中国人散发性大肠癌APC基因突变的研究

目的观察中国人大肠癌APC基因突变情况，并结合临床病理资料加以分析。方法应用常规酚、氯仿法提取48例散发性大肠癌组织及相应正常黏膜组织的DNA，聚合酶链反应（PER）扩增、单链构象多态性（SSCP）电泳和DNA直接测序，检测APC基因第15外显子MCR区段的突变情况。结果APC基因突变率为37．5％（18／48），APC基因第15外显子MCR区段突变发生在codon1306-codon1442之间，突变类型有点突变（A→G、G→T、C→A、C→T、G→A）、移码突变（-A、-C、-G、-AG、＋T、＋A、＋AACG）。结论中国人大肠癌APC基因突变率为37．5％（18／48），以体细胞的错义突变为主，codon1309∽codon1356是大肠癌APC基因突变热区，而codon1356（CCT→TCT）是突变热点。散发性大肠癌APC基因突变与患者的年龄、性别、肿瘤的位置、浸润深度、组织类型、分化程度、远处转移、Dukes’分期和5年生存无关。     

突变体富集聚合酶链反应检测胰腺癌K-ras基因突变的研究

胰腺癌是一种恶性程度极高，早期难以诊断，预后极差的恶性肿瘤，临床确诊者大多属于晚期癌，5年生存率总体低于5％。我们采用突变体富集聚合酶链反应（PCR）检测胰腺癌细胞系K—ras基因点突变，以期为早期诊断胰腺癌提供一种简便、灵敏而有效的检验方法。     

直肠癌术前放疗前后K-ras基因突变的研究

目的检测直肠癌术前放疗前后原癌基因Kirsten大鼠肉瘤病毒转化基因(K-ras基因)突变率的变化,从细胞遗传学方面深入研究放射治疗对直肠癌的作用。方法pTNM Ⅱ期和Ⅲ期直肠癌病人40例。病人术前行40 Gy放疗,放疗前和术中分别取癌组织、距边缘2、4和6cm正常黏膜采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)法检测K-ras基因第12密码子突变。结果癌组织中K-ras基因突变率显著高于癌周正常黏膜,同时距癌边缘2cm黏膜的K-ras基因突变率显著高于距癌边缘4、6cm黏膜的。放疗后癌组织和距癌边缘2cm黏膜的K-瑚基因突变率与放疗前相比显著降低。结论距肿瘤2cm之内的黏膜有较高的K—ras基因突变率,向恶性转化的可能较大,放疗后癌组织和癌旁黏膜K-ras基因突变率显著降低,因此,放疗可能抑制癌旁黏膜恶变的早期事件,这可能是放疗能增加手术切除率和保肛率的原因。     

中国BRCA1基因突变相关性乳腺癌和散发性乳腺癌的比较研究

BRCA1基因是一个抑癌基因，其结构和功能的异常与乳腺癌的发生密切相关。很多研究证实，BRCA1基因突变相关性乳腺癌与散发性乳腺癌相比具有完全不同的组织病理学特点。但中国人群BRCA1基因突变相关性乳腺癌的病理学特点鲜有报道，本研究对中国家族性或早发性乳腺癌人群中的BRCA1基因突变携带者与非携带者的组织病理学和免疫组织化学特点进行了比较。     

一个中国人遗传性非息肉病性大肠癌家系的调查和hMLH1基因突变研究

遗传性非息肉病性大肠癌 (Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer,HNPCC)是一种呈常染色体显性遗传的家族性肿瘤综合征 ,是最常见的遗传性肿瘤 ,既往报告的癌家族多属于本病 [1,2 ]。国内已有对 HNPCC家系的临床研究报告 ,但还没有关于本病基因突变的研究报告[3 ] 。我们报告调查的1个 HNPPC家系 ,总结其肿瘤发生特点 ,并首次报告中国大陆 HNPCC的 h MLH1基因突变。1　对象和方法　　对 1个在我院诊治的 HNPCC家系进行全面调查 ,记录所有家族成员情况 ,肿瘤发生和患病年龄。　　对签署了知情同意书的家族病人及其部分表…     

胰腺癌组织中K-ras基因点突变和端粒酶活性的检测与比较

许多近期研究已显示出分子生物学特征在胰腺癌发生发展中起着重要作用,现认为K-ras基因是与胰腺癌高度相关的癌基因,其第一外显子12密码子点突变见于90%左右的胰腺癌,远远高于在其它肿瘤的突变发生率。目前资料也显示,在正常组织中均无端粒酶活性检出,而在绝大多数恶性肿瘤组织均显示明显的端粒酶活性。因此端粒酶激活是癌细胞重要的生物学标记,其检测端粒酶活性对于肿瘤诊断具有重要意义。1.材料与方法:(1)研究对象:23例手术切除标本,癌周正常组织10例。男16例,女7例,年龄36~74岁,平均58·9岁。诊断由手术及病理证实。所有病例均有较完整…     

散发性肾透明细胞癌组织中希佩尔-林道基因突变与缺氧诱导因子1α、2α的测定

目的探讨散发性肾透明细胞癌(CCRCC)组织中希佩尔-林道(VHL)基因突变、缺氧诱导因子1α(HIF-1α)和HIF-2α的表达及其关系,对肿瘤分期、分级的影响.方法应用聚合酶链反应(PCR)、PCR产物直接测序和免疫组化等方法,分析77例散发性CCRCC患者癌组织中VHL基因突变、HIF-1α和HIF-2α的表达.其中T1期 55例(71%),T2期7例(9%),T3期14例(18%),T4期1例(1%);病理分级,G115例(19%),G256例(73%),G36例(8%).结果在正常肾组织中无VHL基因突变.散发性CCRCC中VHL基因突变率为52%(40/77),HIF-2α阳性率81% (62/77),高于HIF-1α阳性率66%(51/77)(χ2 =23.310, P<0.01);VHL基因突变者中HIF-1α和HIF-2α的阳性率(98%和93%)均高于无突变者的阳性率(32% 和68%,χ2值分别为36.386,7.617,P均<0.01);HIF-1α和HIF-2α的表达均与VHL基因突变相关(偏回归系数分别为4.481,2.027,P均<0.01);未发现VHL基因突变、HIF-1α和HIF-2α表达与肿瘤病理分级、分期有关(P均>0.05).结论在散发性CCRCC患者中VHL基因突变较广泛,在突变组织中HIF-1α和2α高表达,但VHL基因突变、HIF-1α和2α的表达与患者病理分级、分期不相关.     

蛋白质分步提取法的建立及在大肠癌蛋白质组研究中的应用

利用等电聚焦/聚丙烯酰胺双向凝胶电泳(2-DE)对蛋白质进行分离是蛋白质研究的核心技术之一。目前常用的蛋白样品制备和提取方法存在一定缺陷,直接影响蛋白质组的分析结果。我们在大肠癌发生、发展的蛋白质组研究中,采用分步提取法,以3种分别适于溶解高、中、低、亲水性蛋白质的裂解液提取正常结直肠黏膜组织和癌组织中的蛋白质组成分,进行双向电泳,提高了蛋白质提取率和2-DE分辨率,现报道如下。 一、材料与方法     

中国人遗传性非息肉病性结直肠癌家系错配修复基因突变的研究

目的探讨中国人遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)家系中hMLH1、hMSH2基因遗传性突变情况。方法取14个符合中国人HNPCC标准的HNPCC家系肿瘤先证者外周血DNA样本,聚合酶链反应扩增hMLH1、hMSH2基因共35个外显子,应用变性高效液相色谱技术(DHPLc)结合DNA测序法检测突变。结果14个家系中共发生41个大肠癌和19个肠外恶性肿瘤,其中胃癌是最常见的肠外恶性肿瘤类型。14个患者中检测到分属于9个家系的12个遗传性单个碱基改变,其中8％为无义突变,25％为错义突变,其余42％为单核苷酸多态,17％为内含子区的单碱基改变,8％为同义突变。结论(1)应用DHPLc成功检测到hMLH1、hMSH2基因杂合性突变。(2)符合中国人HNPCC标准家系约有1／3可检出hMLH1、hMSH2基因遗传杂合性突变,其中错义突变较多见。     

K-ras基因突变与结直肠癌临床病理因素的关系

目的 建立K-ras基因简单、快捷、经济的检测方法,并将检测结果与临床病理因素进行相关性分析.方法 采用PCR-直接测序法和聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性测序法(PCR-RFLP)同时检测40例结直肠癌肿瘤组织标本K-ras基因第12、13密码子突变情况;另113例患者仅用PCR-RFLP-测序法检测K-ras基因第12、13密码子突变情况.将K-ras基因突变检测结果与临床病理因素进行相关性分析.结果 40例结直肠癌患者的肿瘤组织经常规PCR扩增后直接测序无一例发现K-ras基因第12、13密码子的突变;而这40例标本经PCR-RFLP-测序法检测发现:8例含有K-ras基因第12密码子突变,3例含有K-ras基因第13密码子突变,总突变检出率为27.5%(11/40).153例结直肠癌肿瘤组织标本经PCR-RFLP-测序法检测共发现突变58例,突变率为37.9%(58/153),其中第12密码子突变46例,第13密码子突变12例.G→A是K-ras基因突变最常见的突变形式(25/58,43.1%).K-ras基因第12和13密码子突变与患者性别、肿瘤浸润深度、分化程度、与淋巴结转移、远处转移及分期无明显相关性(P＞0.05),与年龄、肿瘤发生部位密切相关(P＜0.05),年龄越大突变概率越低,突变最常发生的肿瘤部位为升结肠.结论 PCR-RFLP-测序法能够快捷、灵敏地检测出肿瘤组织中K-ras基因的突变,适合作为K-ras基因突变常规检测方法.K-ras基因第12和13密码子突变是结直肠癌中一个常见的分子事件,与患者年龄、肿瘤发生部位有相关性.     

结直肠癌K-ras基因突变位点的检测及其临床意义

目的:探讨结直肠癌中K-ras基因突变状态及其与临床病理特征的关系.方法:应用实时荧光定量PCR( RT-qPCR)和直接基因测序法检测200例结直肠癌患者癌组织K-ras基因突变状态.将两种检测结果进行对比,并结合临床病理资料分析其意义.结果:200例结直肠癌患者中,RT-qPCR检测出突变63例,突变检出率31.5％;经直接基因测序,测序成功的样品169例,检出突变50例,突变检出率29.6％.其中第12密码子GGT→GAT最常见,占34.9％( 22/63);其次是第13密码子GGC→GAC,占28.6％(18/63);第12密码子GGT→CGT最少,全组未见(0/63).两种方法突变检测一致率为98％.K-ras基因突变与肿瘤分化程度有关( P＜0.05),而与患者性别、年龄、肿瘤部位、淋巴结转移及TNM分期无明显关系(均P＞0.05).结论:RT-qPCR能快速、敏感、准确地检测结直肠癌K-ras基因突变位点,为临床靶向治疗提供可靠的参考依据.     

K-ras基因突变与结直肠癌肝转移及其预后关系的研究

目的探讨结直肠癌肿瘤原发灶中K-ras基因突变情况与肝转移及其预后的关系。方法回顾性选取2003年1月至2008年12月间经复旦大学附属中山医院普通外科手术治疗的结直肠癌病例,根据术时诊断和术后随访肝转移情况分为同时性肝转移、异时性肝脏转移和未发生肝脏转移的患者3组,每组各100例。运用PCR及Pyrosequencing法检测石蜡标本中肿瘤原发灶K-ras第2外显子突变情况．分析其与结直肠癌肝转移的发生及其预后的关系。结果300例样本中肿瘤原发灶K-1-as突变者120例（40．0％）,其中K-ras第2外显子G13D突变32例,而异时性肝转移组中K-ras的第2外显子G13D突变较同时性肝转移组多（17．0％比8．0％,P=0．041）。多因素回归模型提示,K-ras第2外显子的G13D突变是结直肠癌异时性肝转移的独立危险因素（P=0．048,HR=1．108．95％CI：1．032-5．062）。结直肠癌无肝转移组中K-ras基因突变者较无突变者总体生存期短（中位生存时间65比72个月,P=0．039）,而在结直肠癌肝转移切除的患者中,K-ras基因突变者无复发生存期短（中位时间18比24个月,P=0．048）,多因素分析提示,K-ras基因突变（HR=1．561,95％CI：1．022-6．422,P=0．045）是影响结直肠癌无肝转移组总体生存的独立危险因素。结论检测结直肠癌原发灶中的K-ras基因状态可以为预测肝脏的转移和预后情况提供参考。     

广西散发性结直肠癌DCC基因突变的研究

目的观察广西散发性结直肠癌DCC基因突变情况,并分析其与临床病理资料之间关系。方法应用常规酚、氯仿法提取73例散发性结直肠癌组织及相应正常黏膜组织的DNA。采用PCR—SSCP结合直接测序的方法检测DCC基因第4、28、29号外显子突变的情况。结果73例散发性结直肠癌患者中,18例201密码子表现为纯合突变型,7例201密码子表现为野生型,48例表现为杂合突变型。另有1例突变发生在第4内含子上。第28、29号外显子未发现突变。结论DCC基因突变与患者的性别、年龄、肿瘤发生的部位、浸润深度、组织病理、淋巴结转移、Dukes分期无关。     

血浆K—ras基因突变与结直肠癌相关性研究

为探讨血浆K—ras基因突变在结直肠癌诊断中的价值,对42例结直肠癌患者血浆、肿瘤组织及20名健康体检者血浆中K—ras基因水平进行检测,并分析结直肠癌患者血浆及肿瘤组织中K—ras基因突变与临床病理参数之间的关系。结果显示,42例结直肠癌患者血浆K—ras基因突变17例（40．48％）,肿瘤组织Kras基因突变19例（45．24％）;对照组血浆无K—ras基因突变。血浆与肿瘤组织中Kras基因突变率有较高的一致性,一致率为95．2％。结直肠癌患者与健康体检者血浆K—ras基因突变率比较差异有统计学意义,x2=34．57,Pd0．001。结直肠癌患者K—ras基因突变率与肿瘤发生部位、分化程度、Dukes分期、淋巴结转移情况无关,P〉0．05。结果表明,K—ras基因突变属于结直肠癌发生的早期基因改变,检测血浆K—ras基因突变在结直肠癌早期诊断方面具有一定价值。     

散发性大肠癌微卫星不稳定及hMSH2基因突变研究

目的了解散发性大肠癌微卫星不稳定及其hMSH2基因突变情况。方法用6个微卫星位点标记，PCR法检测微卫星不稳定性（microsatelliteinstabilty，MI），银集PCR－SSCP法检测hMSH2基因5、7、8、12、13、15外显子突变。结果60例大肠癌中，微卫星改变总的发生率为50％（30／60）；20例（3333％）表现微卫星不稳定性，其中4例同时有杂合性缺失（lossofheterozygosityLOH），DNA复制错误（RER）阳性11例（1833％）；14例（233％）检测到LOH。8例微卫星不稳定性大肠癌组织检测到第5外显子杂合性突变，而未发现胚系突变。结论散发性大肠癌中微卫星不稳定是一个常见的分子事件，与hMSH2基因胚系突变无关，可能为体细胞性突变或／和缺失所致。     

结直肠癌肝转移与门静脉血K-ras基因突变的关系

目的 检测结直肠癌患者门静脉血液、原发癌组织及肝转移灶中K-ras基因突变,探讨K-ras突变与结直肠癌肝转移的关系.方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术和基因测序技术检测48例结直肠癌患者门静脉血液、原发肿瘤组织、相应的癌旁肠黏膜以及8例肝转移灶组织中K-ras基因突变.结果 48例结直肠癌组织中17例(35.4%)发现K-ras基因突变,48例癌旁黏膜中4例(8.3%)发现K-ras基因突变,明显低于癌组织的基因突变率(P＜0.05).48例结直肠癌患者中16例(33.3%)门静脉血中发现K-ras基因突变,与癌组织的基因突变率差异无统计学意义(P＞0.05).有肝转移患者门静脉血中K-ras基因突变率(7/10,70.0%)明显高于无肝转移者(9/38,23.7%,P＜0.05).16例门静脉血存在K-ras基因突变者,其相应的肿瘤组织中均发现K-ras突变.而结直肠癌组织中无K-ras基因突变者,患者门静脉血及癌旁黏膜无基因突变.8例同时性肝转移患者中5例门静脉血发现K-ras基因突变,且其相应的肝转移灶组织也发现相同的K-ras突变.2例异时性肝转移患者门静脉血检测到K-ras基因突变,手术时无肝转移,但分别于术后第6个月和第9个月经CT检查证实有肝转移.原发肿瘤组织K-ras基因突变类型与门静脉血、肝脏转移灶的K-ras基因突变一致,即K-ras基因12密码子GGT突变为GAT或GTT.结论 结直肠原发癌组织和患者门静脉血有K-ras基因的突变,预示着肿瘤可能有肝脏转移.

Abstract：

Objective To detect mutations of K-ras oncogene in portal vein blood of patients with colorectal cancer, and to find out the relationship between mutated K-ras oncogene and liver metastases in colorectal cancer. Methods Forty-eight patients with colorectal cancer were screened for the mutations of K-ras oncogene in tissue samples from their tumors, portal vein blood, proximally adjacent mucosa and 8metastatic liver biopsies by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (PCR) and DNA sequencing. The results were analyzed with their clinical data. Results Sixteen of the 48 patients with colorectal cancer had K-ras point mutations at codon 12 in their portal vein blood, and 17 of 48 patients had K-ras mutations in their primary tumors, but only 4 of 48 patients had K-ras mutations in proximally adjacent mucosa. There was no significant difference in rate of K-ras mutation between tumor tissues and portal vein blood (P ＞ 0. 05 ), but significant difference was found between the tumor tissue and the proximally adjacent mucosa ( P ＜0. 05 ). The rate of K-ras mutations in portal vein blood of colorectal cancer with liver metastases (70. 0% ) was higher than that of without liver metastases (23.7%). Sixteen cases of mutated K-ras in portal vein blood showed mutations in tumor tissues. Patients without mutated K-ras in tumor tissue had no mutations in their portal vein blood and proximally adjacent mucosa. In 5 of 8 patients with simultaneous liver metastasis, mutated K-ras oncogenes were detected in portal vein blood, and the type of K-ras mutation detected in the tumor tissue was accord with that in metastatic liver biopsies. Two patients with mutated K-ras detected in their portal vein blood had no liver metastases during perioperation, but liver metastases were diagnosed by CT at the postoperative month 6 and 9 respectively. The main types of K-ras mutations at codon 12 included GGT to GAT and GGT to GTT. No one had point mutation at codon 13. Conclusion Mutated K-ras detected in both cancer tissue and portal vein blood may indicate livermetastases from colorectal cancer.     

飞行时间质谱技术在结直肠癌K—ras基因突变检测中的应用

目的探讨MALDI—TOF—MS方法在检测结直肠癌K—ras基因突变中的实际临床价值。方法选取61例结直肠癌患者的肿瘤组织石蜡标本．应用常规测序和基质辅助激光解析／电离时间飞行质谱（MALDI-TOF-MS）两种方法．检测K-ras基因第2号外显子中第12及13位密码子的前两位碱基突变情况。结果常规测序法成功完成检测47例（77．0％）,而MALDI-TOF-MS法成功检测所有61例标本。常规测序法检测样本总体突变率为30．0％（14／47）,MALDI-TOF-MS法检测所有标本的总体突变率为36．1％（22／61）。6例样本常规测序法未检测到突变而质谱法检测到明确突变存在。14例样本经两种方法均检测出突变．且两种方法检测出的突变类型完全一致。2例样本未完成常规测序检测而通过质谱法检测出突变。结论相对常规测序而言,MALDI-TOF-MS法是一种对标本质量要求较低、更敏感的结直肠癌K-ras突变检测方法,有更好地临床价值。     

散发性结、直肠癌APC基因杂合缺失和突变的研究

目的　研究中国人散发性结、直肠癌中APC基因的失活形式和规律。方法　应用聚合酶链反应 单链构象多态性分析 (PCR SSCP)、DNA直接测序及微卫星标记PCR LOH分析方法 ,检测分析 40例散发性结直癌APC基因的突变和杂合缺失。结果　 40例结、直肠癌中有 3 1例检测到APC基因改变 :双次打击 2 4例 (其中LOH加突变 15例 ,双突变 9例 ) ,单个突变而无LOH 5例 ,仅有LOH而无突变 2例。APC基因突变率及杂合缺失率与肿瘤部位 ,肿瘤分化程度及Duke’s分期等无关。结论　APC基因改变与中国人散发性结直肠癌的发生有关。在大多数的中国人散发性结直肠癌的发生中 ,需要APC基因的双打击致功能完全失活 ,而且LOH加突变可能是其主要形式。在肿瘤获得恶性表型后 ,其进展及预后与APC基因杂合缺失与否无关。