用Chelex-100快速提取微量血痕中的DNA

目的 观察用Chelex-100从微量血痕中提取DNA的效果。方法 40份血痕纱布,取血痕3 mm×3mm置于1.5 mL离心管中,采用5％Chelex-100加煮沸法,提取血痕纱布中的DNA。提取液经过紫外分光光法测定,测其A260/280的比值,计算提取液DNA的纯度和浓度;DNA提取液经微型琼脂糖凝胶电泳,检测其DNA电泳带。结果 Chelex-100能快速在1 h之内提取微量血痕中的DNA,其提取液DNA纯度:27.5％样品纯度A260/280比值大于1.6,72.5％样品纯度比值在1.08～1.54之间;提取液DNA浓度:80％样品小于100μg/mL,20％样品在100～166μg/mL之间。微型琼脂糖凝胶电泳未观察到DNA条带。结论 用Chelex-100法有助于快速提取微量血痕中的DNA。     

一种制备质粒DNA的改良碱裂解法

目的介绍一种快速获取高纯度质粒DNA的方法。方法使用替代试剂，建立改良的碱裂解法进行质粒DNA提取，并用琼脂糖电泳验证所得的质粒的质量，紫外测量估算产量及纯度。限制性酶切验证其用度。结果琼脂糖电泳显示质粒DNA条带明亮，以超螺旋方式为主。A260／280为1．903，含量为320μg／mL，酶切后得到约500bp的目的片段。结论改良碱裂解法操作简单、实用，所得样品纯度高，达到了分子生物学常规实验的要求。     

pcDNA3-内皮抑素质粒的大规模纯化

目的：探索pcDNA3-内皮抑素质粒的大规模纯化工艺。方法：碱裂解法提取质粒后，用0．4mol／L CaCl2沉淀除去RNA,再用Q-Sepharose XL进行初纯，SOURCE 15Q精纯。所得纯化物以1％琼脂糖凝胶电泳鉴定超螺旋质粒的含量。结果：经此方法纯化的pcDNA3-内皮抑素质粒中超螺旋质粒的含量可达95％以上，且无RNA检出。结论：该法可以实现pcDNA3-内皮抑素质粒的大规模纯化。     

一种鉴别CCC型质粒带的简便方法

用单向二步琼脂糖凝胶电泳可鉴别金黄色葡萄球菌质粒谱中的CCC型质粒带。先将质粒DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳,再将电泳后的凝胶板置于2.537×10~(-7)m紫外灯下10 cm处照射25 min后,在同方向下进行第二步电泳,分子量为1.69±0.05～22.24±0.73 Md的CCC型质粒均可出现肉眼可见的OC型带;非CCC型质粒无OC带出现,据此可判别金黄色葡萄球菌中绝大多数菌株的CCC型质粒带和被染色体DNA带所掩蔽的质粒。     

pUHD10-3-p53质粒的扩增及分离纯化

目的:建立一种确实有效的pUHD10-3-p53质粒提取方法,为科学研究制备高纯度pUHD10-3-p53质粒奠定基础.方法:将克隆有Wt-p53基因的eDNA质粒(pUHD10-3-p53)转染感受态细菌E.coli DH5a菌株.经扩增,用小量碱裂解法提取质粒DNA,再纯化后,用紫外分光光度计测定其含量,并进行酶切电泳鉴定.结果:pUHD10-3-p53质粒用限制性内切酶BamH Ⅰ酶切后在1.5%琼脂糖凝胶中电泳,可观察到3.15、1.8 kb两条区带.结论:用小量碱裂解法提取pUHD10-3-p53质粒,效率高,质量稳定,得到的质粒DNA的质量与纯度均符合实验要求.     

一种高效的质粒DNA少量提取的新方法

目的：介绍一种质粒DNA少量提取的新方法。方法：使用替代试剂,建立改良的碱裂解法进行质粒DNA提取,并用琼脂糖电泳验证所得的质粒的质量和产量。结果：琼脂糖电泳显示质粒DNA条带明亮,主要以超螺旋方式为主。结论：新方法操作简单、实用,达到分子生物学常规实验的要求。     

几种miniprep提取质粒DNA方法的比较与改良

目的 比较并建立一种简单的、稳定的质粒DNA提取改良方法,探讨其在分子生物学实验研究中的应用价值.方法 采用琼脂糖凝胶电泳对质粒DNA提取的试剂盒法、煮沸法、碱裂解法、碱裂解结合酚氯仿法四种方法进行比较.结果 试剂盒法的电泳谱带亮度最高且无RNA条带,煮沸法、碱裂解法、碱裂解结合酚氯仿法的电泳谱带亮度依次增高.结论 试剂盒法制备DNA纯度最高,且操作简便省时.     

用层析和改良的酸酚法提取和纯化质粒

本文用过Sepharose 4B除去质粒粗提物中RNA,然后用改良的酸酚法除去开环型质粒。用0.8％琼脂糖凝胶电泳、紫外荧光薄层扫描和pst Ⅰ限制性内切酶消化质粒法鉴定。此方法可制备出足够的高纯度质粒。     

金黄色葡萄球菌CCC型及OC型质粒的检测

采用已报道的金黄色葡萄球菌质粒DNA的检测方法(简称LL法)。从1982年在南京地区临床分离的131株金黄色葡萄球菌中的125株(95.4%)中检出质粒,可分为21质粒谱。经单向及双向二步琼脂糖凝胶电泳法鉴别,按分子量共有16个CCC型质粒带(P_1～P_(16))。用改良的LL法制备E.coli V517菌株质粒DNA,建立了简便的测定金黄色葡萄球菌质粒DNA分子量的参考系统。结果表明:要本实验条件下,P_1～P_(16)的分子量为1.42 Md～22.24±0.73 Md;以含有14.88、2.66±0.06 Md质粒谱的菌株较常见,占总数的25.2%;2.66±0.06 Md的质粒最常见,在73.3%的菌株中检出。     

HCGβ抗肿瘤核酸疫苗的纯化工艺

对HCGβ抗肿瘤核酸疫苗的预处理和层析纯化工艺进行了研究。用碱裂解法对湿菌体进行预处理,当菌体湿重（g）∶悬浮液体积（mL）∶裂解液体积（mL）∶中和液体积（mL）为1∶2∶2∶2,碱裂解时间为8-12 min时,质粒的产量最高,可达32.94 mg/g。用Sepharose 6 FF凝胶过滤层析去除RNA和蛋白质,再用Plasmidselect亲和层析捕获超螺旋质粒DNA,质粒DNA的得率为48.3%。用L-Histidine-agarose亲和层析可从澄清的碱裂解液中一步分离纯化超螺旋质粒DNA,质粒DNA得率为51.62%。经琼脂糖核酸电泳检测,HCGβ抗肿瘤核酸疫苗超螺旋质粒DNA的纯度为100%电泳纯。     

小鼠PPARγ2基因表达载体pcDNA3-PPARγ2的转化扩增

目的对含小鼠过氧化物酶体增殖物激活受体γ2（mPPARγ2）基因载体pcDNA3-PPARγ2进行体外转化和扩增,为基于PPARγ2的相关研究提供高纯度、高丰度的表达载体。方法取pcDNA3-PPARγ2质粒转化DH5α感受态菌,再接种到含氨苄青霉素的LB琼脂培养板进行抗性筛选培养,挑取阳性克隆菌落进行培养后抽提质粒,紫外分光光度计测定提取质粒的纯度和浓度,并取样进行琼脂糖凝胶电泳验证。结果经转化后获得了大量抗氨苄青霉素的阳性克隆菌落,挑取阳性克隆并经培养后提取的pcDNA3-PPARγ2质粒其A260/A280=1.89,浓度为420 ng/μl。结论成功转化并扩增了pcDNA3-PPARγ2质粒,为PPARγ的相关研究提供了高纯度、高浓度的表达载体。     

HCMV pp65 DNA疫苗的纯化与检定

目的研究HCMV pp65 DNA疫苗（pcDNA3.1-pp65）的纯化工艺,并建立质控标准。方法对工程菌（DH5α/pcDNA3.1-pp65）的高效发酵菌体采用碱裂解法进行质粒初提;三步柱层析（依次为分子筛层析、亲和层析、阴离子层析）对质粒进行纯化,检测质粒含量、超螺旋比例、内毒素等,最后对终产品质粒溶液进行全面质量检定。结果质粒初提液通过分子筛层析后,去除了大量RNA、宿主DNA、内毒素等,再经亲和柱纯化后获得了高比例的超螺旋质粒DNA,达95%,经阴离子柱层析有效去除内毒素,质粒得率为0.8-0.95 mg/g菌,质粒总回收率达72.7%。三批终产品全面质量检定均符合规定。结论建立了稳定的HCMV pp65 DNA疫苗（pcDNA3.1-pp65）纯化工艺及质量控制标准,为进一步研究奠定了重要基础。     

用溶菌酶—SDS微量法提取金黄色葡萄球菌质粒DNA

本文报道了检测金黄色葡萄球菌质粒DNA的微量方法(溶菌酶-SDS微量法),无需使用溶葡萄球菌素(Lyostaphin)。方法用少量的斜面培养物,经溶菌酶、SDS、EDTA裂解细胞,碱酚和氯仿-异戊醇一次脱蛋白,乙醇沉淀DNA,便得到可以直接用于琼脂糖凝胶电泳检测的质粒DNA。将该法与常规的溶葡萄球菌素法进行比较,分别检测了30株从南京地区临床分离的耐药性金黄色葡萄球菌。两种方法对细胞的裂解率为100%,质粒检出率为96.6%。用两种方法所得到的质粒电泳图谱基本相同,有些菌株发现有大质粒带。     

PCR及Real-time PCR评价细菌DNA提取方法

目的:比较几种不同的细菌DNA提取方法,建立一种适于PCR和Real-time PCR的细菌DNA提取方法.方法:分别用蛋白酶K法、碱裂解法、Chelex-100 NP40、Chelex-100 TritonX-100法和水煮法提取同种浓度大肠杆菌DNA,测定OD260/280;用不同方法提取不同浓度的大肠杆菌DNA,进行PCR和实时荧光定量PCR扩增,比较灵敏度.结果:5种方法提取细菌DNA,其中Chelex-100 NP40 法纯度(OD260/280=1.79±0.03)最高,此方法所提取的DNA产物进行PCR及Real-time PCR扩增未见假阳性及假阴性,其灵敏度为10个/ml细菌浓度.结论:Chelex-100 NP40的细菌DNA提取方法纯度及灵敏度高,且适应于PCR及Real-time PCR.     

不同产地连翘新鲜果实DNA提取方法和质量评价研究

目的建立连翘新鲜果实中高质量DNA的提取方法,为从分子水平研究和评价连翘药材质量奠定基础。方法采用改良的CTAB法提取连翘的总DNA,应用琼脂糖凝胶电泳法、分光光度法与PCR法对连翘DNA产率和质量进行检测评价。结果 14批连翘药材核酸蛋白仪测定值A260/A280均在1.7~1.9之间,改良CTAB法提取的连翘总DNA浓度较大,干扰较小,较高质量的DNA可进行PCR扩增,1%琼脂糖凝胶电泳之后用紫外成像仪观察结果正常。结论改良CTAB法适合连翘新鲜果实中DNA的提取,方法简单可靠。     

碱裂解法提取质粒DNA的研究

目的对碱裂解法提取质粒DNA中主要试剂的作用进行研究.方法采用不同的溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ分别进行质粒DNA的提取.结果方法3得到质粒DNA的量明显偏少,方法4得到的质粒DNA含蛋白质较多.结论溶液Ⅰ对实验结果影响不大,溶液Ⅱ中的NaOH关系到所提取质粒DNA量的多少,溶液Ⅲ中的醋酸钾是蛋白质能否去除的一个重要因素.     

用于慢病毒包装的高纯度质粒 DNA 的大量制备和应用

目的：建立简便易行、成本低廉和安全可靠的高纯度质粒大量制备方法,探讨其在分子生物学研究中的应用。方法：培养含目的质粒的菌株,运用改良后的碱裂解法大量提取质粒DNA并进行纯化,微量核酸仪测定质粒DNA的产量及纯度;采用琼脂糖凝胶电泳、限制性核酸内切酶酶切、转染哺乳动物细胞和慢病毒包装,鉴定质粒DNA的质量及转染效率。结果：本质粒提取方法获得质粒DNA产量为2．5mg／L菌液,OD260/OD280=1．91;以超螺旋质粒DNA为主;限制性核酸内切酶可完全酶切;哺乳动物细胞转染效率在85％以上;可用于慢病毒包装。结论：本方法抽提质粒DNA操作简单、经济实用,可替代质粒大量提取试剂盒获得高产优质的质粒DNA,充分满足了分子生物学实验的要求。     

几种单头螨线粒体基因组提取方法的比较

目的:比较几种单头螨线粒体基因组提取方法。方法:参考文献的方法,分别用酚氯仿抽提法、Chelex-100抽提法和蛋白酶K法提取单头螨的总DNA,用COⅠ引物进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳,比较不同抽提方法的结果。结果:酚氯仿抽提法未能扩增出目的基因,而Chelex-100抽提法和蛋白酶K法均成功扩增出了目的基因。结论:Chelex-100抽提法和蛋白酶K法均可用于单头螨线粒体基因的提取,前者获得的模板量大于后者,但是提取效率小于后者。     

载绿色荧光蛋白基因壳聚糖纳米粒载体的制备和转染的研究

目的 优化试验条件，制备合适的壳聚糖纳米粒，并连接上质粒，研究壳聚糖纳米粒对DNA的结合能力。方法 以离子交联法制备壳聚糖纳米粒，并送激光微粒度仪及扫描电子显微镜检测，了解粒径的分布与形态；通过静电吸附作用连接上增强型绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C1(报告基因)；经琼脂糖凝胶电泳分析载体与：DNA结合能力，并通过紫外分光光度计检测其载药量和包埋率。结果 微粒度分析仪及电镜检测证实壳聚糖纳米粒呈均匀分散的球形颗粒，最小粒径为50nm，平均直径为95nm，琼脂糖凝胶电泳的结果显示壳聚糖纳米粒能有效地结合增强型绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C1,紫外分光光度计检测不同比例结合(纳米粒：质粒)pEGFP-C1,质粒的壳聚糖纳米粒的包埋率分别为：100％(50：10)，100％(50：20)，92％(50．75)和65％(50．100)。结论 制备出粒径较小、均匀的壳聚糖纳米粒，并且壳聚糖纳米粒能有效地连接上质粒。     

鲍曼不动杆菌质粒指纹图谱分析及质粒与其耐药性关系的研究

目的监测鲍曼不动杆菌的院内感染状况,探讨质粒与其耐药之间的关系.方法用琼脂纸片扩散法(K-B法)测定鲍曼不动杆菌对14种抗生素的敏感性.微量碱裂解法快速提取质粒DNA,通过琼脂糖凝胶电泳获得质粒指纹图谱.对单质粒菌株采用质粒消除试验研究其与耐药性之间的关系.结果抗生素敏感性测试结果表明,大多数菌株显示出多重耐药性.71株临床分离株中有43株检测到质粒,根据质粒图谱可分为8个型别.质粒消除试验显示32.0 kb的质粒消除后耐药性无明显变化,22.0 kb的质粒消除后,该菌对部分抗菌药物的耐药性丢失.结论亚胺培南、舒普深和头孢吡肟具有较高的抗菌活性,可作为鲍曼不动杆菌感染的治疗药物.质粒指纹技术仍可作为院内感染流行病学调查的一种重要手段,其结果表明该院鲍曼不动杆菌感染呈散发的流行态势.22.0 kg的质粒与该菌对氨苄西林、哌拉西林、庆大霉素、阿米卡星的耐药性有关.