人乳头瘤病毒6bL1双顺反子载体的构建及其在哺乳动物细胞内的表达

目的构建尖锐湿疣患者人乳头瘤病毒6b型晚期基因(HPV6b L1)的双顺反子表达载体,并使其在哺乳动物细胞内表达,以期建立含有HPV6b L1的细胞模型.方法表达质粒pEGFP-HPV6bL1经双酶切纯化后与经过相同双酶切的真核表达质粒pIRES2-EGFP连接,酶切鉴定,挑选阳性克隆进行测序.重组质粒pIRES2-HPV6bL1-EGFP转染进小鼠成纤维细胞(NIH3T3),荧光显微镜下观察EGFP蛋白的表达.RT-PCR检测HPV6b L1 mRNA的生成.结果成功构建含HPV6b L1的重组质粒pIRES2-HPV6bL1-EGFP.重组体成功转染进NIH3T3细胞,并用G418筛选.同时荧光倒置显微镜下可观察到细胞内有绿色荧光蛋白的表达.进一步进行RT-PCR,检测到HPV6b L1 mRNA的生成.结论成功构建携带HPV6b L1的重组体pIRES2-HPV6bL1-EGFP并转染入NIH3T3细胞.经荧光倒置显微镜观察及RT-PCR方法检测证明HPV6b L1在NIH3T3细胞内成功表达.     

人乳头瘤病毒6bL1双顺反子载体的构建及其在哺乳动物细胞内的表达

目的构建尖锐湿疣患者人乳头瘤病毒6b型晚期基因(HPV6b L1)的双顺反子表达载体,并使其在哺乳动物细胞内表达,以期建立含有HPV6b L1的细胞模型.方法表达质粒pEGFP-HPV6bL1经双酶切纯化后与经过相同双酶切的真核表达质粒pIRES2-EGFP连接,酶切鉴定,挑选阳性克隆进行测序.重组质粒pIRES2-HPV6bL1-EGFP转染进小鼠成纤维细胞(NIH3T3),荧光显微镜下观察EGFP蛋白的表达.RT-PCR检测HPV6b L1 mRNA的生成.结果成功构建含HPV6b L1的重组质粒pIRES2-HPV6bL1-EGFP.重组体成功转染进NIH3T3细胞,并用G418筛选.同时荧光倒置显微镜下可观察到细胞内有绿色荧光蛋白的表达.进一步进行RT-PCR,检测到HPV6b L1 mRNA的生成.结论成功构建携带HPV6b L1的重组体pIRES2-HPV6bL1-EGFP并转染入NIH3T3细胞.经荧光倒置显微镜观察及RT-PCR方法检测证明HPV6b L1在NIH3T3细胞内成功表达.     

人乳头瘤病毒6bL1双顺反子载体的构建及其在哺乳动物细胞内的表达

目的 构建尖锐湿疣患者人乳头瘤病毒6b型晚期基因（HPV6b L1）的双顺反子表达载体,并使其在哺乳动物细胞内表达,以期建立含有HPV6b L1的细胞模型。方法 表达质粒pEGFP-HPV6bL1经双酶切纯化后与经过相同双酶切的真核表达质粒pIRES2-EGFP连接,酶切鉴定,挑选阳性克隆进行测序。重组质粒pIRES2-HPV6bL1-EGFP转染进小鼠成纤维细胞（NIH3T3）,荧光显微镜下观察EGFP蛋白的表达,RT-PCR检测HPV6b L1 mRNA的生成。结果 成功构建含HPV6b L1的重组质粒pIRES2-HPV6bL1-EGFP。重组体成功转染进NIH3T3细胞,并用G418筛选。同时荧光倒置显微镜下可观察到细胞内有绿色荧光蛋白的表达。进一步进行RT-PCR,检测到HPV6b L1 mRNA的生成。结论 成功构建携带HPV6b L1的重组体pIRES2-HPV6bL1-EGFP并转染入NIH3T3细胞。经荧光倒置显微镜观察及RT-PCR方法检测证明HPV6b L1在NIH3T3细胞内成功表达。     

人乳头瘤病毒6型L1蛋白在原核表达体系中的表达

目的：比较人乳头瘤病毒6型(HPV6)L1序列的变异，并筛选有代表性的分离标本进行重组HPV6 L1蛋白的表达和抗原性检测。方法：根据不同临床特征选择主要致病型HPV6型8个分离标本，扩增L1基因，构建重组测序质粒。分析L1区的氮基酸序列变异状况，选择L1序列变异较大的临床分离标本，通过对HPV6 L1基因的起始和终止端进行基因定点改造，连于表达载体质粒pET32a，在原核表达体系表达重组HPV6 L1蛋白，并进行L1蛋白的抗原性检测结果：HPV6型8个分离标本中有6个分离标本L1区的蛋白质一级结构中分别有1～3个氨基酸发生变异，原核表达重组L1蛋白可与HPV6L1抗体发生特异反应。说明HPV6 L1序列的变异并未影响L1蛋白的抗原性。结论：本临床分离标本可提供发展HPV6 L1蛋白和病毒样颗粒(VLP)疫苗的候选目的基因，并可通过原核表达体系表达重组HPV L1蛋白进行L1蛋白的免疫学分析，以及L1蛋白疫苗的研究。     

人乳头瘤病毒11型E6的原核表达

目的　构建、克隆人乳头瘤病毒 11型 (HPV11)E6蛋白基因 ,并进行表达、纯化和鉴定。方法　用PCR法 ,从尖锐湿疣 (CA)标本中扩增出HPV 11型E6蛋白基因 ,与 pET3 2a载体连接成重组表达质粒pET3 2a/E6;重组质粒转入BL2 1大肠杆菌 ,经诱导表达硫氧还蛋白E6融合蛋白 (Trx E6) ;该蛋白经 3SNTAResin纯化柱纯化 ,SDS PAGE和WesternBlotting检测鉴定。 结果　经酶切及序列分析鉴定 ,重组质粒 pET3 2a/E6成功构建 ,诱导后高表达Trx E6融合蛋白 ,WesternBlotting鉴定证实表达蛋白分子量为 3 60 0 0D的Trx E6融合蛋白。结论　获得高表达、高纯度的HPV11E6蛋白 ,为该蛋白的功能及免疫学分析及CA的疫苗研究打下了基础。     

人乳头瘤病毒L1蛋白在尖锐湿疣组织中的表达

目的 探讨人乳头瘤病毒（HPV）L1蛋白在尖锐湿疣组织中的表达及临床意义。方法 用免疫组化法检测HPV L1蛋白在43例尖锐湿疣患者组织中的表达,并观察CO2激光治疗后的复发率和复发次数。 结果 43份尖锐湿疣标本中,HPV L1蛋白阳性率为83.72%（36/43）。在HPV6/11型、HPV6/11型合并HPV16/18型、HPV16/18型患者中L1蛋白表达阳性率依次降低,差异有统计学意义（?字2 = 17.90,P < 0.01）。随访12周,复发率为69.77%（30/43）,平均复发次数为2.16次。HPV L1蛋白表达强阳性病例的复发率和复发次数依次低于中度阳性、弱阳性和阴性病例的复发率和复发次数,差异均具有统计学意义（χ2值分别为8.02,46.92,P值分别 < 0.05,0.01）。HPV L1蛋白表达程度越强与复发率和平均复发次数越低呈负相关,rs值分别为-0.429,-0.696,P值均 < 0.01。 结论 HPV L1蛋白有可能成为判断尖锐湿疣预后和复发的特异性临床生物指标之一。     

人乳头瘤病毒DNA在角化棘皮瘤中的表达

目的 探讨角化棘皮瘤组织中人乳头瘤病毒（HPV）感染率,及HPV DNA阳性细胞的分布特征。方法 原位杂交方法检测46例KA和34例正常人皮肤石蜡切片组织标本中HPV6/11、16/18、31/33亚型。结果 31例角化棘皮瘤黏膜型HPV DNA阳性,总阳性率67.39%,两种以上HPV混合感染达83.87％（26/31）,各亚型均以游离型为主;阳性信号位于细胞核内或核边缘,阳性细胞多分布于火山口底部棘层的浅中部及其周围唇部,分布形式多为带状、片状或灶状聚集。正常皮肤对照组HPV DNA各亚型检测均阴性。结论 角化棘皮瘤患者HPV6/11、16/18、31/33感染率高于正常人群,且以游离形式存在为主,推测HPV感染在角化棘皮瘤的发病机制中起作用。     

人乳头瘤病毒L1及人端粒酶RNA基因在高危型人乳头瘤病毒阳性子宫颈脱落细胞中的表达

目的:分析高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)阳性患者子宫颈脱落细胞中人乳头瘤病毒L1基因(L1)及人端粒酶RNA基因(h TERC)的表达情况。方法:自就诊于我院和温州医科大学二附院HPHPV阳性者中,选取90例宫颈组织正常者作为A组,选取90例宫颈上皮内瘤变者作为B组,选取90例宫颈癌者作为C组,对比分析三组间L1及h TERC表达情况。结果:三组间L1位点中Cp G-1、Cp G-2及Cp G-3位点的甲基化水平间存在显著差异,均以C组水平最低,以A组水平最高(P<0.05)。三组间h TERC阳性表达率存在显著差异,C组阳性表达率为83.33%最高,A组阳性表达率为26.67%最低(P<0.05)。结论:在HP-HPV阳性者中,以宫颈癌者L1位点中Cp G-1、Cp G-2及Cp G-3位点的甲基化水平及h TERC阳性表达率最高。     

人乳头瘤病毒11型E7蛋白基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的构建人乳头瘤病毒11型(HPV11)E7蛋白基因腺病毒载体,并在真核细胞表达。方法用PCR法,扩增出HPV11E7基因,定向克隆至pENTR-TOPO载体形成重组质粒TOPO-E7。TOPO-E7与腺病毒载体pAD/CMV/V5-DESTTM重组反应,E7基因被重组到腺病毒载体上。该载体经PacI酶切,脂质体法转染人胚肾293A细胞,获得重组腺病毒载体pAD-E7。pAD-E7转染人HaCaT细胞,激光共聚焦显微镜分析E7蛋白表达情况。结果经酶切及序列分析鉴定,重组质粒TOPO-E7成功构建。重组子pAD-E7转染293A细胞后,获得滴度为1.4×107pfu/mL的重组腺病毒载体。该载体转染HaCaT细胞,48h后激光共聚焦显微镜下可见细胞内E7蛋白表达。结论重组腺病毒载体能有效介导HPV11E7基因在真核细胞的表达。     

人乳头瘤病毒及其致病性的研究进展

人乳头瘤病毒(human papillomavirus HPV)是寻常疣、扁平疣、踱疣、尖锐湿疣以及疣状表皮发育不良(EV)、口腔乳头瘤和喉乳头瘤的致病因子。现在,特别是1977年以来,由于新的研究技术的进展,对HPV和它在临床中的作用已有进一步的认识和新的发现。以下就HPV和它在皮肤病学中作用的有关问题综述如下:     

人乳头瘤病毒6b亚型L1重组质粒的构建及免疫原性分析

目的：构建人乳头瘤病毒(HPV)6b亚型L1的重组质粒．并了解其对小鼠的免疫原性。方法：将HPV6b的L1基因插入真核表达载体pcDNA3.1中，构建L1的重组质粒；答定后转染COS-7细胞，并用免疫印迹法进行表达分析；18只BALB/巾雌性小鼠用作重组质粒的免疫原性检测。结果：重组质粒可被内切酶EcoRI和BamHI切开，测序发现插入片段与L1基因一致；转染24h后十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及免疫印迹出现了阳性条带；经PcDNA3.1-HPV6b L1免疫的小鼠可测到L1抗体(滴度为1：100)，IL-4水平明显升高。结论：HPV6b L1的重组质粒构建成功，能在真核细胞内表达，并能有效激发小鼠产生体液免疫和细胞免疫。     

尖锐湿疣患者皮损中HPV的检测分型及HPV6b L1变异分析

目的 探讨温州地区尖锐湿疣（CA）患者人乳头瘤病毒（HPV）感染型别及HPV6基因多态性。 方法 采用基因芯片检测73例CA患者皮损组织HPV 21种基因型的感染率,对所获得的11例患者的HPV6阳性者行HPV6b L1基因测序分析。 结果 73例CA患者标本中检出HPV阳性61例,总的阳性检出率为83.56％。在61例HPV阳性患者,其中单一型别阳性检出率为93.44％,单一型别感染中以HPV11（29.51％）型为主,其次为HPV6 （18.03％）型;混合型感染阳性检出率为6.56％,以HPV6+11型感染为主。此外,CA患者HPV 6b L1基因测序结果表明,6个位点的核苷酸存在多态性,其中810位点A/T变异存在于所有标本,可能为温州地方株突变。结论 HPV11、6型感染为CA的主要致病型别,HPV 6b L1基因存在多处突变。     

Correlation between human papillomavirus (HPV) type and histology of warts

Forty warts from different patients and of different clinical type were examined histologically and virologically. Eight lesions were found to be associated with human papillomavirus type 1 (HPV 1), 15 tumors were induced by HPV 2, HPV 3 was detected 4 times, HPV 4 twice, and HPV 6 eleven times. HPV 3, HPV 4, and HPV 6 induced warts revealed a correlation between histology and virus type. They are characterized by the so called "edematous type clear cells". In HPV 3 associated flat warts pycnotic nuclei were mainly localized in the center of large vacuoles. In genital warts sickle shaped nuclei were pushed to the margin of the vacuolized cells. The histology of HPV 1 and HPV 2 induced warts was more heterogenous. With one exception HPV 1-induced lesions represented typical myrmecia warts, varying in the number and shape of inclusion bodies. HPV 2 associated common warts, however, revealed 3 very distinct histologic features: (1) Inclusion wart typical for HPV 1, (2) Classical common wart with marked condensation of keratohyalin granules, (3) Warts with extreme vacuolization of squamous and granular cells leading to a honeycomb-like picture.     

人乳头瘤病毒6b型早期蛋白E6和E7基因的克隆及表达

目的:从尖锐湿疣(CA)标本中克隆出人乳头瘤病毒6b型(HPV-6b)早期蛋白E6、E7基因,并进行序列分析比对及原核表达,为HPV感染的检测和基因工程疫苗研究奠定基础。方法:用PCR法,从CA标本中扩增HPV-6的E6、E7基因,构建pUCHPV-6E6、pUCHPV-6E7两个重组体,酶切鉴定及测序分析比对。经双酶切与表达载体pGEX-5X-1定向连接,构建pGEX-5X-l重组表达质粒,转入BL21大肠杆菌,IPTG诱导GST融合蛋白表达及Westernblot鉴定。结果:克隆出HPV-6b早期蛋白E6、E7基因,成功构建pUCmHPV-6bE6、pUCmHPV-6bE7重组质粒,克隆获得HPV-6bE6、E7基因与GenBank标准株序列完全相同,经双酶切定向克隆,成功构建重组表达质粒pGEX-5X-lHPV-6bE6和pGEX-5X-lHPV-6bE7,转入BL21大肠杆菌,高效表达GST融合蛋白。结论:本研究克隆出的HPV-6bE6、E7基因与标准株相同,HPV-6bE6、E7GST融合蛋白获得高效表达,为HPV-6bE6、E7基因表达产物的纯化、体外活性以及E6、E7为靶位的基因疫苗研究奠定基础。     

温热对HPV感染皮肤朗格汉斯细胞磷酸肌醇3-激酶活性的影响

目的 探讨不同局部温热条件对HPV感染皮损游走朗格汉斯细胞(LC)磷酸肌醇3激酶(P13-K)活性的影响.方法 利用37℃,42℃,45℃的温热处理培养液中的离体正常皮肤组织和尖锐湿疣皮损,采用荧光实时定量PCR法检测游走至培养液巾纯化的CD1a~+ LC P13-K p85α、p110α mRNA的表达水平.结果 正常人皮肤组织和尖锐湿疣组织游走纯化的CD1a~+ LC中P13-K p85a、p110α mRNA的表达量均随局部温度升高而逐渐减少.正常皮肤组织游走纯化的CD1a~+LC 中P13-K p85a mRNA的相对表达量37℃为1.00±0.00,42℃为0.78±0.13,45℃为0.54±0.17;P13-K p110α mRNA在不同温度的相对表达量分别为1.00±0.00,0.80±0.11,0.61±0.12;不同温度间比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).而尖锐湿疣组织游走纯化的CD1a~+ LC中P13-K p85a mRNA的相对表达量37℃为1.00±0.00,42℃为0.20±0.11,45℃为0.1±0.08;P13-K p110α mRNA的相对表达量分别为1.00±0.00,0.49±0.21,0.09±0.03;不同温度间比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).温热对尖锐湿疣组织游走LC中P13-K活性影响显著高于正常皮肤组织.结论 局部温热可能通过抑制LC P13-K的活性,提高机体免疫应答反应能力,消除HPV感染.     

Sexual behavior, human papillomavirus type 16 (HPV 16) infection, and HPV 16 seropositivity

BACKGROUND: Sexual behaviors have been linked to seropositivity for human papillomavirus (HPV) but not with the magnitude of the seroreactivity. GOALS: The objective of this analysis was to examine the association of sexual behavior, cervical HPV 16 DNA positivity at enrollment (past) and at diagnosis (current), and other potential determinants with the likelihood and magnitude of HPV 16 seropositivity at diagnosis. STUDY DESIGN: With use of stored specimens from an incidence case-control study at Kaiser Permanente (Portland, OR), women were tested for seroreactivity to HPV 16 by enzyme-linked immunosorbent assay with virus-like particles at diagnosis and were tested for past and concurrent cervical HPV 16 DNA positivity with MY09/MY11 L1 consensus primer PCR. Questionnaire data were used to ascertain past sexual behavior. RESULTS: Increased lifetime number of sex partners (P(Trend) < 0.001), past HPV 16 DNA positivity (odds ratio = 6.9; 95% confidence interval = 1.5-31), and a current cytologic diagnosis (P(Trend) < 0.03) were independently associated with HPV 16 seropositivity. Among the seropositive, only lifetime number of sex partners (P(Trend) < 0.001) and past HPV 16 DNA positivity (P = 0.003) were independently associated with mean signal strength (optical density) in an age-adjusted analysis. Women negative for past and concurrent HPV 16 DNA had a significant trend of increasing optical densities associated with greater numbers of lifetime partners (P(Trend) < 0.001). Conversely, the mean signal strength for those women who were ever HPV 16 DNA-positive during the study did not depend on lifetime numbers of sex partners (P(Trend) = 0.36). CONCLUSIONS: HPV 16 seropositivity is a surrogate for past HPV 16 infection. Circulating levels of antibodies to HPV 16 may reflect recent HPV 16 infection or the frequency of past HPV 16 infection.     

人乳头瘤病毒感染对朗格汉斯细胞影响机制的研究进展

人乳头瘤病毒感染时,皮肤朗格汉斯细胞的数量、形态、分布及功能发生一系列改变,尤其功能受损被认为与导致人乳头瘤病毒逃逸宿主免疫、造成持续感染有关.研究提示,人乳头瘤病毒感染时某些细胞因子或蛋白酶等,如前列腺素E2及其主要限速酶、巨噬细胞炎性蛋白3α、转化生长因子-β、上皮细胞钙黏素、胰岛蛋白、肿瘤坏死凶子相关的凋亡诱导配体等的异常表达可能影响朗格汉斯细胞功能活化.但确切机制有待进一步研究证实.

Abstract：

The infection of human hosts with human papillomavirus (HPV) can lead to a series of changes in the number, morphology, distribution and function of cutaneous Langerhans cells. In particular, the functional impairment of Langerhans cells is considered to be associated with the escape of HPV from host immunity and persitent HPV infection. Studies have suggested that the abnormal expression of some cytokines or proteases, such as prostaglandin E2 and its major rate-limiting enzyme, macrophage inflammatory protein 3 alpha, transforming growth factor-beta, E-cadherin, langerin/CD207, tumor necrosis factor-related apoptosisinducing ligand, may affect the activation and function of Langerhans cells. Further studies are required to explore the exact mechanisms.