牡蛎和粪便中GⅠ、GⅡ型诺如病毒实时聚合酶链反应检测方法的建立

目的 建立适用于牡蛎和粪便中快速、特异、灵敏的GⅠ、GⅡ型诺如病毒(NV)定量分型诊断方法.方法 通过对GⅠ、GⅡ型NV基因组保守序列的比对分析,设计高度特异的引物和探针,建立以TaqMan探针为基础的实时聚合酶链反应方法(TaqMan Real-time RT-PCR).结果 该方法对NV核酸检测高度特异,且GⅠ和GⅡ型之间无交叉反应,最低检出限达102 copies/μl.对90份新鲜牡蛎样品和37份腹泻粪便标本分别用常规RT-PCR和笔者建立的TaqMan Real-time RT-PCR进行NV检测,发现牡蛎样品中后者的检出率明显高于前者,而粪便标本中两者无明显差别.同时对阳性标本的测序分析证实结果准确可靠.结论 研究中建立的TaqMan Real-time RT-PCR方法可用于海产品标本及粪便中NV定量及分型检测,可作为应对NV胃肠炎暴发的有效诊断方法.     

牡蛎和粪便中GⅠ、GⅡ型诺如病毒实时聚合酶链反应检测方法的建

目的 建立适用于牡蛎和粪便中快速、特异、灵敏的GⅠ、GⅡ型诺如病毒(NV)定量分型诊断方法．方法 通过对GⅠ、GⅡ型NV基因组保守序列的比对分析，设计高度特异的引物和探针，建立以TaMan探针为基础的实时聚合酶链反应方法(TaMan Real-time RT-PCR)．结果 该方法对NV核酸检测高度特异，且GⅠ和GⅡ型之间无交叉反应，最低检出限达102 copies/μl．对90份新鲜牡蛎样品和37份腹泻粪便标本分别用常规RT-PCR和笔者建立的TaMan Real-time RT-PCR进行NV检测，发现牡蛎样品中后者的检出率明显高于前者，而粪便标本中两者无明显差别．同时对阳性标本的测序分析证实结果准确可靠．结论 研究中建立的TaMan Real-time RT-PCR方法可用于海产品标本及粪便中NV定量及分型检测，可作为应对NV胃肠炎暴发的有效诊断方法．     

水体中GⅡ型诺如病毒荧光定量RT-PCR检测

目的建立水体中诺如病毒的富集和荧光定量RT-PCR检测方法。方法梯度稀释诺如病毒阳性便样标本,模拟水体通过含有阳离子混合醋酸纤维膜的微生物抽滤系统,加入浓度20%的PEG6000,高速离心2次浓缩水体获取病毒粒子,以构建标准质粒作对照,荧光定量RT-PCR检测水体中GII型诺如病毒。结果重组质粒T-NVS定量荧光PCR扩增良好,线性相关系数98%,最低检测灵敏度为100 copies/μL;10-1~10-4倍稀释的模拟水样经富集浓缩后,病毒回收率为5.75~19.74%。结论初步建立了水体中诺如病毒的富集与检测方法。     

贝类海产品中诺如病毒快速检测方法研究

目的：寻找和建立贝类产品中诺如病毒的敏感特异的快速检测方法。方法：通过对报道的3种贝类中病毒提取方法的提取效率进行比较，确定最终的提取方法。设计特异性和敏感性相对较高的套式PCR方法进行病毒检测，检测结果经核酸序列测定证实。结果：3种方法中用PBS-三氯三氟乙烷-PEG处理回收率较高。设计的套式PCR方法可成功检测到病毒，其敏感性可比单轮PCR高100倍。结论：该研究建立了敏感特异的诺如病毒检测方法。     

GⅠ和GⅡ型诺如病毒双重荧光RT-PCR法检测

目的 建立应用Allglo探针同时检测GⅠ和GⅡ型诺如病毒的双重荧光反转录\聚合酶链反应(RT-PCR)方法.方法 设计针对GⅠ和GⅡ型诺如病毒开放阅读框架ORF1及ORF2为目的基因的引物和Allglo探针,优化最佳反应条件,建立一步法荧光RT-PCR快速检测反应体系;对该方法的特异性、抗干扰性、灵敏度进行评估,对96份临床粪便标本进行检测、测序分析.结果 该方法特异性强,与轮状病毒、扎如病毒、星状病毒、腺病毒同时检测无交叉反应;同一体系下GⅠ或GⅢ型诺如病毒相互之间没有干扰;最低检测限均为10 copies/μL;对96份临床粪便标本进行检测,结果与单重荧光RT-PCR方法符合率100％,且测序结果显示目标序列正确.结论 本研究建立的Allglo探针法检测GⅠ和G Ⅱ型诺如病毒技术特异性好,灵敏度高,可用于感染性腹泻暴发中诺如病毒的快速筛查.     

果蔬样品中诺如病毒快速检测方法的研究

目的建立果蔬样品表面诺如病毒快速有效的检测方法,评价酸吸附-碱洗脱-PEG沉淀法对果蔬样品表面诺如病毒分离富集的适用性,为诺如病毒疫情的控制和食源性疾病的溯源提供可靠的实验室依据。方法在北京地区采集草莓样品,采用酸吸附-碱洗脱-PEG方法分离富集样品表面病毒颗粒,设计GⅠ和GⅡ的特异性引物和探针,以实时定量RT-PCR法检测病毒核酸。同时优化病毒提取方法,以Mengo病毒做为过程控制对照,制作不同浓度的标准曲线,计算病毒回收率。结果酸吸附-碱洗脱-PEG法病毒回收率为2.36%,符合病毒检测回收率的要求,与其他食源性病毒没有交叉反应,能够应用于日常检测。结论酸吸附-碱洗脱-PEG方法病毒回收率较高,灵敏度和重复性较好,进一步优化后可以应用于果蔬样品的日常检测。     

重组酶聚合酶扩增技术(RPA)快速检测GⅡ型诺如病毒

目的建立基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术的GⅡ型诺如病毒快速检测方法。方法设计针对GⅡ型诺如病毒特异性保守序列的RPA引物,利用RPA检测试剂盒建立RPA扩增体系,并通过2%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分析鉴定,从而对引物扩增效率、特异性、灵敏度和稳定性进行评价。结果本研究针对GⅡ型诺如病毒特异性保守序列设计了RPA特异性引物RPAf/RPAr,利用RPA检测试剂盒建立了RPA扩增体系。引物筛选实验结果显示,RPA检测方法在扩增反应5min后即可定性检测诺如病毒。将GⅡ.4型诺如病毒、GⅡ.17型诺如病毒、GⅡ.3型诺如病毒、GⅡ.6型诺如病毒、星状病毒、MS2噬菌体、人轮状病毒和人腺病毒基因组作为模板进行特异性检测。结果显示,只有GⅡ.4、GⅡ.17、GⅡ.3和GⅡ.6型诺如病毒有特异性扩增,表明该方法特异性良好,可基本满足对GⅡ型诺如病毒的检测。灵敏度实验结果显示,该方法可检测低至106 copies/μL的诺如病毒。利用10例诺如病毒阳性粪便样品对RPA检测方法稳定性进行评价。结果表明,10例样品均被特异性扩增,表明该方法稳定较好。结论本文建立的RPA检测方法特异性强、灵敏度高、稳定性好以及可操作性强,可用于对诺如病毒的检测。     

感染性腹泻患者标本中检出GⅡ型诺如病毒

目的为确定引起腹泻的病原体,对腹泻患者标本进行诺如病毒核酸检测。方法应用实时荧光RT—PCR法对5份感染性腹泻患者粪便标本进行GI型和GII诺如病毒RNA检测。结果5份患者粪便标本中,1份检出GII型诺如病毒核酸。结论大连地区的感染性腹泻病例中存在GII诺如病毒感染。     

GⅡ型诺如病毒装甲RNA质控品研制

目的 采用MS2噬菌体装甲RNA技术构建内含GⅡ型诺如病毒RNA的装甲RNA质控品,为诺如病毒核酸检测提供安全稳定的标准品.方法 将MS2噬菌体成熟酶蛋白、包膜蛋白和调节位点基因(PAC基因)及GⅡ型诺如病毒520 bp片段克隆到表达质粒pET30b中,构建重组质粒pET-PAC,pET-PAC转入大肠杆菌BL21(D...     

RT-LAMP法对Ⅱ型诺如病毒的检测

目的在本实验室建立适合于基层使用的Ⅱ型诺如病毒快速检测方法 RT-LAMP法,并将其应用于临床病毒性腹泻的检测,为了解诺如病毒导致的病毒性腹泻在南京市的流行状况提供方法和数据。方法用实验室保存的诺如病毒阳性标本进行方法学建立,并收集南京地区某医院2011年秋冬因腹泻就诊并临床诊断为病毒性腹泻的57例成年人患者的粪便进行Ⅱ型诺如病毒检测,包括荧光定量PCR法及基于环的等温扩增(LAMP)法,并对检测为阳性标本核酸进行测序分析。结果所建立的Ⅱ型诺如病毒RT-LAMP法和荧光定量检测法均可以检测到稀释到10 000倍的阳性标本,即两种方法具有相同的敏感度。对于诺如病毒I型、甲肝病毒及乙肝病毒没有扩增,即对诺如病毒Ⅱ型的扩增具有特异性。57例临床粪便标本,荧光定量PCR法与RT-LAMP法均检测到6例Ⅱ型诺如病毒阳性病例,两种方法符合率为100%,经测序分析,5例为诺如病毒GⅡ.4亚型,1例为诺如病毒GⅡ.6亚型。5例GⅡ.4亚型分别来源于4个不同的流行株,3个国家和地区,巴西、俄罗斯和北京。结论南京地区2011年诺如病毒腹泻病例以GⅡ.4亚型为主要感染亚型,也有GⅡ.6亚型。结果提示该病毒传播范围的广泛性和流行病学防控的艰巨性。荧光定量PCR与RT-LAMP法都可以快速进行病原检测,但RT-LAMP法因其方法简易、不需要特殊仪器、结果直接肉眼观察而更适合基层使用。     

粪便标本中诺如病毒GⅡ拷贝数定量检测方法的建立和应用

目的 构建诺如病毒GⅡ（Norovirus Genogroup Ⅱ,NoV GⅡ）拷贝数标准质粒及其检测体系。方法 将合成高度保守的NoV GⅡ基因序列片段克隆至pUC57载体上,构建NoV GⅡ标准质粒,采用聚合酶链反应（PCR）进行验证。通过实时荧光定量PCR扩增曲线结果绘制Ct值与病毒拷贝数的标准曲线,求得其相应的标准曲线方程。采用建立的标准质粒及其检测体系对2018年12月昆明市儿童医院4份临床粪便标本进行检测。结果 经PCR验证,NoV GⅡ拷贝数的标准质粒构建正确。采用实时荧光定量PCR的扩增曲线获得Ct值与病毒拷贝数相对应的标准曲线方程为Y=-3.972X+39.03,R²=0.991,4份粪便标本原液NoV GⅡ病毒拷贝数分别为30 443.45、9 468.40、53 176.69、4 493.12 copies/μL。结论 成功建立用于检测粪便标本中NoV GⅡ病毒拷贝数的标准质粒及其检测体系,可为疾病的预防控制和相关试验研究提供有效的定量检测方法。     

粪便标本中诺如病毒GⅡ拷贝数定量检测方法的建立和应用

目的 构建诺如病毒GⅡ（Norovirus Genogroup Ⅱ,NoV GⅡ）拷贝数标准质粒及其检测体系。方法 将合成高度保守的NoV GⅡ基因序列片段克隆至pUC57载体上,构建NoV GⅡ标准质粒,采用聚合酶链反应（PCR）进行验证。通过实时荧光定量PCR扩增曲线结果绘制Ct值与病毒拷贝数的标准曲线,求得其相应的标准曲线方程。采用建立的标准质粒及其检测体系对2018年12月昆明市儿童医院4份临床粪便标本进行检测。结果 经PCR验证,NoV GⅡ拷贝数的标准质粒构建正确。采用实时荧光定量PCR的扩增曲线获得Ct值与病毒拷贝数相对应的标准曲线方程为Y=-3.972X+39.03,R²=0.991,4份粪便标本原液NoV GⅡ病毒拷贝数分别为30 443.45、9 468.40、53 176.69、4 493.12 copies/μL。结论 成功建立用于检测粪便标本中NoV GⅡ病毒拷贝数的标准质粒及其检测体系,可为疾病的预防控制和相关试验研究提供有效的定量检测方法。     

应用实时荧光定量RT-PCR技术快速检测基因Ⅱ型诺如病毒

目的建立基因Ⅱ型诺如病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并应用于临床标本的检测。方法二氧化硅法提取粪便中的病毒RNA,使用针对基因Ⅱ型诺如病毒N/S结构域的引物和探针建立荧光定量PCR方法,对罗城县急性胃肠炎疫情的34份标本进行检测,并与常规RT-PCR和ELISA检测结果比较;还用该法对2006年2月至2007年1月广西急性胃肠炎暴发及散发病例粪便样本305份做了临床检测。结果用实时荧光定量RT-PCR法成功地从罗城疫情样本中检测出基因Ⅱ型诺如病毒,实时荧光定量RT-PCR、常规RT-PCR和ELISA的检出率分别为为85.3%、76.5%和26.5%。而实时荧光定量RT-PCR对114份对急性胃肠炎暴发疫情及191份散发病例样本的基因Ⅱ型诺如病毒检出率分别为56.1%和23.6%。结论诺如病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法具有快速、灵敏和特异的优点,不但能对标本中病毒浓度进行定量检测,还能鉴别诺如病毒基因型别。同时也发现基因Ⅱ型诺如病毒感染在广西急性胃肠炎暴发疫情和散发病例中较常见。     

水及水产品诺如病毒快速检测技术研究

目的:进行水中病毒富集和水产品前处理方法的研究,以确定水及水产品诺如病毒快速检测技术。方法:不同水中病毒的浓缩富集方法,不同水产品前处理方法,通过荧光PCR检测比较效果,同时检测实际样本的诺如病毒。结果:两步浓缩法浓缩水中病毒效果比PEG沉淀法好,而两种水产品前处理方法相近,实际样本检测诺如病毒均为阴性。结论:确定了水和水产品诺如病毒快速检测技术,为水系和水产品诺如病毒监测提供依据。     

一起诺如病毒GⅡ型感染性胃肠炎聚集性疫情调查

目的调查苏州市某区幼儿园出现多名急性胃肠炎病例的感染来源、传播途径。方法疑似病例定义:2015年9月20—25日,该班级学生和教职员工中出现腹泻(≥3次/d)或呕吐者。确诊病例为可疑病例中用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检出诺如病毒阳性者。现场流行病学调查,描述三间分布。结果在该班级幼儿罹患率38.24%(13/34)。主要症状是呕吐和发热,聚集性疫情持续时间M=2 d。8份肛拭标本中6份是诺如病毒(NoV)阳性,均为GⅡ型。幼儿的罹患率性别间、在因病缺课、座位、床位分布上差异无统计学意义(P0.05)。教职员工3人中保育阿姨1人检出NoVGⅡ型。可疑的传染来源为隐性感染者保育阿姨,暴露形式为短期共同来源。结论该幼儿园的急性胃肠炎病例是由GⅡ型NoV引起的,接触传播是主要感染途径。应加强托幼机构的人员监测与防护,保持良好的手卫生是预防NoV感染和控制传播最重要最有效的措施。     

实时逆转录环介导等温扩增检测GⅡ.4型诺如病毒的研究

目的建立快速检测诺如病毒GⅡ.4型的实时逆转录环介导等温扩增方法(RT-LAMP)。方法选取GⅡ.4型诺如病毒的ORF1与ORF2接头处较为保守的基因序列设计RT-LAMP引物并进行筛选,优化反应条件,分析方法的灵敏度、分析特异性和稳定性,采用优化的方法检测40例临床病毒性腹泻样本,结果与实时荧光逆转录PCR(RT-PCR)比较。结果该研究建立的诺如病毒GⅡ.4型RT-LAMP的最佳反应温度为65℃;该方法检测GⅠ型和GⅡ非诺如病毒4型、轮状病毒、札如病毒、星状病毒、腺病毒、CA16、EV71、CA6和CA10等常见10种其他腹泻病毒的结果为阴性;该方法对诺如病毒GⅡ.4型的检测能力与实时荧光RT-PCR相当;与实时荧光RT-PCR相比,该研究建立的RT-LAMP法检测诺如病毒GⅡ.4型阳性样本和诺如病毒阴性样本的符合率为100%。结论该研究建立的诺如病毒GⅡ.4型RT-LAMP快速检测方法灵敏度高,特异性好,为建立诺如病毒其他基因型的RT-LAMP检测方法奠定了基础。     

一起集体单位诺如病毒G Ⅱ型腹泻暴发疫情调查

目的分析北京市东城区一起诺如病毒GⅡ型暴发疫情的发生原因,探讨集体单位聚集性疫情监测的重要性。方法采用确定病例定义、开展病例搜索、现场调查及实验室检测方法,分析暴发疫情病例的分布特征及感染来源。结果此次疫情共发病78人,罹患率15.4%。首发病例3月2日发病,发病高峰在3月5日,病例主要临床表现为腹泻(84.6%)、呕吐(66.8%),男女性别比为1∶2.1,部门3的罹患率最高为42.9%。发病者和未发病者诺如病毒GⅡ型阳性检出率分别为76.5%和22.2%。发病者发病时间均在与首发病例密切接触或食用可疑污染食品后的最短和最长潜伏期内(24~72 h)。结论该起疫情为一起食堂凉菜制作人员感染诺如病毒GⅡ型后继续在岗工作,引起就餐人员发生诺如病毒感染的暴发疫情,高度怀疑通过污染食品和密接接触传播途径传播。     

一起幼儿诺如病毒GⅡ型感染性腹泻聚集性疫情调查报告

目的了解某幼儿园诺如病毒感染病腹泻聚集性疫情流行病学特征,分析疫情原因,探索适应新形势的校园传染病防控模式。方法制定病例定义,开展病例搜索,并病例进行个案调查和现场流行病学调查分析流行特征和暴发危险因素,并对采集样品进行实验室检测。结果共搜索到16名病例,其中7例幼儿可能病例、8名幼儿确诊病例和1名教职工确诊病例,全园罹患率为3.59%(16/446)。该起疫情仅涉及1个班级,所涉班级幼儿罹患率和教职工罹患率分别为45.45%(15/33)和33.33%(1/3),其中男性罹患率61.11%(11/18),女性罹患率26.67%(4/15),男女幼童罹患率差异无统计学意义(P=0.08)。22份肛拭子样品中有10份诺如病毒核酸GⅡ阳性(8例患病幼儿、1例患病老师和1名隐形感染保育员);空调冷空气促使诺如病毒的气溶胶呈扇形加速扩散,导致部分幼儿感染发病。结论该聚集性疫情由感染诺如GⅡ型病毒的教职工呕吐形成的气溶胶在空调冷空气的加速扩散导致,因此应加大教职工健康监测力度,一旦出现腹泻、呕吐等症状及时有效隔离。     

一起GⅡ型诺如病毒感染性胃肠炎暴发的现场调查

目的：对广州某大学发生的胃肠炎暴发事件进行现场卫生学调查,寻找疾病暴发来源并制定相关疾病防控措施。方法开展现场流行病学调查,采集病例、环境和水样本进行实验室检验。结果患者和厨工肛拭子诺如病毒核酸检测阳性率分别为18.18%、15.83%。桶装水合格率100%;饮水机水、末梢水细菌总数合格率分别为33.33%、50.00%;二次供水水池水细菌总数超标并检出耐热大肠菌群。水样诺如病毒核酸检测阴性。结论此次疫情应为厨工GⅡ型诺如病毒感染导致的食源性传播。该校存在饮水卫生安全隐患。