毛钩藤和无柄果钩藤的ITS序列分析研究

目的以核糖体转录间隔区(rDNA ITS)序列为分子标记,对钩藤属的2种常用中药材毛钩藤Uncariahirsute和无柄果钩藤U.sessilifructus进行遗传分析,阐明钩藤属内不同种间的分子系统发育关系。方法通过改良CTAB法对毛钩藤和无柄果钩藤进行总DNA提取,利用通用引物对rDNA ITS序列进行PCR扩增,RFLP分析和序列测定,用PAUP软件进行系统发育分析,构建最大简约树。结果获得毛钩藤和无柄果钩藤的限制性内切酶(MspⅠHaeⅢ)酶切图谱以及rDNA ITS区的完整序列,其序列长度均为718 bp。结论通过基于rDNAITS序列进行RFLP分析、序列测定和系统发育树构建的分子生物学方法,能够对钩藤属植物进行准确的分子鉴定,为钩藤属中药材的种类鉴定和种间的分类地位提供分子生物学依据。     

一种钩藤属植物的分子鉴定

目的:以核糖体转录间隔区(rDNA ITS)序列为分子标记,对1种钩藤属植物归类到种提供分子证据.方法:改良CTAB法提取钩藤植物材料总DNA,通过引物对rDNA ITS区序列进行PCR扩增,经过克隆、测序后,与GenBank中已有的钩藤属植物rDNA ITS区序列进行比对,并应用Clustal X,BioEdit等软件计算分析,用PAUP软件构建系统发育树.结果:测序得到该钩膝植物的rDNA ITS区序列长度为719bp,序列分析结果显示该钩藤植物与Genbank中已有的华钩藤Uncaria sinensis rDNA ITS区序列之间相似性达99.7%,并且在系统发育树中并排聚类成一支.结论:基于rDNA ITS区序列的测序分析和系统发育树构建的分子生物学方法,能够对该钩藤属植物进行准确的分子鉴定,为钩藤属中药材的种类鉴定和种间的分类地位提供分子生物学理论依据.     

大叶钩藤的分子鉴定

目的:以核糖体转录间隔区(rDNA ITS)序列为分子标记,对钩藤属的常用中药材大叶钩藤(Uncariamacrophylla Wall.)进行遗传分析,阐明大叶钩藤的分子系统发育关系。方法:通过改良CTAB法提取大叶钩藤植物总DNA,利用通用引物对rDNA ITS序列进行PCR扩增,经克隆、测序后,运用Clustal X,BioEdit和PAUP等软件进行序列分析和构建系统发育树。结果:测序得到大叶钩藤植物的rDNA ITS区序列长度为718 bp,序列分析结果显示大叶钩藤与Genbank中已有的钩藤属植物相似,在系统发育树中与钩藤属植物Uncaria guianensis(AJ414546)和Unacria africana(AJ414545)聚类成为一枝,又与钩藤属的钩藤(U.rhynchophylla,AJ346900)、华钩藤(U.sinensis,FJ980386)、毛钩藤(U.hirsute,GU937110)和无柄果钩藤(U.sessilifructus,GU937111)并排聚类成一枝。结论:基于rDNA ITS区序列的测序分析和系统发育树构建的分子生物学方法,能够对大叶钩藤进行准确的分子鉴...     

伞形科常用中药品种rDNA序列特征及其标记方法研究

目的:探讨伞形科27种常用中药指纹图谱鉴定的分子特征标记,探索筛选标记方法。方法:扩增伞形科27种植物的rDNA序列,限制性内切酶消化,聚丙烯电泳,其中6个品种测定rDNA序列。结果:PCR获得的rD-NA序列片段包括ITS1、ITS2、5.8S全长序列以及18S、26S部分序列。将PCR产物经限制性内切酶MSPⅠ消化后的电泳图,27个品种出现了16种特征性图谱,其中有11个品种的图谱与其他品种不相同;经限制性内切酶HaeⅢ消化后出现5种特征性图谱,其中有3个品种的图谱不与其他品种相同。6个品种经测序,获得了长度为652~656bp的基因序列。根据rDNA序列构建的相似系统树,限制性内切酶消化电泳图相同的三组品种,序列相似度高。结论:rDNA序列特征是伞形科中药鉴别的有效分子标记,序列测定法优于限制性内切酶切片长度多态性的分子标记方法。     

贵州中药材钩藤属植物的分子鉴定

目的：对来自贵州钩藤原产地类似钩藤的4个中药植物材料的rDNA ITS序列进行分析，并构建了它们的系统发育树，从遗传本质上对这些材料的分类地位和种类鉴定提供分子证据。方法：对4个中药植物材料的rDNA ITS区进行了PCR扩增、测序，运用ClustalX、BioEdit和PAUP^＊ 4．0 beta 10等软件对ITS区序列进行分析。结果：获得rDNA ITS1、ITS2和5．8S rDNA完整序列，以Mitragyna rubrostipulata（AJ492621）和Mitragyna rubrostipulata（AJ605988）为外群，构建这4个类似钩藤的植物材料的系统发育树。结论：研究材料属于药用钩藤属的重要种类，并且是与Uncaria rhynchophylla具有很近亲缘关系的4个相近种类。     

一种特殊虫草与冬虫夏草的表型和DNA条形码特征比较分析及鉴别方法研究

目的：通过对子座和虫体部分进行表型与DNA条形码序列分析,探讨一种发现于四川的特殊冬虫夏草（以下简称特殊虫草）与常见冬虫夏草的区别。方法：体视显微镜观察虫草样品的外部特征;聚合酶链式反应（PCR）扩增得到真菌部位内转录间隔区（ITS）序列和宿主蝙蝠蛾昆虫的细胞色素氧化酶Ⅰ（COⅠ）序列;利用CodonCode Aligner和MEGA软件进行序列分析,建立邻接（NJ）系统进化树;对ITS序列进行限制性内切酶图谱分析,寻找具有鉴别意义的酶切位点,并通过PCR-限制性片段长度多态性（RFLP）鉴别进行验证。结果：特殊虫草与常见冬虫夏草相比,虫体头部的颜色明显不同;子座真菌的ITS序列存在7个差异位点,虫体COⅠ序列存在56个差异位点,基于ITS序列及COⅠ序列的NJ系统进化树分析均显示,两者不能聚为一支;在两者差异区域,冬虫夏草存在1个XhoⅠ的酶切位点,因此其ITS序列的PCR产物可被限制性内切酶XhoⅠ切割为2个片段,特殊虫草不能被XhoⅠ切割,所以酶切前后的PCR产物在琼脂糖凝胶图上没有变化,通过该方法可对两者进行鉴别。结论：发现了一种特殊虫草,其与常见冬虫夏草的真菌子座和宿主蝙蝠蛾...     

甘肃野生秦艽rDNA ITS区序列分析

目的:比较研究甘肃不同地区4种野生秦艽rDNA ITS碱基序列的差异及其规律,寻找秦艽组药材之间的分子鉴别方法。方法:对rDNA ITS区进行了PCR扩增、测序,运用Clustal X,MEGA3等软件对ITS区序列进行分析。结果:不同地区秦艽、麻花秦艽、小秦艽及黄管秦艽的ITS长度为800 bp,ITS1,5.8S和ITS2序列长度分别为290,170,340 bp。根据两者序列以邻接法建立分子系统发生树。结论:ITS序列可以作为野生秦艽分子鉴定的依据。     

分子鉴定技术在中药中的应用

对近些年来兴起的分子鉴定技术进行了分析总结,主要包括随机扩增多态性DNA(RAPD)、扩增性简单序列重复(ISSR)、限制性内切酶切片段长度多态性(RFLP)、扩增限制性内切酶片段长度多态性(AFLP)、单核苷酸多态性(SNP)、DNA条形码序列分析等技术。从中药材真伪鉴定、中药材正品与替代品鉴定、中药材多基原鉴定和遗传多样性、中药材产地鉴别、中药材年限鉴别5个方面对分子鉴定技术在中药中的应用进展进行了归纳总结,阐述了分子鉴定技术存在的一些问题及其未来的发展方向。     

不同来源莲rDNA ITS的PCR扩增、克隆及序列分析

目的：通过分析不同来源莲的ITS序列,为莲的鉴别提供DNA分子标记。方法：利用特异性引物进行PCR扩增和克隆、测序技术对莲的rDNA ITS区间碱基序列进行测定,比较其差异。结果：得到参试的11个莲栽培品种的rDNA的ITS及5.8S rDNA全序列,18S和26S rDNA部分序列,共约750 bp。显示了不同产地、不同栽培品种莲的rDNA ITS的差异。结论：本研究为利用ITS区序列差异,鉴别不同来源的莲提供了依据,此法可用于莲种间及真伪品鉴别。     

钩藤属植物分子鉴定的DNA条形码筛选

目的 应用分子生物学鉴定技术,筛选出应用于鉴定钩藤属物种的最佳DNA条形码,建立快速、准确、便捷的钩藤属植物鉴定方法.方法 从广东、广西等地收集了8个钩藤属物种的叶片、茎枝作为材料,共计44份样品.提取样品总DNA,分别对条形码ITS、matK、psbA-trnH、rbcL、trnL-trnF序列进行扩增、测序、拼接、...     

钩藤中吲哚类生物碱化学成分及药理活性研究进展

钩藤,原名钓藤,入药历史悠久,主要用来治疗风热头痛、头晕目眩、小儿惊厥、高血压等症状.近年来,大量药理实验证明,钩藤中的主要活性成分是吲哚类生物碱.就钩藤中的吲哚类生物碱的化学成分及其药理活性进行系统性综述,为进一步开发利用中药钩藤提供理论依据.     

HPLC测定钩藤药材中钩藤碱、异钩藤碱的含量

目的：用HPLC法建立钩藤药材中钩藤碱（Rhynchophylline）、异钩藤碱（Isorhynchophylline）的含量测定方法,用于钩藤药材的质量控制。方法：色谱柱为Diamonsil C18柱（4.6 mm×250 mm,5μm）,以甲醇：水=65：35（V/V,含0.01mmol/L三乙胺,冰醋酸调PH7.0）为流动相,流速为1.0 ml.min-1,在245nm检测波长下,测定钩藤药材中钩藤碱、异钩藤碱含量。结果：钩藤碱及异钩藤碱的回归方程分别为Y=1.0E＋6x-21142和Y=1.1E＋6x-13566,线性范围分别为0.254～1.524μg和0.216～1.296μg,相关系数分别0.9999和0.9999。结论：本法正确、简便、快速,对于控制和评价钩藤药材的品质有重要意义。     

钩藤中不同成分降压作用的差异

目的：比较钩藤中提取的异钩藤碱、钩藤碱、钩藤总碱及非生物碱部分的降压作用。方法：大鼠麻醉后经颈总动脉插管记录外周血压和经股静脉微量输注实验用药。结果：实验表明钩藤中４种成分的降压强度为异钩藤碱（４２．０％）〉钩藤碱（３２．１％）〉钩藤总碱（２１．３％）〉钩藤非生物碱（１２．４％）。结论：提示钩藤中主要降压成分为异钩藤碱的钩藤碱。     

Monoamine oxidase B (MAO-B) inhibition by active principles from Uncaria rhynchophylla

Attenuation of monoamine oxidase B (MAO-B) activity may provide protection against oxidative neurodegeneration. For this reason, inhibition of MAO-B activity is used as part of the treatment of Parkinson's and Alzheimer's patients. The hook of Uncaria rhynchophylla (Miq.) Jacks. (Rubiaceae) is a traditional Chinese herbal drug that is generally used to treat convulsive disorders. In this study, the fractionation and purification of Uncaria rhynchophylla extracts using a bioguided assay isolated two known compounds, (+)-catechin and (-)-epicatechin. The compounds inhibited MAO-B, as measured by an assay of rat brain MAO-B separated by electrophoresis on a 7.5% native polyacrylamide gel. The IC(50) values of (+)-catechin and (-)-epicatechin were 88.6 and 58.9 microM, respectively, and inhibition occurred in a dose-dependent manner, as measured by the fluorescence method. The Lineweaver-Burk plot revealed K(i) values for (+)-catechin and (-)-epicatechin of 74 and 21 microM, respectively. This suggests that these two compounds, isolated here for the first time from Uncaria rhynchophylla, might be able to protect against neurodegeneration in vitro, and, therefore, the molecular mechanism deserves further study. This finding may also increase interest in the health benefits of Uncaria rhynchophylla.     

钩藤属部分不同种植物药材对正常大鼠血压的影响

目的:观察钩藤属6个不同种药材乙醇提取物对正常大鼠血压的影响。方法:急性降压试验:将大鼠分为正常对照、硝苯地平0.002 g.kg-1以及钩藤、大叶钩藤、侯钩藤、攀茎钩藤、倒挂金钩、北越钩藤乙醇提取物含生药68.4,34.2 g.kg-114组,大鼠十二指肠给药1次,记录给药前及给药后0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 h大鼠颈总动脉血压;慢性降压试验:将大鼠分为正常对照、硝苯地平0.002 g.kg-1以及前述6种药材乙醇提取物34.2,17.1 g.kg-1组,灌胃,每天1次,连续11 d,给药前和给药后第7天和第11天测定大鼠尾动脉血压。以给药后自身血压下降达2.666 kPa以上,同时与对照组比较有显著性差异者为药物降血压有效。结果:钩藤68.4,34.2 g.kg-1给药后0.5 h颈总动脉血压下降达2.666 kPa以上,且与对照组比较有显著性差异(均P<0.01),并维持3 h以上。钩藤34.2 g.kg-1给药后第7,11天,17.1 g.kg-1给药后第11天;大叶钩藤、侯钩藤34.2 g.kg-1给药后第11天,大鼠尾动脉血压下降值达2.666 kPa以上,且与对照组比较有显著性差异(均P<0.01);而攀茎钩藤、倒挂金钩、北越钩藤给药后大鼠颈总动脉、尾动脉血压下降值均未达到2.666 kPa。结论:钩藤、大叶钩藤、侯钩藤能够显著降低正常大鼠血压,攀茎钩藤、倒挂金钩、北越钩藤对正常大鼠血压没有显著影响。     

Anxiolytic effects of the aqueous extract of Uncaria rhynchophylla

The purpose of this study was to characterize the putative anxiolytic-like effects of the aqueous extract of hooks with stem of Uncaria rhynchophylla using the elevated plus maze (EPM) and the hole-board apparatus in rats and mice. Control rats were treated with an equal volume of saline, and positive control rats with buspirone (1 mg/kg). Single or repeated treatments of the aqueous extract of Uncaria rhynchophylla (200 mg/kg/day, p.o.) for 7 days significantly increased the time-spent and entries into open arms of the EPM, and reduced the time-spent and entries into the closed arms versus saline controls (P<0.05). However, no changes in spontaneous locomotor activity or myorelaxant effects were observed versus saline controls. In the hole-board test, repeated treatment with the aqueous extract of Uncaria rhynchophylla (100 or 200 mg/kg/day, p.o.) significantly increased the number of head-dips (P<0.05). In addition, the anxiolytic-like effects of Uncaria rhynchophylla extract as assessed using the EPM test were abolished by WAY 100635 (0.3 mg/kg, i.p.), a 5-HT(1A) receptor antagonist. These results suggest that Uncaria rhynchophylla is an effective anxiolytic agent, and acts via the serotonergic nervous system.     

酸性染料比色法测定钩藤的总生物碱含量

目的：探讨钩藤中总生物碱含量测定的方法。方法：采用酸性染料比色法测定钩藤中总生物碱含量。结果：酸性染料比色法的显色条件为pH3．6缓冲液5．0ml，溴甲酚绿液5．0ml；氯仿萃取三次，每次4．0ml，每次萃取振摇2min，静置5min。钩藤碱在6．018μg-108．324μg范围内呈线性关系，回收率平均值97．19％，RSD=1．34％（n=6）。结果：该方法灵敏度高，准确度好、重现性好。     

3种广西钩藤属药用植物的RAPD多态性分析

目的运用随机扩增多态性技术探索广西钩藤属药用植物的遗传多态性,为其种质鉴定提供依据。方法采用优化的试剂盒提取法提取大叶钩藤、白钩藤、毛钩藤3种植物的总DNA。用经过筛选的18条10个碱基的随机引物进行PCR扩增。结果优化后的试剂盒提取法可有效获取3种钩藤属植物的基因组DNA,18条随机引物扩增得到条带共260条,其中多态性条带231条,多态率达到88.9%,扩增效果好。按UPGMA法进行聚类分析,计算其遗传相似系数,结果显示,5份钩藤供试材料聚为3类。结论 3种广西钩藤属药用植物的聚类结果与其种和地理区域远近一致,与形态学观察可能存在差异。所得RAPD标记可用于钩藤属药用植物的多态性研究,并为今后开发遗传鉴定的分子标记奠定基础。     

离子交换树脂对钩藤总生物碱的纯化工艺

目的: 建立阳离子交换树脂纯化钩藤总生物碱的工艺。方法: 以钩藤总生物碱为研究指标,考察离子交换树脂分离钩藤总生物碱的工艺条件。结果: 选择732型阳离子交换树脂,以1 mL ·min^-1的流速上样,分别用10 BV水,6 BV 80%乙醇洗脱除杂,最后选用1%氨性80%乙醇洗脱得到钩藤总生物碱,含量达到50%。结论: 该方法工艺较简单,总碱含量较高,适合工业化生产。