人hCGβ真核表达载体的构建及稳定转染B16细胞系的建立

目的:构建人hCGβ真核表达载体,稳定转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,建立稳定表达人hCGβ的小鼠黑色素瘤细胞系。方法:采用PCR方法扩增出人hCGβ全长基因的cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pIRES-neo中,并加入酶切位点和6×His标签,得到重组表达质粒pIRES-neo-hCGβ-(His)6。利用阳离子脂质体介导法将其稳定转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,经G418加压筛选出阳性克隆。RT-PCR、Westernblot及免疫荧光检测人hCGβ在B16细胞中的表达。结果:经限制性内切酶鉴定及序列分析,pIRES-neo-hCGβ-(His)6重组体构建正确,最终建立的表达人hCGβ基因的B16细胞系阳性率高于90%。结论:成功构建了真核表达载体pIRES-neo-hCGβ-(His)6,建立的稳定转染人hCGβ小鼠黑色素瘤细胞系能够高效表达hCGβ基因。该稳定转染细胞系的建立为进一步研究人hCGβ抗肿瘤基因疫苗的功能提供了良好的实验基础,为hCGβ在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了研究基础。     

MAGE-3基因稳定转染的HHCC细胞系的建立及其mRNA的表达

目的：构建肿瘤抗原MAGE-3基因的真核表达载体，建立MAGE-3基因稳定转染的人肝细胞癌细胞系（human hepatocellular carcinoma cell line，HHCC）。方法：利用分子生物学方法，构建带有MAGE-3基因和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-MAGE-3，经脂质体法转染HHCC后，用G418筛选阳性克隆。在荧光显微镜下观察HHCC中EGFP的表达，用RT-PCR法检测HHCC中MAGE-3 mRNA的表达。结果：成功地构建了重组真核表达载体pIRES2-EGFP-MAGE-3。以其转染HHCC后，经荧光显微镜及RT-PCR分别检测到MAGE-3 mRNA转录和EGFP的表达。结论：建立了1株可稳定转染MAGE-3基因的肝细胞癌HHCC，为进一步应用该基因进行肝癌的免疫治疗提供了实验依据。     

乙肝病毒HBsAg-EGFP融合蛋白真核表达载体构建及稳定转染Chang Liver细胞系的建立

目的 构建可表达乙型肝炎病毒(HBV)HBsAg-EGFP融合蛋白的真核表达载体;获得重组质粒稳定转染的Chang Liver细胞系.方法 利用PCR技术从HBV基因组中扩增出HBsAg基因片段,BamH I/EcoR l双酶切后连接到经同样酶切的pEGFP-N1真核表达载体,转化TG1菌株感受态细胞,获得阳性重组质粒pEGFPNl.HBsAg.将阳性克隆用脂质体法转染Chang Liver细胞,经持续G418压力选择和有限稀释法克隆化获得稳定转染的细胞系.结果 成功构建了真核表达载体pEGFPN1-HBsAg;建立了其重组质粒稳定转染的Chang Liver细胞系.结论 重组质粒稳定转染的Chang Liver细胞系可表达HBsAg-EGFP融合蛋白;该细胞系可以用于筛选HBsAg转染细胞后,差异表达的蛋白质研究,为深入研究HBsAg可能的致病机制提供依据.     

人TSARG4真核表达载体的构建及稳定转染HeLa细胞系的建立

目的: 构建人TSARG4基因真核表达载体,转染HeLa细胞,建立稳定转染TSARG4的HeLa细胞系.方法: 应用 RT-PCR从人睾丸中扩增TSARG4的开放阅读框(ORF),并将 PCR产物插入到pUCm-T载体中测序验证.随后,将TSARG4进一步克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中.用脂质体将经过测序、验证的pcDNA3.1(+)/TSARG4质粒转染HeLa细胞,通过G418筛选建立TSARG4稳定转染的HeLa细胞系.RT-PCR和组织原位杂交技术检测TSARG4在稳定转染的HeLa细胞系中的表达.结果: 成功构建了pcDNA3.1(+)/TSARG4表达质粒,建立了稳定转染的HeLa细胞系.RT-PCR和组织原位杂交检测结果表明,TSARG4基因在该细胞系中成功表达.结论: TSARG4真核表达载体成功构建和稳定转染HeLa细胞系的建立为进一步体外研究TSARG4的功能奠定了基础.     

构建睾丸特异性乳酸脱氢酶真核表达载体稳定转染HeLa细胞并成功表达

<正>睾丸(精子)特异性乳酸脱氢酶(testis-specific lactate dehydrogenase),是上世纪60年代发现的乳酸脱氢酶同工酶之一,早期称乳酸脱氢酶-X,现称乳酸脱氢酶C4(lactatedehydrogenase C4,LDHC4)。LDHC4的合成受LDHC基因的控制,该基因开放读码框为999 bp,可编码一个相对分子质量(Mr)为35 000的C亚基,4个C亚基可同源聚合形成催化活     

丙肝病毒NS5B-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及稳定转染HepG2细胞系的建立

目的　构建可表达丙型肝炎病毒 (HCV)NS5B EGFP融合蛋白的真核表达载体 ;获得重组质粒稳定转染的HepG2 细胞系。方法　利用PCR技术从HCV基因组中扩增出ns5b基因片段 ,XhoⅠ KpnⅠ双酶切后连接到经同样酶切的pEGFP N3真核表达载体 ,转化TG1菌株感受态细胞 ,获得阳性重组质粒pEGFPN3 ns5b。将阳性克隆用脂质体法转染HepG2 细胞 ,经持续G4 18压力选择和有限稀释法克隆化获得稳定转染的细胞系。结果　成功构建了真核表达载体pEGFPN3 ns5b ;建立了其重组质粒稳定转染的HepG2 细胞系。结论　重组质粒稳定转染的HepG2 细胞系可表达NS5B EGFP融合蛋白 ;该HepG2 细胞系可以应用于以ns5b基因为靶位的抗HCV感染研究     

小鼠Ccr2基因真核表达载体的构建及稳定转染细胞株的建立

目的:构建小鼠Ccr2基因真核表达载体,转染RAW264.7,建立稳定转染Ccr2的RAW264.7细胞系。方法:应用RT-PCR从小鼠脾脏组织中扩增Ccr2mRNA全序列,插入真核表达载体pEGFP-N1中。用脂质体将重组质粒pEGFP-N1/Ccr2转染RAW264.7细胞,通过G418筛选建立Ccr2稳定转染的RAW264.7细胞系。经RT-PCR、Western blot检测、荧光显微镜和流式细胞仪FCM检测,了解Ccr2在RAW264.7细胞中的表达水平及细胞内定位。结果:成功构建了pEGFP-N1/Ccr2重组质粒,建立了稳定转染的RAW264.7细胞株。RT-PCR和Western blot检测证实,Ccr2基因在该细胞系中成功表达,荧光显微镜下观察到该基因定位于细胞膜上,FCM显示90%以上的细胞膜上均有CCR2的表达。结论:构建了Ccr2真核表达载体并建立了稳定转染的RAW264.7细胞株。为进一步研究MCP1/CCR2信号通路在结核杆菌诱导巨噬细胞凋亡中的作用奠定了基础。     

HBV基因组各基因真核表达载体的构建及转染

目的 构建HBV基因组各基因真核表达载体,转染HepG2细胞,建立稳定转染的HepG2细胞系.方法 采用PCR方法,以HBV全基因组质粒为模板扩增HBV基因的各基因片段,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染HepG2细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的HepG2细胞系,用细胞流式技术及细胞免疫组化技术检测HBV各基因产物在细胞内的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1( )/HBs、pcDNA3.1( )/HBc、pcDNA3.1( )/HBe、pcDNA3.1( )/HBp、pcDNA3.1( )/HB-preS1、pcDNA3.1( )/HB-preS2、pcDNA3.1( )/HBx真核表达载体,并建立了稳定转染的HepG2细胞系,成功地表达目的 基因.结论 真核表达载体成功构建和稳定转染HepG2细胞系的建立为进一步研究各基因的功能奠定良好的实验基础.     

胰腺导管癌干细胞抗原PSCA和Oct-4表达及意义

目的研究胰腺导管癌、癌旁上皮及慢性胰腺炎组织中前列腺干细胞抗原（PSCA）和Oct-4表达及探讨其临床病理意义。方法51例胰腺导管癌、20例癌旁上皮及10例慢性胰腺炎手术切除标本常规石蜡包埋切片,PSCA和Oct-4染色方法为EnVision两步法。结果胰腺导管癌PSCA和Oct-4阳性表达率（52．9％,47.1％）明显高于癌旁上皮（25.0％,20,0％）和慢性胰腺炎（10．0％,10.0％）,差异均有显著性意义（P〈0．05）。高分化腺癌和无转移胰腺导管癌PSCA和Oct-4表达阳性率明显低于低分化腺癌和转移病例（P〈0.05）。结论PSCA和Oct-4表达可能是反映胰腺导管癌发生、进展及预后的重要癌干细胞抗原。     

小鼠Prohibitin真核表达质粒的构建及在293T细胞中的表达

目的构建小鼠Prohibitin基因真核表达质粒,在293T细胞中进行表达鉴定,为研究小鼠Prohibitin基因功能奠定基础。方法以小鼠Prohibitin基因cDNA序列为模板,设计特定引物,应用PCR的方法扩增其编码序列全长,并将其克隆到真核表达载体pEFP-C2中,将获得的重组表达质粒转染293T细胞,应用RTPCR、Western blot方法检测其表达。结果成功构建了pEGFP-Prohibitin真核表达质粒,将其成功转染293T细胞,pEGFP-Prohibitin转染组Prohibitin蛋白和mRNA在293T细胞的表达量比转染空载转染组明显增加。结论成功构建了真核表达质粒pEGFP-Prohibitin,并在真核细胞表达良好,为研究小鼠Prohibitin的基因功能奠定了基础。     

稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)58型E6E7融合基因的B16细胞系的建立

目的:构建pIRES-neo-HPV58E6E7真核表达载体,稳定转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,建立稳定表达HPV58E6E7基因的B16细胞系。方法:采用PCR方法扩增出HPV58E6E7融合基因的全长序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pIRES-neo中,并加入酶切位点和6×his标签,构建重组真核表达质粒pIRES-neo-HPV58E6E7。利用阳离子脂质体介导法将其转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,经G418加压筛选出稳定转染的阳性克隆。利用Western blot、流式细胞术、免疫荧光等检测方法验证HPV58E6E7融合基因在稳定转染的B16细胞株中的表达。结果:经PCR、限制性内切酶鉴定及测序分析,pIRES-neo-HPV58E6E7重组质粒构建正确,转染B16细胞株后,经过Western blot、流式细胞术和免疫荧光等检测显示B16细胞株能够稳定、高效表达HPV58E6E7融合基因,表明B16-HPV58E6E7稳定转染细胞系构建成功。结论:成功构建了pIRES-neo-HPV58E6E7真核表达载体,建立了可以高效、稳定表达HPV58E6E7融合基因的B16细胞系。该稳定转染细胞系的建立为进一步研究HPV58治疗性基因疫苗的功能提供了良好的靶细胞,为其在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了研究基础。     

人CD34真核表达载体构建及稳定转染细胞系的建立

目的:构建人CD34真核表达载体,转染到3T3细胞获得稳定表达CD34的细胞株。方法:在人KG1a细胞中提取细胞总RNA,运用RT-PCR方法扩增CD34基因,定向克隆入真核表达载体pCI-neo,通过电转仪转染3T3细胞,流式细胞仪分选建立稳定转染的3T3细胞系,用RT-PCR、FACS检测目的蛋白的表达。结果:构建了重组载体pCI-neo/CD34,建立了稳定表达CD34的3T3细胞系。结论:重组载体pCI-neo/CD34构建成功和稳定转染3T3-CD34细胞系的建立为制备抗人CD34单克隆抗体(mAb)做了准备,为进一步研究CD34分子的功能奠定了基础。     

mTSARG3真核表达载体的构建及其稳定转染细胞系的建立

目的:构建小鼠mTSARG3基因真核表达载体,转染小鼠精原细胞系GC-1,建立稳定转染mTSARG3的GC-1细胞系,利用流式细胞技术(FCM)进行初步功能研究。方法:应用RT-PCR从小鼠睾丸cDNA文库中扩增mTSARG3的开放阅读框(ORF),并将PCR产物插入到pGEM-TEasy载体中测序验证。随后,经NotI和Hind III酶切后将目的片段进一步克隆到pcDNA3.1 Hygro(-)真核表达载体中。将经过测序验证的pcDNA3.1 Hygro(-)/mTSARG3表达质粒转染GC-1细胞,通过潮霉素筛选建立mTSARG3稳定转染的GC-1细胞系。RT-PCR和Western blot检测mTSARG3在稳定转染的GC-1细胞系中的表达;FCM观察转染pcDNA3.1 Hygro(-)/mTSARG3重组质粒)对GC-1细胞周期和凋亡的影响。结果:成功构建了pcDNA3.1 Hygro(-)/mTSARG3表达质粒,建立了稳定转染的GC-1细胞系。RT-PCR和Western blot检测结果发现,mT-SARG3在GC-1细胞系中成功表达。进一步通过FCM检测分析发现,转染mTSARG3可促进GC-1细胞增殖,抑制细胞凋亡。结论:mTSARG3真核表达载体的成功构建和稳定转染重组质粒GC-1细胞系的建立为进一步体外研究mTSARG3的功能奠定了基础。     

重组HER2真核表达载体的构建及其稳定转染EMT6细胞株的筛选

目的:构建人表皮生长因子受体(HER2)胞外区(1 896 bp)基因的真核表达质粒(pcDNA6/v5-his-HER2),转染小鼠乳腺癌细胞(EMT6),获得其稳定表达细胞株(EMT6/ HER2).方法:用PCR方法从含HER2全长基因的pcDNA3.1-HER2质粒上扩增HER2胞外区基因序列;经酶切、连接构建pcDNA6/v5-his-HER2;转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,对其进行酶切及测序鉴定;以PEI法将pcDNA6/v5-his-HER2导入EMT6小鼠乳腺癌细胞,经杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选1～2周,获得抗性克隆EMT6/HER2;用RT-PCR检测EMT6/HER2中HER2 mRNA,免疫组化法检测其HER2蛋白的表达.结果:PCR产物与预期片段大小一致;pcDNA6/v5-his-HER2经酶切、琼脂糖凝胶电泳后,可见与PCR产物大小相同的片段;DNA测序结果显示,pcDNA6/v5-his-HER2 中HER2 基因序列无误,读码框正确;用RT-PCR可在EMT6/HER2中检测到HER2 mRNA,免疫组化法证实,EMT6/HER2中有HER2的阳性信号.结论:成功地构建了HER2胞外区真核表达载体,获得稳定表达HER2基因的小鼠乳腺癌EMT6细胞株,为进一步研究HER2基因过表达与乳腺癌发生的关系及其基因治疗奠定基础.     

人CXCR3B基因转染细胞株的构建、鉴定及生物学功能研究

目的:克隆人CXCR3B基因,并构建含有该目的基因的真核表达载体,获得稳定表达人CXCR3B分子的基因转染细胞株L929-huCXCR3B.方法:采用PCR方法从pMD19-T/huCXCR3A质粒中扩增人CXCR3B基因,通过双酶切装入真核表达载体pIRES2-EGFP中;脂质体法转染L929细胞,G418加压筛选阳性克隆;分别用RT-PCR方法与免疫荧光技术分析阳性克隆中人CXCR3B在mRNA和蛋白水平的表达.MTT分析基因转染细胞株 L929-huCXCR3B 在Mig( monokine induced by IFN-γ,IFN-γ诱导的单核因子)作用下的增殖能力.结果:成功克隆了人CXCR3B基因并构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/huCXCR3B,转染该载体后获得了稳定表达人CXCR3B的基因转染细胞株L929-huCXCR3B,膜表面CX-CR3B分子的阳性表达率为93％.该基因转染细胞与其配体Mig共培养24、48及72 h,抑制率分别为41.44％、44.01％和24.80％.结论:L929-huCXCR3B细胞株的建立为研究CXCR3B信号转导及制备相应的单克隆抗体(mAb)奠定了基础.     

GAM cDNA稳定转染的M1细胞系的建立与鉴定

目的为搞清 GAM在 gp130介导的信号传导中所起的作用。方法选择在 IL - 6刺激下出现分化和增殖抑制的M1细胞系 ,分别用正向和反向插入 GAM c DNA的真核表达载体 p EF- BOS与 p SV2 - neo质粒共转染 ,经 G418选择培养筛选得到稳定转染的细胞 ,并用半套式 PCR方法证实了 GAM基因与这两种细胞基因组 DNA的整合。结果流式细胞仪分析表明正向 GAM c DNA转染的 M1细胞中 GAM的表达水平明显升高 ,3H掺入实验表明 GAM表达水平升高使 M1细胞对 IL - 6的反应性下降。结论 GAM高表达 M1细胞的建立为深入研究 GAM在 gp130介导的信号传导中的作用提供了良好的实验模型     

转染小鼠可诱导共刺激分子配体基因细胞株的构建及其对T细胞体外活化与增殖的促进作用

目的 构建转染小鼠可诱导共刺激分子配体(ICOSL)基因的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞株(CHO/ICOSL),探讨其对T细胞体外增殖与活化的促进作用.方法 从小鼠脾脏细胞中抽提总RNA,采用RT-PCR的方法获得小鼠ICOSL基因,经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切后装入EGFP-pIRES2真核表达载体中并测序鉴定,用脂质体转染技术将重组载体EGFP-pIRES2/ICOSL转染CHO细胞,经G418加压筛选,流式细胞术和RT-PCR分析其在CHO细胞中的表达.以转染空载体CHO细胞(CHO/Mock)作为对照,将CHO/ICOSL细胞与T细胞体外共培养,通过检测活化T细胞上CD25、CD69的表达及T细胞增殖实验对小鼠ICOSL转基因细胞的生物学功能进行初步研究.结果 CHO/ICOSL基因转染细胞能稳定地高表达小鼠ICOSL分子.与CHO/Mock相比,CHO/ICOSL基因转染细胞能够显著促进T细胞的体外活化与增殖(P＜O.05).结论 成功构建稳定表达小鼠ICOSL的基因转染细胞株,该细胞株能显著促进T细胞的体外活化与增殖,为进一步深入研究该分子生物学功能奠定了基础.