基因芯片技术在检测乙型肝炎病毒 P区YMDD变异中的研究

目的 用基因芯片检测未经抗病毒治疗的HBV DNA阳性血清中HBV P区YMDD变异情况,从分子生物学角度了解YMDD两种变异的状态,为科学合理地指导临床抗病毒治疗及预测患者临床预后提供有力的依据。方法 将150份未经抗毒治疗的HBV DNA阳性血清,用PCR方法扩增P区,扩增产物与基因芯片上的寡核苷酸进行杂交,杂交结果通过扫描仪扫描到计算机上,经软件分析可得到HBVY MDD野生型及其YVDD和／或YIDD变异型结果,并对部分阳性标本用基因序列测序证实。结果 150份HBV DNA阳性血清,用基因芯片方法检出阳性标本(包括YMDD野生型和变异型)共122例,占81．3％,阴性标本28例,占18．7％;在122例阳性标本中,单纯YMDD野生型(即无变异标本)有90例,占73．8％;YVDD变异28例,占22．9％;YIDD变异2例,占1．6％;YVDD和YIDD混合变异2例,占1．60A,,变异株检出率为26．2％,而且变异株均与野生株共存。其中8份阳性标本进行基因序列测序,证实与芯片检测结果完全一致。结论(1)用当前先进的基因芯片技术检测HBVP区YMDD变异,操作简便,结果可靠,特异性高。(2)基因芯片可快速、同时、多人份检出HBVYMDD野生株及其YIDD和／或YVDD突变株的共同感染。(3)部分HBV感染者在未经抗病毒治疗情况下已自然存在HBV YMDD变异,而且变异株均与野生株共存,其中以YVDD变异为多。(4)HBV感染患者在治疗前后有必要检测是否存在HBV YMDD变异株感染,为指导临床科学合理用药和制定治疗方案提供依据。     

HBV P基因YMDD变异的检测及临床应用的初步研究

目的采用错配PCR扩增方法进行HBVP基因YMDD变异的检测，对其临床意义进行初步的研究。方法应用分子克隆方法，构建YMDD、YVDD和YIDD变异的阳性质粒，并对该方法进行敏感性及特异性试验。对65例未经抗病毒治疗的乙型肝炎患者检测YMDD变异情况。结果经PCR方法、酶切鉴定及直接测序鉴定出YMDD、YVDD和YIDD质粒构建成功，且该方法具有较好的敏感性和特异性。65例未经拉米夫定治疗的乙型肝炎患者存在YMDD变异，出现变异6例，阳性率为9．07％；其中YIDD和YI／YMDD各1例，YVDD3例，YV／YMDD1例。结论本检测方法简便、实用，在未经抗病毒治疗的患者中可存在YMDD变异，其与野生株一样是自然存在的，抗病毒药物压力不是导致HBV YMDD变异的唯一因素。     

拉米夫定治疗引起HBVYMDD变异的检测及临床意义

目的 探讨拉米夫定治疗慢性乙型肝炎引起的HBVYMDD变异与HBVDNA病毒载量与血清谷丙转氨酶(ALT)之间的关系.方法 140例拉米夫定治疗48～96周的慢性乙型肝炎患者为研究对象.用荧光定量PCR法检测HBVDNA,基因序列分析检测HBVYMDD变异,全自动生化分析仪检测ALT水平.结果 140例检测标本46例存在YMDD变异,变异率为32.86%,其中29例(20.71%)为rtM204V/rtL180M变异,16例(11.43%)为rtM 204 I变异,1例(0.72%)为rtM204I/rtL180M变异.HBVDNA＞105拷贝/mL的发生率变异株组(40/46,86.96%)明显高于野生株组(6/94,6.38%)(χ2=90.889,P＜0.01).血清ALT水平变异株组(143.96±192.97)u/L明显高于野生株组(41.29±31.54)u/L(F=25.409,P＜0.01).结论 慢性乙型肝炎患者应用拉米夫定48～96周YMDD变异率为32.86%,变异类型以rtM204V/rtL180M为主,其次为rtM 204I.变异时HBV-DNA病毒载量及ALT水平升高.     

期刊文摘

乙型肝炎病毒P基因YMDD变异的意义[王平忠,张岩,白雪帆,张　颖,李谨革,陈红梅,王九平,世界华人消化杂志,2 0 0 4 ;1 2 (3) :6 0 0 - 6 0 3]　　目的:了解拉米夫定治疗慢性乙型肝炎过程中HBVP基因YMDD变异的意义,为临床治疗提供指导.方法:用定量PCR监测4 0例拉米夫定治疗期间的HBVDNA动态变化,对治疗4 8wk时HBVDNA仍为阳性的患者,采用Uniarray技术和基因芯片检测YMDD突变.结果:拉米夫定治疗4 8wk时,HBVDNA转阴者2 3例(5 7.5 % ) .HBVDNA仍为阳性者1 7例,其中8例在治疗过程中出现HBVDNA定量反跳.用基因芯片法与Uniarray…     

荧光定量PCR技术联合检测乙肝病毒DNA及YMDD变异的临床应用

目的：采用荧光定量PCR技术对慢性乙肝患者用拉米夫定治疗1年后，患者血清中HBVDNA水平变化及YMDD基因变异的检测，并对其临床应用进行评价。方法：选取82例乙肝患者经拉米夫定治疗1年前、后其血清采用荧光定量PCR技术联合检测HBVDNA及YMDD变异，回顾性对YMDD野生型组和YMDD变异型组进行统计学分析。结果：拉米夫定治疗前HBVDNA的载量，两组相比差异没有统计学意义，1年后YMDD的变异率为15．86％，YMDD变异型组HBVDNA无1例阴转。YMDD野生型组HBVDNA阴转率为82．60％，差异有统计学意义。结论：荧光定量PCR技术联合检测HBVDNA及YMDD变异具有很好的临床应用前景。     

拉米夫定治疗中乙肝病毒多聚酶YMDD变异对患者临床经过的影响

研究乙肝病毒(HBV)多聚酶YMDD变异后HBVDNA复现对慢性HBV感染患者临床经过的影响。方法用mpPCR-RFLP技术检测24例拉米夫定治疗过程中出现HBVDNA复现的患者血清,对YMDD变异者的系列临床资料,应用SAS软件进行统计学分析。结果检出YMDD变异18例;YMDD变异后转氨酶水平较HBVDNA转阴时有显著升高,并反跳至治疗前水平。结论出现YMDD变异后,部分病例可有类似肝炎发作、甚至肝脏失代偿的表现。     

拉米夫定治疗慢性乙肝的疗效及乙肝病毒YMDD变异的研究

目的评价拉米夫定治疗慢性乙肝病人的1年疗效、乙肝病毒YMDD变异率、变异与治疗前HBV-DNA、ALT水平的联系。方法治疗组按入选标准随机选择32例慢性乙型肝炎患者给予拉米夫定100 mg/d并随访1年,并于治疗开始后3、6、9、12个月检测肝功能、HBV-M、HBV-DNA、YMDD变异。对照组随机选择36例从未接受抗病毒治疗的HBV-DNA阳性、ALT异常的慢性乙型肝炎患者,检测YMDD变异株。结果①拉米夫定治疗一年,HBV-DNA转阴率71.88%(23/32),HBeAg/HBeAb血清转换率18.52%(5/27),ALT复常率62.5%(20/32);治疗前及治疗12个月后ALT水平分别为132.59±66.07、49.78±27.94,治疗前后差别有统计学意义(P<0.001)。②治疗组在治疗前未发现YMDD变异,治疗6个月发现2例YMDD变异,变异率6.25%,治疗12个月发现5例YMDD变异,变异率15.63%;对照组36例从未接受抗病毒治疗的慢性乙型肝炎病人中检测出2例YVDD变异株与野生株共存。③治疗前ALT<3×ULN组及≥3×ULN组YMDD变异率分别为11.76%、20.00%,两组差别无统计学意义(P=0.645);治疗前HBV-DNA<106copies/mL组及≥106copies/mL组YMDD变异率分别为5.88%、26.67%,两组差别无统计学意义(P=0.161)。结论拉米夫定能迅速抑制乙肝病毒复制、改善肝功能;治疗前HBV-DNA水平及ALT水平不足以预见YMDD变异的发生;乙肝病毒YMDD变异株存在于未使用拉米夫定的慢性乙肝患者中,建议在抗病毒治疗前对YMDD变异进行常规检测。     

应用错配PCR和限制性片段长度多态性分析技术检测HBV YMDD变异株

目的：建立简便易行的检测乙型肝炎病毒（HBV）多聚酶基因（P基因）上YMDD变异株的方法，评价运用拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患对此变异的影响，方法：采用套式／错配聚合酶链反应（PCR）结合限制性片段长度多态性（RFLP）分析技术对108例治疗前HBV DNA（PCR）阳性正在拉米夫定治疗中的慢性乙型肝炎患者的HBV YMDD变异情况进行检测。结果：运用上述技术能有效区分HBV YMDD野生株和变异株，上述108例患者经拉米夫定治疗后，HBV DNA阴转者63例（58．3％），HBV YMDD野生株和变异株分别为23例（21．3％）和22例（20．4％），结论：建立的套式／错配PCR－RFLP分析技术可用于HBV YMDD变异株的临床监测，拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患者可导致部分患者的HBV多聚酶基因上YMDD发生变异。     

拉米夫定治疗慢性乙型肝炎发生病毒学反弹患者YMDD变异分析

选取402例服用拉米夫定后出现乙型肝炎病毒(HBV)DNA反弹的慢性乙型肝炎(CHB)患者血清样品,应用荧光PCR法定性检测YMDD变异情况。402例中有309例(76.87%)检测出YMDD变异,其中120例为YVDD变异,74例为YIDD变异,115例为YVDD+YIDD联合变异;309例YMDD变异患者中同时检测出变异株与野生株占69.26%(214/309),仅检测出变异株占30.74%(95/309)。另外,93例为YMDD野生型阳性。     

乙型肝炎病毒基因变异与转氨酶关系的探讨

目的：探讨乙型肝炎病毒基因变异与血清转氨酶水平的关系。方法：采用实时荧光PCR熔解曲线法检测948例乙型肝炎病毒感染者的YMDD变异,其中342例（YMDD变异株84例,YMDD野生株132例,YMDD阴性126例）,同时检测其ALT、AST水平。结果：948例患者中检出YMDD变异株126例,其中单一变异株104例,混合变异株22例。342例中YMDD变异株、YMDD野生株和YMDD阴性的ALT、AST异常率分别为45．2％、53．0％、19．0％及42．9％、43．9％、17．5％。结论：乙型肝炎患者其乙肝病毒基因发生变异与其ALT、AST异常水平比较无统计学意义。     

乙型肝炎YMDD变异与丙氨酸转氨酶乙型肝炎病毒e抗原及乙型肝炎病毒DNA的关系探讨

目的探讨拉米夫定治疗慢性乙型肝炎期间乙型肝炎病毒(HBV)YMDD变异的情况及其与临床的关系。方法采用通用模板信号扩增(UT-PCR)方法,对拉米夫定治疗过程中血清出现HBV DNA由阴转阳的52例慢性乙型肝炎患者进行HBVYMDD变异检测,并结合患者治疗前HBV DNA载量、丙氨酸转氨酶(ALT)水平、免疫标志物及YMDD变异后HBV DNA载量等临床信息进行结果分析。结果YMDD变异的检出率为53.85%,52例患者中,28例发生了YMDD变异,其中YIDD17例,YVDD7例,YIDD和YVDD混合变异4例。发生YIDD变异的患者较治疗前HBV DNA水平显著降低(P<0.05),发生YVDD变异的患者较治疗前HBV DNA水平差异无统计学意义(P>0.05)。YVDD变异后的HBVDNA水平与YIDD变异后HBV DNA水平差异无统计学意义(P>0.05)。YMDD变异组治疗前的ALT基础水平高于YMDD野生组治疗前水平(P<0.01),治疗前HBVDNA水平及HBeAg阳性率在变异组和野生组中差异无统计学意义(P>0.05)。结论拉米夫定治疗前ALT基础水平高可能是YMDD变异的一个易发因素。密切监控慢性乙型肝炎患者的HBV DNA及ALT水平,有利于及时发现YMDD是否发生变异。     

Analysis of YMDD mutation in chronic hepatitis B patients with virologic breakthrough after lamivudine treatment

选取402例服用拉米夫定后出现乙型肝炎病毒(HBV)DNA反弹的慢性乙型肝炎 (CHB) 患者血清样品,应用荧光PCR法定性检测YMDD变异情况.402例中有309例(76.87%)检测出YMDD变异,其中120例为YVDD变异,74例为YIDD变异,115例为YVDD+YIDD联合变异;309例YMDD变异患者中同时检测出变异株与野生株占69.26%(214/309),仅检测出变异株占30.74% (95/309).另外,93例为YMDD野生型阳性.     

214例慢性乙肝患者HBV YMDD变异检测及临床意义

目的：了解口服拉米夫定的慢性乙型肝炎患者HBV P区发生YMDD变异的情况,并探讨其相关影响因素。方法：应用实时荧光PCR法检测HBV YMDD变异株的方法,对214例用拉米夫定进行抗乙肝病毒治疗的慢性乙肝（CHB）患者血清进行HBV P区YMDD变异检测分析。结果：214例慢性乙肝患者YMDD变异率为32.7%,其中YIDD变异34例,YVDD变异30例,混合变异6例。YMDD未变异组治疗前谷丙转氨酶（ALT）水平显著高于变异组;而YMDD变异组治疗前HBV DNA含量显著高于未变异组;YMDD未变异组与变异组之间治疗前的患者性别、年龄和HBeAg状态等方面差异无统计学意义。结论：HBV YMDD变异可能与患者治疗前ALT水平和HBVDNA含量有一定关系,而与患者的性别、年龄和血清HBeAg状态无关。     

拉米夫定治疗后乙肝病毒发生YMDD变异的研究

目的 观察拉米夫定治疗后乙肝病毒发生YMDD变异情况。方法 87例慢性乙肝患者分成两组，一组51例接受拉米夫定及保肝治疗，另一组36例做为对照组只给予保肝治疗，治疗1年后对患者HBV多聚酶基因YMDD基序进行定性检测，观察是否有突变。结果 拉米夫定治疗组在用药1年后有8例发生YMDD突变，其中YIDD变异有5例，YVDD变异3例，变异株中有5例伴HBV DNA、ALT水平升高，而对照组无变异株产生。结论 拉米夫定可诱导HBV多聚酶基因(P基因)YMDD基序发生基因突变，而导致耐药株的产生。     

214例慢性乙肝患者HBV YMDD变异检测

目的:了解口服拉米夫定的慢性乙型肝炎患者HBV P区发生YMDD 变异的情况,并探讨其相关影响因素.方法:应用实时荧光PCR法检测HBV YMDD变异株的方法,对214 例用拉米夫定进行抗乙肝病毒治疗的慢性乙肝(CHB)患者血清进行HBV P区YMDD变异检测分析.结果:214 例慢性乙肝患者 YMDD 变异率为 32.7 %,其中 YIDD 变异 34例,YVDD 变异30例,混合变异6例.YMDD 未变异组治疗前谷丙转氨酶(ALT) 水平显著高于变异组;而 YMDD 变异组治疗前 HBV DNA 含量显著高于未变异组;YMDD 未变异组与变异组之间治疗前的患者性别、年龄和 HBeAg 状态等方面差异无统计学意义.结论:HBV YMDD 变异可能与患者治疗前 ALT 水平和 HBVDNA 含量有一定关系,而与患者的性别、年龄和血清 HBeAg 状态无关.     

拉米夫定治疗乙型肝炎后病毒YMDD变异与HBV-DNA基线水平的关系

目的探讨拉米夫定治疗乙型肝炎后病毒YMDD变异与治疗前HBV-DNA基线水平的关系。方法32例慢性乙型肝炎患者采用拉米夫定片,100 mg/次,口服,1次/d,并随访1年。于治疗后第3、6、9、12个月采用全自动生化分析仪检测肝功能,用ELISA方法检测HBV-M水平,用荧光定量PCR方法检测HBV-DNA水平,用PCR-RFLP方法检测YMDD变异。结果拉米夫定治疗12个月,HBV-DNA转阴率71.88%(23/32),HBeAg转阴率25.93%(7/27),HBeAg/HBeAb血清转换率18.52%(5/27),ALT复常率62.50%(20/32);治疗前ALT水平为(132.59±66.07)U/L,治疗6个月ALT水平为(46.28±17.89)U/L,治疗12个月ALT水平为(49.78±27.94)U/L,治疗前与治疗6、12个月比较,均有非常显著性差异(P均<0.001);32例患者在治疗前均未发现YMDD变异,治疗12个月发现5例YMDD变异,一年期总变异率15.63%,其中DNA<106copies/mL组1例,变异率为5.88%,DNA≥106copies/mL组4例,变异率26.67%,两组之间无显著性差异(P=0.161)。结论治疗前HBV-DNA水平不能预见YMDD变异的发生;随着拉米夫定用药时间的延长,出现变异株的病例增加;变异株被检出时HBV-DNA水平均未超过用药前的水平。     

非抗病毒治疗相关的慢性乙型肝炎患者YMDD变异研究

目的：了解未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患乙型肝炎病毒基因YMDD变异及其与前C区变异、HBV基因型的相关性，HBV DNA水平与变异发生的关系。方法：从126例均未接受拉米夫定治疗和近一年内未经任何抗病毒治疗的慢性乙肝患随机抽取25例为研究对象。血清YMDD变异检测运用微板核酸杂交—核酸定量法，HBV基因型采用PCR微板核酸杂交—ELISA技术，HBVDNA定量采用荧光定量PCR分析系统，HBV—M采用ELISA法。结果：7例存在YMDD变异，变异HBeAg全部阳性，不同的HBV基因型形式存在不同的YMDD变异率，HBVDNA水平与YMDD变异的发生不呈正相关。结论：HBV存在YMDD野生变异株，并非完全由抗病毒治疗引起，变异株与前C区变异和HBV基因型的相关性以及HBV DNA水平和变异发生的关系有待进一步研究。     

拉米夫定治疗前后YMDD变异与HBV-DNA水平相关性分析

目的：通过对慢性乙型肝炎（CHB）患者血液中HBV—DNA、谷丙转氨酶（ALT）、r-谷氨酰转移酶（r—GT）的检测，了解CHB患者经拉米夫定（3TC）治疗前后HBV—YMDD变异情况，分析HBV—YMDD变异与HBV—DNA、ALT、r—GT相关情况，探讨3TC治疗CHB的效果以寻找最佳治疗方案。方法：对71例治疗前CHB患者，检测HBV—YMDD变异株；选择64例HBV-YMDD的CHB患者经治疗1年后，检测HBV—YMDD变异株；选择36例患者经治疗后仍然是YMDD;13例经治疗后由YMDD变为YIDD；5例治疗后由YMDD变为YVDD的；9例经治疗后由YMDD变异为YMDD＋YVDD混和型的CHB进行检测HBV—DNA、ALT、r—GT含量。结果：71例CHB用3TC治疗前已有7例存在变异现象，其中2例是YVDD型；3例是YIDD型；2例是YMDD＋YVDD混合型；64例治疗前为YMDD型的患者，用3TC治疗后36例没有变异、5例变异为YVDD、13例变异为YIDD、9例变异为YMDD＋YVDD、1例变异为YMDD＋YIDD；36例治疗前后DNA没有变异的CHB，治疗前后的HBV-DNA、ALT、r—GT含量差异有显著意义；13例治疗后由YMDD变为YIDD，治疗前后的HBV—DNA含量差异有显著性，而ALT、r—GT含量在治疗前后差异无显著意义；5例治疗后由YM-DD变为YVDD和9例经治疗后由YMDD变异为YMDD＋YVDD混和型，治疗前后HBV—DNA、ALT、r—GT含量差异无显著意义。结论：CHB用3TC治疗前已经存在着9.85％变异率。64例YMDD用3TC治疗1年后，有43．75％发生变异，变异的类型以YIDD为主。HBV—YMDD没有变异时，经3TC治疗CHB后患者的HBV-DNA、ALT、r—GT含量比治疗前有较大降低，效果明显。YMDD变异为YIDD时，经治疗后患者血液中的HBV-DNA含量比治疗前有较大降低，而血液中ALT、r—GT含量比治疗前降低不大。YMDD变为YVDD时，其血液中的HBV—DNA量高于治疗前，ALT、r-GT含量比治疗前降低不大。YMDD变为YMDD＋YVDD混和型时，经治后CHB患者血液中的HBV—DNA量比治疗前稍高，ALT、r-GT含量比治疗后降低不大。     

拉米夫定治疗过程中YMDD变异与HBVDNA载量关系的研究

目的研究拉米夫定治疗乙型肝炎病毒感染中YMDD变异发生与治疗前HBVDNA水平的关系。方法98例拉米夫定治疗的乙型肝炎病毒感染者,测定治疗前HBVDNA水平,定期随访,分别以PCR和PCR-RFLP法检测HBVDNA水平和YMDD变异。结果25例病例出现YMDD变异,出现的平均时间为11.2±7.45周。按治疗前病毒DNA水平分为5×102～5×104,5×105～5×106,5×106～5×108和大于5×108copies/ml四个组,YMDD发生率分别为8.3%,15.6%,30.2%和55.6%。结论乙肝患者进行拉米夫定治疗时,病毒DNA水平越高,发生YMDD的机率越大。     

拉米夫定治疗中乙型肝炎病毒YMDD变异的研究

目的观察拉米夫定治疗慢性乙型盱炎后乙型肝炎病毒YMDD基序变异的情况。方法105例慢性乙型肝炎患者随机分成两组，一组68例为治疗组给予拉米夫定；另一组37例为对照组，给予除拉米夫定外的其他治疗。治疗1年后对患者乙型肝炎病毒多聚酶基因YMDD基序进行定性检测，观察突变情况。结果拉米夫定治疗组：用药1年后有12例发生YMDD突变，其中YVDD变异有8例，YIDD变异4例，变异株中有9例伴血清ALT、HBV-DNA水平回升；对照组无变异株产生。结论拉米夫定可诱导乙型肝炎病毒YMDD基序发生变异，导致耐药株的产生。