时以PacI酶切重组质粒p0004S-ΔBCG_3174,以T4连接酶连接。加入E.coli HB101感受态细胞并培养,提取质粒后用PacI酶切鉴定,阳性克隆命名为phAE159-ΔBCG_3174,电击转化耻垢分枝杆菌mc2155感受态细胞。取BCG菌液与噬菌体裂解液混合共培养,提取敲除菌株的基因组DNA,鉴定正确的菌株命名为ΔBCG_3174。结果凝胶成像显示扩增产物与预期目标大小一致,左臂大小为887 bp,右臂大小为931 bp。阳性克隆测序确证左、右臂正确连入p0004S且序列无突变,p0004S-ΔBCG_3174序列与预期一致。PacⅠ酶切phAE159载体产生约42 kb和4 kb两条片段,酶切p0004S-ΔBCG_3174质粒产生7.1 kb片段,该片段亚克隆入PacⅠ酶切的phAE159载体后产生重组质粒phAE159-ΔBCG_3174,酶切鉴定证实phAE159-ΔBCG_3174构建正确。BCG_3174基因敲除的BCG基因组PCR扩增产物大小约为5.6 kb,与预期大小相符,BCG_3174基因敲除BCG菌株ΔBCG_3174构建成功。结论成功制备BCG_3174基因敲除的BCG菌株ΔBCG_3174,为BCG_3174基因的功能研究奠定了基础。     

弓形虫酵母表达质粒pPIC9K-GRA1的构建及鉴定

目的构建弓形虫致密颗粒抗原-1（GRA1）的酵母表达质粒,为进一步研究GRA1蛋白功能奠定基础。方法PCR扩增编码GRA1目的基因,用EcoRⅠ/NotⅠ分别对扩增产物和酵母表达质粒pPIC9K进行双酶切,将GRA1定向克隆到pPIC9K的EcoRⅠ/NotⅠ位点,对重组质粒进行PCR,双酶切初步鉴定后做序列测定。结果特异扩增出预期的GRA1片段,大小为573bp,扩增产物经双酶切后成功连接到pPIC9K中,经PCR,双酶切及序列测定证明重组质粒中含有GRA1读框。结论成功构建弓形虫GRA1酵母真核表达质粒。     

弓形虫真核表达质粒pcDNA3/wx2的构建与鉴定

目的构建弓形虫新基因wx2的真核表达质粒,以其做为弓形虫DNA疫苗研究其保护性。方法PCR扩增出编码新基因wx2ORF,用EcoRI/XhoⅠ分别对扩增产物和pcDNA3进行双酶切,将wx2ORF定向克隆到pcDNA3的EcoRI/XhoⅠ位点,对重组质粒进行PCR,双酶切初步鉴定后做序列测定。结果特异扩增出预期的wx2ORF片段,大小为570bp左右,扩增产物经双酶切后成功连接到pcDNA3中,经PCR,双酶切及序列测定表明重组质粒中含有wx2读框。结论成功构建弓形虫真核表达质粒pcDNA3/wx2。     

白纹伊蚊乙酰胆碱酯酶基因片段克隆及鉴定

目的　从白纹伊蚊中分离、克隆及鉴定乙酰胆碱酯酶 (ACh E)基因片段。　方法　根据已知的果蝇和斯氏按蚊 ACh E氨基酸序列保守区域设计简并引物 ,对白纹伊蚊 ACh E基因片段进行扩增 ,将凝胶回收的 PCR产物经与 T-载体质粒连接进行 T/ A克隆 ,用α互补筛选法筛选重组质粒克隆 ,用碱裂解法提取重组质粒 DNA并对重组质粒进行酶切鉴定和 PCR鉴定。　结果与结论　获得与设计相符的白纹伊蚊 ACh E基因片段 PCR扩增产物并对其作出鉴定     

人KIM-1基因实时荧光定量PCR标准质粒的构建

目的制备用于人KIM-1基因mRNA实时荧光定量PCR检测的标准品质粒。方法通过PCR扩增出目的片断,纯化PCR产物与p MD18-T载体连接,转化宿主菌E.coli DH5α,获得阳性克隆;通过PCR扩增鉴定和测序分析,确认重组质粒完整正确。提取重组质粒测定DNA浓度后,10倍倍比稀释,建立KIM-1质粒标准品。结果 KIM-1基因目的片段成功重组至p MD18-T载体上,扩增目的片段长度为131 bp,测序结果证实所构建的质粒序列与NCBI基因库KIM-1序列性一致。结论成功构建KIM-1基因实时荧光定量PCR标准品质粒。     

弓形虫微线体分泌蛋白TgMIC10基因的克隆、表达及鉴定

目的 克隆、表达及鉴定弓形虫（RH株）微线体分泌蛋白TgMIC10编码基因。为建立一种灵敏检测弓形虫感染的实验方法作准备。方法 提取弓形虫速殖子总RNA，设计并合成引物，RT-PCR扩增TgMIC10编码基因，与克隆载体pGEM-T连接。经酶切和PCR鉴定及DNA测序证实后．亚克隆入表达载体pBK-CMV，IPTG诱导表达pBK-TgMIC10阳性重组子转化宿主菌E．coli BL21．Western blot鉴定。结果 PCR法扩增出了一597bp左右的DNA片断，将重组质粒pGEM-TgMIC10、pBK-TgMIC10分别作EcDRⅠ和XbaⅠ双酶切，均能得到一个大小与PCR扩增产物一致的插入片断。表明Tg—MIC10基因的克隆和亚克隆均获成功，用IPTG诱导带有重组质粒pBK—TgMIC10的大肠杆菌，产物行SDS-PAGE。可得到一约21kDa融合蛋白。Western-blot法鉴定该蛋白能被弓形虫感染的兔血清所识别。     

两种克隆方法在3种截短的泡球蚴Em18原核表达载体构建中的比较

目的比较3种截短的泡球蚴Em18基因聚合酶链反应(PCR)扩增产物经TA克隆和直接酶切2种方法,在原核表达质粒构建中的运用。方法PCR扩增带有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的3种截短的泡球蚴Em18基因,经2种方法构建3种截短的Em18原核表达质粒：①PCR扩增产物与T载体连接构建T-Em18,重组质粒经EcoRⅠ/XhoⅠ酶切,电泳分离、纯化目的片段,再与经过EcoRⅠ/XhoⅠ酶切的原核表达载体pET41a( )连接；②PCR扩增产物经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切,电泳、纯化,直接与经过相同限制性内切酶酶切的pET41a( )连接。结果先经TA克隆,再经酶切构建3种截短的泡球蚴Em18原核表达载体获得成功。而采用直接酶切PCR扩增产物的构建方法未获得成功。结论TA克隆可用于对直接酶切效果不好的PCR扩增片段与表达载体的连接构建,方法简便高效,可提高带有限制性酶切位点的PCR扩增片段克隆人原核表达载体的效率。     

人环氧合酶-2(hCOX-2)编码基因的克隆及其反义核酸转染胃癌细胞的初步研究

目的环氧合酶-2与肿瘤发生的关系已成为肿瘤研究的新热点之一.本研究旨在获得hCOX-2编码基因序列,构建其正、反义真核表达载体,并用反义重组载体转染COX-2高表达的胃癌细胞,以进一步研究其生物学作用及其在肿瘤发生中的作用机制.方法按文献报道的hCOX-2核苷酸序列设计合成PCR引物,利用总RNA抽取试剂盒从COX-2高表达的培养的人胃癌细胞系SGC7901中提取细胞总RNA,反转录合成cDNA,再用PCR方法扩增目的基因序列.PCR产物经DNA序列测定证实后,利用引物5端引入的EcoRⅠ,XbaⅠ酶切位点,通过粘端连接,将所获目的基因分别按正、反两个方向定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1中.对两种重组质粒分别进行相应的酶切鉴定.采用脂质体介导的方法用COX-2反义核酸转染SGC7901细胞,经G418筛选后,随机挑选细胞克隆.通过RT-PCR检测COX-2 mRNA水平的变化.结果应用RT-PCR反应扩增获得大小约1.9kb的特异性片段.经DNA序列分析,证实与文献报道的hCOX-2编码区序列一致.重组正义表达载体pcDNA3.1/hCOX2(+)用EcoRⅠ,XbaⅠ双酶切后,产生大小约5.4kb,1.9kb的片段;重组反义表达载体pcDNA3.1/hCOX2(-)通过Pst Ⅰ酶切,产生大小约4.5kb,1.5kb与1.3kb的片段,与预期结果相符.转染细胞经筛选后,随机挑选、扩增了3个细胞克隆,其中1个克隆稳定表达COX-2反义核酸,RT-PCR提示其COX-2 mRNA水平显著下降.结论成功克隆了hCOX-2编码基因序列,并构建了其正、反义真核表达载体.反转录PCR是克隆基因的简便、有效方法.为扩增高GC含量的cDNA模板,可在PCR反应体系中加入适量的DMSO,并采用较高退火温度.在PCR引物中加入限制性内切酶位点,可以方便地实现基因的定向克隆.COX-2反义核酸在胃癌细胞系SGC7901中得到稳定转染,转染细胞COX-2mRNA表达显著受抑制.     

大鼠肝细胞生长因子与肝再生增强因子融合基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的 构建大鼠肝细胞生长因子(rHGF)与大鼠肝再生增强因子(rALR)融合基因的真核表达质粒并进行鉴定,为新的肝纤维化治疗方法奠定实验基础.方法 分别以重组质粒pUC18-rHGF和pUC18-rALR为模板,进行PCR扩增,获得rHGF和rALR的基因片段;利用重叠延伸PCR方法将获得的基因片段通过一个连接序列(linker)进行连接,构建融合基因rHGF-linker-rALR,将融合基因定向插入pcDNA3.1真核表达质粒的Kpn Ⅰ和Xba Ⅰ酶切位点之间,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-rHGF-linker-rALR,并进行双酶切及测序鉴定.结果 rHGF和rALR的PCR扩增产物电泳后分别观察到2200 bp和400 bp的条带,与理论值相符.重叠延伸PCR获得的融合基因产物电泳后观察到2600 bp的条带,与预期值一致.重组真核表达质粒pcDNA3.1-rHGF-linker-rALR经双酶切,电泳后观察到2600 bp和5400 bp的两条DNA条带,与预期值相符,测序鉴定结果表明序列正确.结论 成功构建了rHGF与rALR融合基因的真核表达质粒,为肝纤维化的基因治疗奠定了实验基础.     

增强型绿色荧光蛋白真核表达载体的构建和表达

目的 构建增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP)编码基因的真核表达载体pcDNA3．1( )-GFP，并观察其在Hep2细胞中的表达情况。方法据已知的EGFP基因序列，设计合成1对引物，并引入HindⅢ和EcoR V酶切位点。应用PCR技术，从含有EGFP的pAdTrack-CMV中扩增EGFP编码基因。通过TA连接将其克隆人pGEM-T easy载体，经PCR及限制性内切酶鉴定后，插入真核表达质粒pcDNA3．1( )中，转化Escherichia coli DH50感受态细胞，于Amp^ LB平板上筛选阳性克隆。重组子经HindⅢ和EcoR V双酶切、PCR鉴定，将该载体转染入喉癌细胞Hep-2后48h观察EGFP表达情况。结果 成功构建了含EGFP编码基因的真核表达载体pcDNA3．1( )GFP，并成功转染Hep2细胞，在倒置荧光显微镜下呈现绿色光。结论 获得可产生绿色荧光的EG-FP，能方便地用作报告基因和筛选标记。     

弓形虫P24基因敲除转染质粒pGB/P5-P3的构建

目的构建弓形虫P24(TgP24)基因敲除转染质粒pGB/P5P3(GRA2/BleP245’UTRP243,UTR),为TgP24基因敲除奠定基础。方法根据TgP24基因序列,设计并合成两对特异引物(P1toP4),采用PCR技术特异扩增TgP24基因的5,端非翻译区2.5kb片段(P245’UTR)和3’端非翻译区2.89kb片段(P243’UTR),将其分别亚克隆入pCR2.1TOPOTA载体,构建质粒P245’UTR/TA和P243’UTR/TA;重组质粒P245’UTR/TA经KpnⅠ和BglⅡ双酶切后,再将纯化的P245’UTR片段亚克隆入转染质粒GRA2/Ble的KpnⅠ和BglⅡ位点,构建重组质粒pGBP5(GRA2/BleP245’UTR);重组质粒P243’UTR/TA经BamHⅠ和NotⅠ双酶切后,纯化P243’UTR片段,再将其定向克隆到重组质粒pGBP5的BamHⅠ和NotⅠ位点,从而构建弓形虫TgP24基因敲除转染质粒pGB/P5P3。重组质粒经DNA序列测定证实目的片段插入正确。结果经过PCR筛选、限制性酶切及DNA测序鉴定,证实P245’UTR和P243’UTR两片段正确插入质粒GRA2/Ble的KpnⅠ和BglⅡ及BamHⅠ和NotⅠ位点,位于药物选择ble基因的上,下游。结论成功构建弓形虫P24基因敲除转染质粒pGB/P5P3。     

弓形虫抗原基因真核表达质粒pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4的构建

目的构建弓形虫抗原基因真核表达质粒pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4。方法根据弓形虫RH标准株SAG1和SAG4基因序列分别设计一对特异引物(分别含有HindⅢ/BamHⅠ和BamHⅠ/XbaⅠ内切酶位点),PCR扩增目的基因,并将这两段基因分别克隆至PEGM-T Easy载体,经菌落PCR和双酶切鉴定;用HindⅢ/BamHⅠ和BamHⅠ/XbaⅠ分别双酶切PEGM-T Easy-SAG1、PEGM-T Easy-SAG4和pVAX1,得到含内切酶位点的SAG1和SAG4基因片段,分别与pVAX1连接,构建pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4真核表达质粒,经菌落PCR和双酶切鉴定。结果PCR扩增得到目的基因SAG1和SAG4,测序结果分别与弓形虫RH标准株SAG1和SAG4基因比较,符合率均为100%。构建PEGM-T Easy-SAG1、PEGM-T Easy-SAG4克隆质粒和pVAX1-SAG1、pVAX1-SAG4真核表达质粒,分别经菌落PCR和双酶切鉴定,显示722bp的SAG1基因片段和511bp的SAG4基因片段均插入载体PEGM-T Easy和pVAX1中。结论成功克隆了pVAX1-SAG1、pVAX1-SAG4真核表达质粒,为弓形虫基因疫苗应用研究奠定了基础。     

阴道毛滴虫铁氧还蛋白基因的克隆和序列分析

目的　构建阴道毛滴虫铁氧还蛋白 (ferredoxin ,Fd)基因重组质粒 ,并进行克隆及序列分析。　方法　根据Fd基因已知序列 ,设计合成 1对引物 ,应用螯合树脂 (Chelex-100 )提取基因组DNA ,用聚合酶链反应 (PCR)扩增出Fd基因 ,克隆入pMD-18T载体 ,转化大肠埃希菌JM109感受态细胞 ,经PCR及酶切鉴定、测序。　结果　Fd基因体外扩增产物长度为 306 bp ,重组质粒经PCR及酶切鉴定结果表明获得正确重组子 ,测序结果表明其片段与已知序列吻合。　结论　克隆出阴道毛滴虫Fd基因。     

Sonic hedgehog蛋白N端基因片段毕赤酵母表达载体的构建

目的 构建含Sonic hedgehog(SHH)蛋白N端基因片段的毕赤酵母表达载体.方法 通过BamH 1、Xho 1双酶切、T4连接酶连接,将SHH-N基因片段插入pET22b原核表达载体,构建pET22b-SHH-N质粒;经PCR扩增,产物再与pTA2载体连接,构建pTA2-SHH-N重组质粒;经EcoR 1及Not 1双酶切、T4连接酶连接,将SHH-N端基因片段插入pPIC9K质粒,构建pPIC9K-SHH-N重组质粒;通过线性化、脱磷酸化,将线性化pPIC9 K-SHH-N DNA转染毕赤酵母菌株GS115,最后经PCR扩增和测序鉴定.结果 转染的毕赤酵母经PCR扩增和测序证实含有SHH-N基因片段,与原始的基因片段序列完全一致.结论 成功地构建含SHH-N蛋白基因片段的毕赤酵母表达载体.     

口蹄疫病毒P1+3CD基因重组腺病毒的构建

目的构建包含有O型口蹄疫病毒(FMDV)强毒结构蛋白(P1)基因及弱毒非结构蛋白(3CD)基因的重组腺病毒,为进一步研制FMD活载体疫苗奠定基础。方法通过RT-PCR方法扩增得到含有FMDV P1、3CD编码区的目的基因。P1基因经BglⅡ和XhoⅠ,3CD基因经XhoⅠ和XbaⅠ双酶切后与经BglⅡ和XbaⅠ双酶切处理的腺病毒穿梭载体pAd Track-CMV连接。将获得的重组穿梭质粒与腺病毒骨架载体在大肠杆菌内同源重组获得重组腺病毒质粒。线性化后的重组腺病毒质粒转染293细胞,通过观测细胞病变及报告基因绿色荧光蛋白的表达鉴定重组的腺病毒。结果在pAd Track-CMV载体中成功克隆了P1+3CD基因,并与腺病毒骨架载体在大肠杆菌中实现了同源重组。线性化后的重组腺病毒质粒转染293细胞后可观测到典型的细胞病变与绿色荧光蛋白的表达。结论成功获得了含有FMD P1+3CD基因的重组腺病毒,为FMD活载体疫苗的研制提供了依据。     

乙型肝炎病毒全长基因的扩增及克隆

目的 建立血清标本经聚合酶链反应(PCR)扩增乙型肝炎病毒(HBV)全长基因的新方法,并初步进行克隆分析,从而为HBV分子生物学及致病机理研究奠定基础.方法 针对位于整个HBV基因序列中的两个缺口区设计含酶切位点的引物,扩增3.2 kb HBV全长DNA,经酶切及连接后克隆人PUC18载体.结果 用PCR方法成功获得了3.2 kb HBV DNA,经Sal Ⅰ酶切克隆入PUC18载体,获得重组质粒PUC18/HBV3.2,酶切鉴定和PCR扩增证实重组质粒中含有3.2 kb HBV全长DNA,成功构建了HBV全基因克隆.结论 成功建立了从患者血清中克隆HBV全基因组的方法,为从全基因水平深入研究乙型肝炎病毒变异与致病机理的关系奠定了基础.