重组人骨形成蛋白2基因转染大鼠自体骨髓基质细胞成骨能力研究

目的　在构建的SD大鼠骨组织工程模型中,观察以含孔磷酸钙陶瓷为支架的基因转染自体骨髓基质细胞异位骨形成能力。方法　成年雄性SD大鼠20只,全麻及无菌条件下取其左侧股骨及胫骨,将骨髓冲入 75 ml培养瓶中并在常规培养条件下进行体外扩增;5 d后将部分骨髓基质细胞消化并通过LipofectAMINETM2000介导进行重组人骨形成蛋白(rhBMP2)基因转染及G-418连续筛选14 d;再将转染和未转染的自体细胞一同接种于经纤连蛋白表面修饰的含孔磷酸钙陶瓷上继续培养10 d,并将细胞陶瓷复合体对应地种植于大鼠背部皮下及肌肉内。分别于2~20周处死动物,从形态学及组织学角度观察异位骨形成情况。结果　基因转染细胞陶瓷复合体无论种植于皮下或肌肉内均表现明显的异位骨形成能力;其同期骨形成与早期实验中的经诱导骨髓基质细胞陶瓷复合体异位骨形成相似。结论　应用以含孔磷酸钙陶瓷为支架的rhBMP2基因转染自体骨髓基质细胞移植,可获得与诱导分化的自体骨髓基质细胞相同的成骨能力,说明基因转染自体骨髓基质细胞再次植入体内后,可相当于生物反应器,在增殖的同时促进干细胞的分化和成骨潜能。     

骨形成蛋白2基因转染的人牙周膜成纤维细胞的骨诱导作用

目的　建立表达骨形成蛋白2 (BMP-2)的人牙周膜成纤维细胞(HPDLFs),观察其体内成骨作用,为牙周缺损修复基因疗法的建立提供实验依据。方法　采用脂质体载体将人BMP-2噬菌粒表达载体pBK-B2转染至 HPDLFs。利用免疫组化ABC法检测转染细胞内BMP-2蛋白的表达,并于无菌条件下将转染细胞注射于裸鼠股部肌肉内,21 d后取材,苏木精-伊红染色观察肌肉组织内骨形成情况。结果　BMP-2基因转染后HPDLFs内有BMP- 2蛋白的表达。在注射BMP-2基因转染细胞的肌肉组织内可见明显的新骨形成。结论　BMP-2基因成功转入HP- DLFs中并得到有效表达,转染BMP-2基因的HPDLFs能够在体内诱导新骨形成。     

骨形成蛋白-2基因转染NIH3T3细胞诱导成骨的实验研究

目的　探讨骨形成蛋白 - 2 (bonemorphogeneticprotein - 2 ,BMP - 2 )基因转染NIH3T3细胞体内诱导新骨的能力。方法　用脂质体转染法将BMP - 2基因转染至NIH3T3细胞 ,将转染细胞悬液注入裸鼠股四头肌内 ,第 6周取材 ,观察肌肉组织内诱导新骨生成情况。结果　基因转染实验组裸鼠肌肉组织中有类骨组织形成 ,部分区域伴有钙盐沉着 ,未见明显炎症反应。结论　骨形成蛋白 - 2基因转染NIH3T3细胞在裸鼠肌内具有异位诱导成骨作用     

rhBMP-2、胶原和珊瑚复合人工骨在不同种类动物体内异位诱导新骨形成的实验研究

:目的:研究rhBAAP2,胶原,珊瑚复合骨在于同种属动物体内诱导异位成骨的活性。材料与方法:本研究采用肌袋异位成骨的动物模型,通过大体、组织学观察、组织测量等手段,研究珊瑚、型胶原、rhBMP2复合骨在大鼠、兔、狗体内异位诱导新骨形成的特点,珊瑚降解的过程。结果:rhBMP2、珊瑚和胶原复合骨在大鼠、兔、狗体内均可异位诱导骨组织形成,在大鼠体内诱导成骨量大,骨组织成熟程度高,在兔、狗体内成骨量小,成熟程度低。结论:说明rhBMP2、胶原、珊瑚复合骨在不同种属动物体内都具有异位诱导骨组织形成的活性。     

绿色荧光蛋白转基因鼠咀嚼肌肌卫星细胞的分离、体外培养、鉴定及生物学特性的研究

目的探讨绿色荧光蛋白（GFP）转基因鼠咀嚼肌肌卫星细胞体外培养及传代对咀嚼肌肌卫星细胞GFP荧光保持的影响,从而探讨GFP转基因鼠咀嚼肌肌卫星细胞移植入野生型小鼠后是否可以作为追踪细胞转归的有效方法。方法取新生GFP转基因鼠面部咀嚼肌,分离出肌卫星细胞,体外进行原代和传代培养,建立GFP转基因小鼠肌卫星细胞系。通过倒置显微镜观察肌卫星细胞的形态、测定生长曲线等方法观察肌卫星细胞的增殖与分化能力;荧光显微镜观察GFP荧光的保持及表达;免疫细胞化学法对所获得的细胞进行骨骼肌肌动蛋白及结蛋白鉴定;DAPI进行细胞核的标记,检测培养细胞的纯度。结果体外培养的咀嚼肌肌卫星细胞增殖速度快,荧光显微 镜观察发现肌卫星细胞经传代后仍然保持其特有的GFP荧光表达。骨骼肌肌动蛋白单抗及抗结蛋白免疫细胞化学 染色显示体外培养的咀嚼肌肌卫星细胞呈阳性表达。DAPI免疫细胞化学染色显示经分离及培养后肌卫星细胞纯度较高。结论体外培养的GFP转基因鼠咀嚼肌肌卫星细胞有很强的增殖分化能力及良好的GFP荧光表达,能够作为追踪细胞来源及归宿的示踪细胞。     

种植体＋bFGF基因修饰骨髓基质细胞复合Bio-Oss胶原修复犬颌骨缺损的实验研究

目的:(1)观察经bFGF基因转染的犬骨髓基质细胞(BMSC)复合多孔矿化Bio-Oss胶原骨修复下颌骨极限骨缺损的效果.(2)观察骨融合种植体与骨髓来源的成骨细胞及多孔矿化Bio-Oss胶原支架复合体,植入体内后新骨的形成及与种植体的愈合情况.方法:用脂质体转染技术将bFGF基因转入犬BMSC,将转染和未转染细胞分别与Bio-Oss及凝胶复合.杂种犬8只,按植人物不同分为2组:(1)种植体+犬BMSC+凝胶+Bio-Oss胶原材料组;(2)种植体+bFGF基因转染犬BMSC+凝胶+Bio-Oss胶原材料组,修复犬下颌骨极限骨缺损.于术后24周取材,分别行大体、放射线、组织学观察骨缺损的修复情况.结果:(1)种植体+犬BMSC+凝胶+Bio-Oss骨胶原组,基本上由新生骨组织所修复,但骨组织密度稍不均匀,种植体与周嗣骨组织基本上形成骨结合.(2)种植体+bFGF基因转染犬BMSC+凝胶+Bio-Oss胶原材料组:骨缺损区基本由新生成熟的骨组织所修复,骨小梁形成,与种植体骨结合良好.结论:Bio-Oss骨胶原为载体的自体骨髓基质细胞移植能有效地修复骨缺损,是骨组织工程良好的支架材料,并且种植体与组织工程骨能够形成良好的骨结合.     

新型骨组织工程支架复合BMP-2体内异位成骨的研究

目的 评价新型骨组织工程支架聚消旋乳酸与聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸共混物复合rhBMP-2作为组织因子载体的体内异位成骨的能力.方法 在12只成年新西兰兔背部两侧骶棘肌内各制作互不相通的2个肌袋.然后将复合rhBMP-2的材料植入一侧肌袋为实验组,未复合rhBMP-2的材料作为对照组植入另一侧肌袋.术后2、 4、 8周取材行大体标本观察、组织学观察,观察体内异位成骨情况.结果 植入体内8周,实验组见成熟骨组织形成,对照组无骨组织形成.结论 新型骨组织工程支架复合rhBMP-2后植入动物体内有较强的异位成骨能力,是BMP的良好载体.     

rhBMP-2、胶原、珊瑚复合骨诱导骨形成生物活性的实验研究

目的：研究珊瑚、胶原、ｒｈＢＭＯＰ－２复合骨异位诱导新骨形成的活性和载体在体内降解情况。方法：选择珊瑚和１型胶 为ｒｈＢＭＰ－２载体,采用肌袋异位成骨的动物模型,通过大体观察、组织测量等手段,研究复合骨诱导新骨形成的特点、珊瑚降解的过程。结果：ｒｈＢＭＰ－２、珊瑚和胶原复合骨诱导骨组织形成,在一定范围内随作用时间延长新骨形成量持续增加,其中ｒｈＢＭＰ－２、胶原、珊瑚复合骨具有骨引导性和骨诱导性,珊     

兔骨髓基质干细胞自体嚼肌内移植异位成骨实验研究

目的：观察骨髓基质干细胞成骨向分化诱导后植入嚼肌内异位成骨的过程。方法：从兔髂骨分离骨髓基质干细胞,经体外诱导分化,与磷酸三钙／羟基磷灰石（tricalcium phosphate／hydroxyapatite,TCP／HA）支架复合,植入兔自体嚼肌内,形态学、免疫细胞化学、组织学观察其成骨特征。结果：体外培养的兔骨髓基质干细胞性状稳定,经矿化诱导培养的骨髓基质干细胞表现为成骨细胞分化,表达Ⅰ型胶原蛋白,与支架材料复合植入自体嚼肌内可见成熟骨组织形成。结论：利用骨髓基质干细胞为种子细胞植入嚼肌内开展功能性组织工程化颌骨移植方法可行。     

骨形态发生蛋白-2基因转染对舌癌细胞增殖活性的影响

目的 探讨腺病毒介导的人骨形态发生蛋白-2 (BMP-2)基因转染舌癌Tca8113细胞后,对Tca8113细胞形态和增殖活性的影响.方法 分别以感染复数(MOI)为0、50、100的腺病毒为载体的BMP-2基因转染体外培养的舌癌Tca8113细胞.采用荧光倒置显微镜观察转染前后Tca8113细胞形态的变化,Weste...     

骨形态发生蛋白-2与碱性成纤维细胞生长因子在异位和原位成骨中的作用

目的通过骨髓基质细胞（BMSCs）的体外增殖和分化、异位成骨和原位成骨实验来观察骨形态发生蛋白-2（BMP-2）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）在成骨过程中的作用。方法分别用含BMP-2、bFGF和BMP-2+bFGF的培养液体外培养Beagle犬的BMSCs,通过甲基噻唑基四唑（MTT）比色法测定细胞增殖水平,通过测定碱性磷酸酶（ALP）活性观察细胞的分化情况。将BMSCs与多孔磷酸钙（CPC）分别在含BMP-2、bFGF和BMP-2+bFGF的培养液中复合培养,制成复合材料,一部分植入裸鼠皮下,观察异位成骨情况,另一部分植入Beagle犬的种植体周围骨缺损区,经过荧光标记观察原位成骨情况。结果含有BMP-2+bFGF的培养液促进BMSCs增殖和分化的能力最强。异位成骨情况：BMP-2+bFGF组的成骨量较其他组明显增加,其新骨形成百分比为48.79%±11.31%,高于单一BMP-2组（30.71%±10.85%）和bFGF组（27.33%±9.67%）以及对照组（10.65%±6.05%）。原位成骨术后12周,BMP-2+bFGF组的矿化沉积率高于其他组,其差异有统计学意义（P<0.01）。结论在促进成骨方面,BMP-2和bFGF共同作用优于单一因子。     

骨骼肌卫星细胞体外培养及分化为成骨样细胞的实验研究

目的:评估骨骼肌卫星细胞(skeletalmusclesatellitecells,SMSCs)体外分化为成骨样细胞的能力,探讨骨骼肌卫星细胞作为骨组织工程种子细胞的可能性。方法:取新生Wistar大鼠骨骼肌,采用酶消化法分离出SMSCs,体外原代及传代培养,经腺病毒介导的人骨形成蛋白2(Ad-BMP2)基因转染后,行成骨细胞标志物活性的检测及细胞化学染色,并进行细胞体外矿化能力的测定。结果:转染后细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性增强(P<0.01)且组织化学染色呈阳性,骨钙素及I型胶原的免疫细胞化学染色呈阳性,21d后见钙结节形成。结论:体外培养的骨骼肌卫星细胞可以向成骨方向转化,有望成为骨组织工程的种子细胞。     

应用富血小板血浆和骨髓基质细胞构建细胞-膜片及其异位成骨的实验研究

目的：探讨应用富血小板血浆（platelet rich plasma,PRP）和骨髓基质细胞（marrow stromal cells,MSCs）构建细胞-膜片的方法并评价膜片包裹珊瑚支架后的异位成骨能力。方法：将体外培养扩增的兔MSCs悬液与PRP混合,滴加到6孔培养板上,再滴加牛凝血酶溶液,形成凝胶样MSCs／PRP混合物,置于孵箱内培养。第1周用DMEM完全培养液,后2周改用DMEM诱导培养液。用得到的细胞-膜片包裹珊瑚圆片后,植入裸鼠背部皮下,以单纯珊瑚植入作对照。术后4周和8周取材,通过组织学观察,评价其异位成骨情况。结果：细胞-膜片具有一定的韧性和可操作性。扫描电镜观察显示：膜片由大量的纺锤样成骨细胞有规律地密集在一起而形成。组织学观察显示：术后4周和8周,膜-支架复合体珊瑚支架的表面及其孔洞内有大量的软骨或骨形成,以软骨内成骨的方式成骨;单纯珊瑚植入组,珊瑚表面及其孔洞内有大量纤维结缔组织长入,未见软骨或骨形成。结论：用PRP和MSCs构建细胞-膜片的方法简便,膜片包裹珊瑚支架形成的膜一支架复合体具有良好异位成骨能力。     

新型多孔磷酸钙复合骨髓基质干细胞组织工程实验研究

目的观察新型生物材料多孔磷酸钙的生物相容性及复合骨髓基质干细胞（BMSCs）异位成骨情况。方法体外培养第2代Beagle犬BMSCs,转染绿色荧光蛋白（GFP）后与多孔磷酸钙（CPC）复合培养,获得最佳复合浓度,倒置和荧光显微镜、扫描电镜下观察BMSCs黏附和生长情况,复合体植入裸鼠皮下8周观察异位成骨。结果BMSCs转染GFP与多孔CPC复合培养1 d,细胞从材料中爬出,形态正常,7 d可见细胞伸出伪足,分泌基质;复合体可异位成骨。结论多孔CPC生物相容性好,是一种较理想的骨组织工程支架材料。     

可注射性自体组织工程骨的研究

目的　探索在动物体内异位构建可注射性自体组织工程骨的方法。方法　取新西兰兔髂骨的骨髓基质细胞并诱导分化为成骨细胞 ,然后将骨髓基质成骨细胞与 1 5 %藻酸钠溶液混合形成骨髓基质成骨细胞 藻酸钠复合物 ,使细胞的终浓度为 4× 10 9/L。以自体细胞移植方式将骨髓基质成骨细胞 藻酸钠复合物注射于新西兰兔背部皮下 ,用氯化钙固化骨髓基质成骨细胞 藻酸钠复合物。对标本进行X线和组织学观察。结果　注射后 4、8、12周在新西兰兔背部皮下形成硬结节 ,8、12周X线片均显示有明显成骨现象。组织学分析显示标本有大量新骨形成 ,具有骨髓腔样结构。结论应用藻酸钠复合骨髓基质成骨细胞可以通过注射方式在动物体内形成自体骨组织     

纳米羟基磷灰石复合胶原/聚乳酸材料复合兔骨髓基质细胞异位成骨的实验研究

目的：观察nHAC/PLA复合兔BMSCs的异位成骨能力.方法：通过负压吸附使BMSCs与nHAC/PLA材料复合,将nHAC/PLA＋自体BMSCs、自体BMSCs、nHAC/PLA材料分别植入新西兰兔背部肌袋内,术后4、8周通过大体、组织学观察来研究其异位成骨能力.结果：自体BMSCs组与nHAC/PLA材料组在新西兰兔背部肌袋内均无骨质形成,nHAC/PLA＋自体BMSCs组8周时有大量较成熟的骨质形成,同时材料本身部分吸收.结论：通过负压吸附的方法制备出的nHAC/PLA＋自体BMSCs具有良好的异位成骨能力.     

山羊乳牙牙髓干细胞构建组织工程骨的异位成骨研究

目的:评价山羊乳牙牙髓干细胞在体外的成骨分化能力,及复合多孔磷酸钙骨水泥在山羊肌袋模型内的异位成骨能力。方法:采用改良组织块法培养山羊乳牙牙髓干细胞,并且在成骨诱导条件下培养。经成骨条件培养的第3代细胞与多孔磷酸钙骨水泥复合后,植入山羊背部左侧肌袋;将多孔磷酸钙骨水泥空白支架植入右侧肌袋作为对照组。分别在植入后4、8周取材,进行组织学观察。结果:复合山羊乳牙牙髓干细胞的支架材料在4周后有类骨质形成;植入8周后,类骨质形成更多;未复合细胞的支架材料在组织学检查中未见有类骨质形成。结论:山羊乳牙牙髓干细胞在体外具有分化为成骨细胞的能力;多孔磷酸钙复合山羊乳牙牙髓干细胞在山羊体内具有异位成骨能力。     

骨生物衍生材料复合人骨髓间充质干细胞异位成骨的实验研究

目的 探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）复合骨生物衍生材料异位成骨的可行性和成骨能力。方法 将人骨生物衍生材料脱蛋白骨和脱钙骨在体外与人骨髓MSCs复合培养后,植入裸鼠背部左侧皮下。右侧皮下植入单纯生物衍生材料作为对照。于术后2,4,10周各时间点处死动物行大体标本、组织学观察,碱性磷酸酶（ALP）活性检测,比较其成骨能力。结果 两种材料脱蛋白骨和脱钙骨均有异位成骨能力,随着植入时间的延长,新骨形成量逐渐增多,表现为软骨化成骨;对照组无成骨现象。ALP活性检测结果显示实验组随着时间的延长,ALP活性显著升高（P<0.05）,而在相同各时间点比较,脱蛋白骨的ALP活性明显高于脱钙骨（P<0.05）。结论 人骨生物衍生材料脱蛋白骨及脱钙骨和人骨髓MSCs可作为理想的支架材料和种子细胞应用于骨组织工程;且作为支架材料脱蛋白骨优于脱钙骨。