17β-雌二醇对脂肪细胞促酰化蛋白受体和下游信号蛋白表达的影响

目的观察17β-雌二醇对3T3-L1(前)脂肪细胞促酰化蛋白受体C5L2 mRNA、细胞表面C5L2蛋白和促酰化蛋白下游信号蛋白表达的影响。方法体外培养3T3-L1细胞,"鸡尾酒"方法诱导细胞分化,用不同浓度17β-雌二醇作用于3T3-L1(前)脂肪细胞,孵育过夜后收获细胞,采用RT-PCR和流式细胞仪检测促酰化蛋白受体mRNA和蛋白表达情况;采用Western Blot法检测基础状态和促酰化蛋白刺激时Gαq/11、Gβ、p-PKCα和p-PKCζ蛋白表达。结果10-8mol/L17β-雌二醇轻度增加3T3-L1成熟脂肪细胞和前脂肪细胞C5L2 mRNA和蛋白的表达,10-6mol/L时3T3-L1成熟脂肪细胞C5L2 mRNA和蛋白表达分别下降了40%(P<0.05)和21%(P<0.05)。但前脂肪细胞C5L2mRNA和蛋白表达水平差异均无显著性。高浓度(10-6mol/L)17β-雌二醇组在一定程度上抑制促酰化蛋白刺激的成熟脂肪细胞Gαq/11、Gβ、p-PKCα和p-PKCζ的表达,促酰化蛋白刺激的蛋白表达分别减少了17%、23%、15%和15%(P均>0.05);在前脂肪细胞,10-6mol/L17β-雌二醇仅抑制促酰化蛋白刺激的Gαq/11蛋白表达24%(P<0.05),对Gβ、p-PKCα和p-PKCζ的表达无明显差异。但17β-雌二醇作用后,在一定程度上"中和"促酰化蛋白对Gαq/11、Gβ、p-PKCα和p-PKCζ的促进作用。结论高浓度雌激素可诱导促酰化蛋白抵抗发生,促酰化蛋白抵抗可能参与了高浓度雌激素引起的脂肪细胞胰岛素抵抗状态的病理生理过程。     

人参皂甙Rb1促进3T3-L1脂肪细胞分化并抑制脂解

目的 观察人参皂甙Rb1（Rb1）对3T3-L1脂肪细胞分化和脂肪分解的作用，并探讨人参抗糖尿病的作用机制。方法 在3T3-L1脂肪细胞诱导分化过程中，分别加入不同浓度的Rb1作用6d，各组脂肪细胞分别进行油红O染色，甘油三酯（TG）含量、^3H-葡萄糖转运率检测，并用实时定量PCR和免疫印迹对脂肪细胞PPARγ2、CCAAT增强子结合蛋白（C／EBPα）、脂肪酸结合蛋白（ap2）和葡萄糖转运体（Glut）1、Glut4的mRNA和蛋白水平进行测定；运用表面等离子体共振技术（SPR）测定Rb1与PPARγ结合亲和力；在分化成熟的脂肪细胞加入Rb1孵育后，测定释放到上清液的甘油含量。结果Rb1能促进3T3-L1脂肪细胞的分化程度，并呈剂量依赖关系，10μmol／L浓度使细胞内TG含量增加约56％，同时PPARγ2和C／EBPα的mRNA和蛋白水平均显著升高，其下游基因ap2的mRNA水平也明显增加。分化过程中加入Rb1的脂肪细胞基础和胰岛素介导的葡萄糖转运率增加。Glut4的mRNA和蛋白水平均上升，而Glut1则未见显著变化；SPR检测结果显示Rb1具有PPARγ结合活性，提示Rb1是PPARγ的配体；在诱导分化成熟的脂肪细胞中，Rb1抑制基础脂肪分解，10μmol／L浓度使上清甘油含量下降约50％，但对异丙肾上腺素介导的脂解没有影响。结论 Rb1作为PPARγ的配体，通过上调PPARγ2,2C／EBPα的表达促进脂肪细胞的脂肪形成；增加基础和胰岛素刺激的葡萄糖利用；同时抑制基础脂解。以上结果表明人参和人参皂甙抗糖尿病的作用可能与促进脂肪细胞分化，增加胰岛素敏感性和抑制基础脂解有关。     

烟酸对3T3-L1脂肪细胞胆固醇流出的影响

目的观察烟酸对分化成熟的3T3-L1脂肪细胞胆固醇流出的影响,并探讨其机制。方法3T3-L1细胞促分化成熟后,给与不同浓度的烟酸(0～1.0mmol/L)干预24h后,收集细胞,逆转录聚合酶链反应测定脂肪细胞三磷酸腺苷结合盒转运体A1、B族Ⅰ型清道夫受体和过氧化体增殖物激活型受体γmRNA表达,采用液体闪烁计数器检测细胞内胆固醇流出。结果烟酸呈剂量依赖性增加脂肪细胞三磷酸腺苷结合盒转运体A1mRNA的表达,并促进载脂蛋白AⅠ介导的胆固醇流出,但对B族Ⅰ型清道夫受体表达无影响。过氧化体增殖物激活型受体γ在分化成熟的3T3-L1脂肪细胞有较高水平的表达,与空白组(0.38±0.29)比较,在1.0mmol/L浓度的烟酸干预时过氧化体增殖物激活型受体γ表达明显升高(3.15±0.96),为空白组的8.3倍。结论烟酸可通过上调过氧化体增殖物激活型受体γ表达,促进脂肪细胞载脂蛋白AⅠ—三磷酸腺苷结合盒转运体A1通路,加速细胞内胆固醇流出。这可能为解释烟酸升高高密度脂蛋白胆固醇的机制提供有用的线索。     

原代培养的人网膜前脂肪细胞分化过程中基因表达和脂肪因子分泌的特征

采用胶原酶消化法分离原代培养人网膜基质前脂肪细胞进行诱导分化.在诱导分化早期,前脂肪细胞因子1表达迅速降低,而脂蛋白脂酶、PPARγ2表达迅速增加,CAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)在成熟阶段表达丰度最高.瘦素mRNA表达和分泌随分化逐渐增高,抵抗素mRNA仅在前脂肪细胞表达和分泌而脂联素mRNA仅在成熟脂肪细胞表达和分泌,胰岛素样生长因子I(IGF-I)在前脂肪细胞诱导分化前后均有分泌.     

促酰化蛋白与促酰化蛋白受体

促酰化蛋白是由脂肪细胞分泌的一种生物活性物质，是调节脂肪功能与脂肪储备的关键因素之一。促酰化蛋白与其效应细胞表面的特异性受体相互作用，在胞内信号转导途径(包括蛋白激酶C途径)参与下，可调控细胞内甘油三酯合成的关键酶-二酰基甘油转酰酶的活性，并影响激素敏感性脂肪酶活性，从而促进细胞内甘油三酯的合成，并调控脂肪细胞的分化及成脂作用。同时，影响糖代谢，调节胰岛素的敏感性。促酰化蛋白代谢途径功能失调，将引起一系列脂质代谢紊乱，并认为与肥胖症、糖尿病和心血管疾病密切相关。     

重组人白介素6对SW872脂肪细胞促酰化蛋白分泌的影响

体外培养SW872细胞，油酸诱导其分化为成熟的脂肪细胞，然后加入重组人白细胞介素6（IL-6）观察其对SW872成熟脂肪细胞促酰化蛋白（ASP）分泌的影响。结果显示0．6mmoL／L油酸刺激72h能成功诱导SW872前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞；IL-6对SW872成熟脂肪细胞ASP的分泌具有明显的抑制作用，且表现为时间和剂量依赖效应。     

氧自由基对脂肪细胞中脂联素表达的下调作用

目的研究脂肪细胞中氧自由基（reactive oxygen species,ROS）对脂联素（adiponectin,AD）表达的调节,并探讨其机制。方法培养3T3-L1细胞,并诱导其分化为脂肪细胞,以MTT比色法检测细胞的活性。采用Hydroethidi-neTM（HE）及H2-DCFDA测定细胞内ROS的产生。分别以定量PCR、多重免疫分析及夹心ELISA法,检测AD mR-NA和其蛋白的表达水平。结果低氧条件诱导脂肪细胞中ROS产生。作为一种重要的ROS,H2O2可剂量依赖性地抑制3T3-L1脂肪细胞产生AD,并降低AD基因的转录激活因子增强子结合蛋白α（CCAAT/enhancer binding pro-tein alpha,C/EBPα）及过氧化物酶体增殖激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ）的表达。结论低氧产生ROS,而ROS导致脂肪细胞中AD的表达抑制,其重要机制之一是ROS可下调C/EBPα和PPARγ,从而减弱AD基因的转录激活。     

脂肪细胞的分化调控

脂肪细胞分化受多种激素的诱导,通过各种信号转导途径,促发不同转录因子调控脂肪细胞特异基因的表达,其中,CCAAT／增强子结合(C/EBP)手过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）家族是脂肪细胞分化的主要转录调控因子,同时,脂肪细胞的分化也受各种活性因子的负向调控。     

脂肪细胞的分化调控

脂肪细胞分化受多种激素的诱导 ,通过各种信号转导途径 ,促发不同转录因子调控脂肪细胞特异基因的表达。其中 ,CCAAT/增强子结合蛋白 (C/EBP)和过氧化物酶体增殖物激活受体 (PPAR)家族是脂肪细胞分化的主要转录调控因子。同时 ,脂肪细胞的分化也受各种活性因子的负向调控。     

甘精胰岛素、地特胰岛素、人胰岛素对3T3-L1脂肪细胞PPARγ2mRNA表达的影响

目的 探讨人胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素对体外培养3T3-L1脂肪细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体-γ2(PPARγ2)基因表达的影响及可能机制.方法 体外培养3T3-L1前脂肪细胞,在分化培养液分别加入100 nmol/L、500 nmol/L、1 000 nmol/L人、甘精、地特胰岛素培养10 d,用RT-PCR检测脂肪细胞中PPARγ2 mRNA表达水平的变化.结果 在细胞分化的过程中,胰岛素浓度的增高促进PPARγ2的表达;相同浓度下,人胰岛素促进PPARγ2 mRNA表达最强,甘精胰岛素次之,地特胰岛素最弱.结论 胰岛素通过上调PPARγ2基因表达促进前脂肪细胞的分化,不同胰岛素促分化能力不同.     

新基因XTP3反式激活基因TPA的克隆化研究

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)反式激活基因XTP3的差异表达的cDNA消减文库,克隆XTP3反式激活相关基因.方法:依据我室构建的HBVX蛋白反式激活基因XTP3差异表达的cDNA消减文库,利用生物信息学技术获得新基因XTP3TPA的编码序列,对其可能的氨基酸序列进行分析比较,并对其进行克隆化研究.结果:发现了HBV XTP3反式激活作用的新的靶基因,命名为XTP3TPA.结论:这一发现为阐明HBVXTP3蛋白的反式激活作用及其机制开辟了新的研究方向.     

A Conserved Cysteine Residue in Coxsackievirus B3 Protein 3A with Implication for Elevated Virulence

Enteroviruses (EV) are implicated in an extensive range of clinical manifestations, such as pancreatic failure, cardiovascular disease, hepatitis, and meningoencephalitis. We recently reported on the biochemical properties of the highly conserved cysteine residue at position 38 (C38) of enteroviral protein 3A and demonstrated a C38-mediated homodimerization of the Coxsackievirus B3 protein 3A (CVB3-3A) that resulted in its profound stabilization. Here, we show that residue C38 of protein 3A supports the replication of CVB3, a clinically relevant member of the enterovirus genus. The infection of HeLa cells with protein 3A cysteine 38 to alanine mutants (C38A) attenuates virus replication, resulting in comparably lower virus particle formation. Consistently, in a mouse infection model, the enhanced virus propagation of CVB3-3A wt in comparison to the CVB3-3A[C38A] mutant was confirmed and found to promote severe liver tissue damage. In contrast, infection with the CVB3-3A[C38A] mutant mitigated hepatic tissue injury and ameliorated the signs of systemic inflammatory responses, such as hypoglycemia and hypothermia. Based on these data and our previous report on the C38-mediated stabilization of the CVB3-3A protein, we conclude that the highly conserved amino acid C38 in protein 3A enhances the virulence of CVB3.     

日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3疫苗免疫保护性的观察

目的　研究日本血吸虫(中国大陆株)重组信号蛋白1433(rSj1433)作为血吸虫病疫苗分子的潜能,并探讨rSj1433、rSjGST两种重组蛋白作为疫苗的协同作用及结核杆菌低分子量耐热多肽(Mtb)激活的γδT细胞在抗血吸虫病中的作用。　方法　用SDSPAGE、电洗脱和透析的方法制备rSj1433和rSjGST抗原,将两种抗原(分别用福氏佐剂和Mtb为佐剂)分别免疫BALB/c小鼠后,进行尾蚴攻击感染实验。在攻击感染6wk后,剖杀小鼠计算各组的减虫率。　结果　各组的减虫率为rSj1433+福氏佐剂组32.20%,rSj1433+rSjGST+福氏佐剂组31.10%,rSj1433+Mtb佐剂组27.96%,rSj1433+rSjGST+Mtb佐剂组26.00%,rSjGST+Mtb佐剂组27.10%;各组的减卵率分别为(按以上组序)50.40%、53.30%、51.10%、58.60%和51.30%。　结论　rSj1433具有一定的抗血吸虫潜能,有可能成为抗日本血吸虫疫苗,但未见rSj1433和rSjGST的协同作用;Mtb激活扩增的γδT细胞在抗血吸虫免疫中的效果与福氏佐剂产生的免疫作用类似。     

基质金属蛋白酶-3、C反应蛋白与颈动脉硬化的相关性研究

目的研究颈动脉粥样硬化患者血清基质金属蛋白酶-3(MMP-3)、高敏C反应蛋白(hsCRP)的变化,探讨两者之间的关系,阿托伐他丁的干预作用。方法对77例来院就诊病人行颈动脉超声检查,根据颈动脉内中膜厚度(IMT)、有无动脉斑块及斑块的性质,分为三组:颈动脉软斑组(N=36),颈动脉硬斑组(N=18),对照组(N=23);检测血清MMP-3及hsCRP水平,分析MMP-3及hsCRP的水平与颈动脉硬化、斑块性质的关系,并对其中18例颈动脉软斑患者用阿托伐他丁治疗12周,观察斑块及MMP-3及hsCRP的水平的变化。结果(1)MMP-3水平:颈动脉软斑组、颈动脉硬斑组、对照组分别为8.27±5.12ng/ml、6.15±2.20ng/ml、3.87±2.31ng/ml,三组间差异有统计学意义;CRP水平则分别为4.82±2.02mg/L、1.54±1.01mg/L、1.45±1.01mg/L,颈动脉软斑组高于颈动脉硬斑组及对照组(P<0.001),颈动脉硬斑组与对照组之间差异无统计学意义(P>0.05);(2)颈动脉软斑病人阿托伐丁治疗12周后血MMP-3的水平明显下降,复查颈动脉彩超,斑块明显好转,hsCRP的水平变化不明显(P>0.05)。结论血清MMP-3水平与颈动脉硬化及斑块性质有密切关系,阿托伐他丁有改善颈动脉硬化,降低血清MMP-3水平作用。     

Identification of a B-Cell Epitope in the VP3 Protein of Senecavirus A

Senecavirus A (SVA) is a member of the genus Senecavirus of the family Picornaviridae. SVA-associated vesicular disease (SAVD) outbreaks have been extensively reported since 2014–2015. Characteristic symptoms include vesicular lesions on the snout and feet as well as lameness in adult pigs and even death in piglets. The capsid protein VP3, a structural protein of SVA, is involved in viral replication and genome packaging. Here, we developed and characterized a mouse monoclonal antibody (mAb) 3E9 against VP3. A motif ¹⁹²GWFSLHKLTK²⁰¹ was identified as the linear B-cell epitope recognized by mAb 3E9 by using a panel of GFP-tagged epitope polypeptides. Sequence alignments show that ¹⁹²GWFSLHKLTK²⁰¹ was highly conserved in all SVA strains. Subsequently, alanine (A)-scanning mutagenesis indicated that W193, F194, L196, and H197 were the critical residues recognized by mAb 3E9. Further investigation with indirect immunofluorescence assay indicated that the VP3 protein was present in the cytoplasm during SVA replication. In addition, the mAb 3E9 specifically immunoprecipitated the VP3 protein from SVA-infected cells. Taken together, our results indicate that mAb 3E9 could be a powerful tool to work on the function of the VP3 protein during virus infection.     

日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3的纯化及抗体制备

目的制备日本血吸虫(中国大陆株)信号蛋白Sj14-3-3的多克隆抗体与单克隆抗体。方法将合Sj14-3-3重组蛋白的凝胶条带冻干磨粉,免疫家兔,制备抗Sj14-3-3多克隆抗血请;用电洗脱纯化的Sj14-3-3免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤技术制备抗Sj14-3-3单克隆抗体。测定所得抗体效价及特异性鉴定。结果获得大量纯化的表达产物;制备的多克隆抗血清双扩效价达1:8～1:64。获得1株能稳定分泌抗Sj14-3-3单抗的杂交瘤细胞株4D9,单抗亚类为IgG1。此株单抗能与重组Sj14-3-3蛋白发生特异性反应。结论获得了高度敏感、特异的抗Sj14-3-3多克隆抗血清及稳定分泌抗Sj14-3-3单抗的杂交瘤细胞。     

日本血吸虫信号蛋白14-3-3的虫体免疫定位

目的　研究抗重组日本血吸虫信号蛋白1433(rSj1433)单克隆抗体对天然Sjl433的结合活性,观察Sj1433在虫体内的定位。　方法　从阳性钉螺体内逸出尾蚴,感染家兔,分别于感染后15d和42d剖杀,静脉灌注法收集童虫和成虫制备冰冻切片。利用rSj1433单克隆抗体,间接免疫荧光法探讨信号蛋白1433虫体内的分布。　结果　免疫荧光染色结果显示,rSj1433单克隆抗体可特异性地结合天然Sj1433抗原表位,背景清晰,Sj1433广泛分布在雌、雄成虫的皮层、皮下层、肌层和实质层,前三种组织中特异性荧光呈线状分布,实质中特异性荧光弥散;童虫中Sj1433也广泛的分布在皮层、皮下层、肌层和实质层。　结论　免疫荧光染色成功地确定了Sj1433蛋白在成虫和15d童虫体内的分布     

弓形虫信号转导蛋白14-3-3基因的克隆与表达

目的　体外扩增弓形虫RH株信号转导蛋白1433(Toxo1433)基因编码序列,构建原核表达质粒,并表达Toxo1433。　方法　收集、纯化弓形虫RH株速殖子,提取RNA,在设计合成的引物中引入EcoRI和XhoI酶切位点。应用RTPCR扩增Toxo1433基因片段,插入原核表达质粒pET28a中,重组子双酶切、PCR和测序鉴定,转化大肠杆菌BL21并以异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。　结果　从弓形虫RH株RNA中扩增出803bp的Toxo1433基因片段,构建重组质粒pET28a/1433;IPTG诱导,SDSPAGE显示表达产物的大小约30.7kDa,Western印迹鉴定为Toxo1433。　结论　成功地从弓形虫RH株基因组DNA中获取了1433基因,构建了pET28a/Toxo1433重组质粒,并获得高效表达。     

Protein kinase WNK3 regulates the neuronal splicing factor Fox-1

We report an action of the protein kinase WNK3 on the neuronal mRNA splicing factor Fox-1. Fox-1 splices mRNAs encoding proteins important in synaptic transmission and membrane excitation. WNK3, implicated in the control of neuronal excitability through actions on ion transport, binds Fox-1 and inhibits its splicing activity in a kinase activity-dependent manner. Phosphorylation of Fox-1 by WNK3 does not change its RNA binding capacity; instead, WNK3 increases the cytoplasmic localization of Fox-1, thereby suppressing Fox-1–dependent splicing. These findings demonstrate a role of WNK3 in RNA processing. Considering the implication of WNK3 and Fox-1 in disorders of neuronal development such as autism, WNK3 may offer a target for treatment of Fox-1–induced disease.     

Interferon–Inducible Transmembrane Protein 3 (IFITM3) Restricts Rotavirus Infection

Rotavirus (RV) is a non–enveloped icosahedral virus with an 11–segment double–stranded RNA genome, belonging to the family of rotaviruses. RV is one of the pathogens causing diarrhea in infants and young animals, and it induces the production of type I interferons (IFNs), which can trigger antiviral function by inducing the production of interferon–stimulated genes (ISGs). Although IFITM3, an ISG localizing to late endosomes, can limit many viral infections, whether or not it restricts the infection of RV is still unknown. Therefore, we attempted to determine whether IFITM3 also restricts RV infection by using over–expression and knockout cell strains. It was found that IFITM3–expressing cell strains were less susceptible to RV infection, as the replication of RV in over–expressing cells was significantly less than in control group cells. Correspondingly, IFITM3–knockout cells were significantly susceptible compared to the normal cells. Furthermore, the IFN–induced antiviral effect was significantly attenuated in the absence of IFITM3, and IFITM3 delayed RV escape from endosomes in the presence of IFITM3, suggesting that endogenous IFITM3 is of great importance in type I IFN–mediated antiviral responses and may restrict infection by affecting the function of the late endosomal compartment. In conclusion, these data provide the first evidence that IFITM3 limits RV infection in vitro and delays RV escape from late endosomes into the cytoplasm.