HCGβ抗肿瘤核酸疫苗的纯化工艺

对HCGβ抗肿瘤核酸疫苗的预处理和层析纯化工艺进行了研究。用碱裂解法对湿菌体进行预处理,当菌体湿重（g）∶悬浮液体积（mL）∶裂解液体积（mL）∶中和液体积（mL）为1∶2∶2∶2,碱裂解时间为8-12 min时,质粒的产量最高,可达32.94 mg/g。用Sepharose 6 FF凝胶过滤层析去除RNA和蛋白质,再用Plasmidselect亲和层析捕获超螺旋质粒DNA,质粒DNA的得率为48.3%。用L-Histidine-agarose亲和层析可从澄清的碱裂解液中一步分离纯化超螺旋质粒DNA,质粒DNA得率为51.62%。经琼脂糖核酸电泳检测,HCGβ抗肿瘤核酸疫苗超螺旋质粒DNA的纯度为100%电泳纯。     

重组大肠杆菌发酵生产核酸疫苗的初步研究

初步摸索大肠杆菌DH 5α生产核酸疫苗的发酵条件。通过均匀试验设计确定,当胰蛋白胨与酵母粉的质量比为1∶1.2,并且磷酸盐的加量较大时菌体的质粒产量较高。在菌体生长刚进入对数生长期时采用指数式流加葡萄糖与采用恒速流加葡萄糖,菌体得率相同,而产物收率前者高于后者。在菌体生长进入平稳期时将温度由37°C升高到42°C,在菌体密度没有改变的情况下,质粒产量得到提高,达到75 m g/L。     

核酸疫苗研究进展

20世纪初以来，众多疫苗相继出现，为全世界挽救了无数的生命。但是，一些传染病和新发的传染病，如流感、丙型肝炎、艾滋病和疯牛病等还没有十分有效的疫苗。这些都证明了传统疫苗能力有限或显得无能为力。1990年Wolff等人将DNA重组表达载体注入小鼠的骨骼肌中，结果意外发现载体上的基因在局部肌细胞内表达，且产生了抗体，这一偶然发现导致核酸疫苗的诞生。     

我国日本血吸虫核酸疫苗的研究进展

血吸虫病 (schistosomiasis)是呈世界性分布的严重危害人类及家畜的寄生虫病,发病率仅次于疟疾(malaria).全世界至少有2亿血吸虫病感染者.该疾病流行区仍有6亿人受其威胁[1],我国是受日本血吸虫病危害最为严重的国家之一,流行株为日本血吸虫中国大陆株(Chinese Mainland Strain),全国血吸虫病流行县(市、区)454个;累计达到血吸虫病传播消灭标准的县(市、区) 265个,2009年度, 我国实有患者36.6万人[2].[作者简介]蒋斌(1970-),男,硕士研究生,副教授.主要研究方向:分子免疫学.     

登革病毒核酸疫苗

由登革病毒 (DengueVirus,DEN)感染引起登革热是一种重要的虫媒病毒病 ,近年来从范围上和程度上都有扩大的趋势。目前世界上还没有有效的治疗药物和有效的抗四个血清型DEN病毒的四价疫苗 ,但随着分子生物学技术的发展和对登革病毒基因组结构、功能的了解日趋深入 ,使得核酸疫苗成为一个新的选择。1　登革病毒的传统疫苗研制现状第一个减毒登革疫苗是 194 4年日本和 194 5年美国两国学者分别用鼠脑传代减毒的办法得到的减毒登革疫苗。到现在登革疫苗的研究已经有 5 0多年的历史 ,但至今仍未有被批准的安全有效的登革疫苗。泰国Mahidol大…     

HIV-1重组病毒和核酸疫苗质粒联合免疫的实验研究

鸡痘病毒 (ＶＶ)基因组容量大 ,严格胞浆内复制 ,免疫原性好 ,自然条件下只感染禽类 ,并且在对哺乳动物细胞产生流产性感染过程中 ,能有效表达并提呈外源抗原。因此 ,作为比ＶＶ使用更安全的活载体 ,以其作载体有着良好的应用前景。核酸疫苗以天然形式提供抗原 ,性质稳定 ,操作简单。近年来的研究结果表明 ,ＨＩＶ 1的重组鸡痘病毒和核酸疫苗都能在不同程度上增强机体的细胞免疫和体液免疫功能 ,诱导产生ＨＩＶ特异的抗体 ,为ＨＩＶ疫苗中之最佳候选。但动物保护实验证明 ,单独应用哪一种疫苗都不能提供有效的免疫保护力 ,说明在实际应用中…     

结核杆菌多价核酸疫苗的构建及其免疫原性的初步研究

目的构建包含结核杆菌3种抗原蛋白Ag85A、ESAT-6和CFP-10真核表达质粒的多价DNA疫苗,并对其在小鼠体内的免疫原性进行初步分析。方法PCR扩增获得结核杆菌ag85 a、esat-6和cfp-10基因片段,分别克隆入真核表达质粒VR1020的BamHⅠ位点构建DNA疫苗,以此多价DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,检测小鼠体内的特异性抗体应答和细胞免疫反应,并与BCG免疫组、质粒VR1020免疫组和生理盐水对照组相比较。结果多价DNA疫苗免疫小鼠后能产生特异性的细胞和体液免疫应答,DNA疫苗免疫组小鼠脾细胞IFN-γ的表达量显著高于BCG免疫组,而DNA疫苗免疫组小鼠所产生的特异性抗体水平低于BCG免疫组。结论成功构建了结核杆菌多价DNA疫苗,免疫小鼠后检测到特异性细胞和体液免疫应答。     

汉坦病毒核酸疫苗研究进展

汉坦病毒引起的疾病是一种人畜共患性疾病，它在世界上有着广泛的流行区域，尤其在我国是除乙肝外的第二大传染病。目前发现汉坦病毒有二十余种血清／基因型，引起人类肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)主要是汉滩病毒(Hantaan Virus，HTNV)、汉城病毒(Seoul Virus，SEOV)、晋马     

结核病DNA疫苗的研究新进展

传统的结核病疫苗是卡介苗（BCG）,虽然可有效预防儿童结核病尤其是结核性脑膜炎的发生,但对成人结核病的预防作用甚微,其在人类中的保护效力在0％～80％之间。发展新的结核病疫苗势在必行。DNA疫苗因其制备简单,使用相对安全,易于储存和运输,免疫效果好,且可在宿主体内长期表达而成为研究的热点。现综述如下。     

Comparative Study on the Immunogenicity between Hsp70 DNA Vaccine and Hsp65 DNA Vaccine in Human Mycobacterium Tuberculosis

There are 3million deaths perannum worldwidedue to tuberculosis,and AIDS is compounding theproblem.A better vaccine than the live mycobacteri-um currently in use,Bacillus Calmette- Guerin( BCG) ,is needed.Mycobacterium heat shock pro-tein ( HSP) can not only enhance the immune re-sponse,but also keep the antigen characteristics ofmycobacterium itself.Our cooperator,Silva fromLowrie group of British National Medical Academy,cloned the mycobacterium Hsp65 gene into a eukary-otic expressi…     

细胞因子IL-18基因对Ag85A DNA疫苗诱导产生抗体水平的影响

目的 :研究表达含白介素 (IL) 18基因的质粒 ,对结核分枝杆菌 (MTB)H37Rv Ag85A基因疫苗诱导免疫应答的影响。方法 :从正常人外周血单核细胞 (PMBCs)中提取RNA ,用RT PCR扩增IL 18cDNA ,并克隆入载体pGEM Teasy中。测序证实后 ,亚克隆真核表达载体pcDNA3.1的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点。将分别表达人IL 18基因的真核表达质粒pcIL18与MTBpcAg85A基因疫苗联合肌注免疫BALB c小鼠 ,共免疫 3次 ,每次间隔 2周。每次免疫后 2周采血 ,分离血清 ,用ELISA检测小鼠血清抗Ag85A抗体的滴度。结果 :用RT PCR成功地从人PMBCs的RNA中扩增IL 18cDNA ,测序结果正确。用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定证实 ,目的基因已插入载体pcDNA3.1中 ,阳性克隆命名为pcIL18。联合应用pcIL18,三次免疫后血清抗Ag85A抗体的滴度明显较单独应用pcAg85A增高。结论 :pcIL18与pcAg85A基因疫苗联合免疫 ,可显著增强Ag85A抗原的特异性体液免疫应答。pcIL18+pcAg85A基因联合免疫是否具有增强Ag85A抗原特异性细胞免疫的作用有待进一步研究     

单纯疱疹病毒I型糖蛋白D核酸疫苗的构建及初步研究

目的构建、制备Ⅰ型单纯疱疹病毒糖蛋白Ｄ重组质粒ＤＮＡ疫苗，初步检测其诱导机体产生体液免疫应答的效果，为研制ＨＳＶ－１新型疫苗奠定基础。方法用ＰＣＲ的方法从ＨＳＶ－１病毒基因组中扩增糖蛋白Ｄ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄ，ｇＤ）基因，利用基因重组技术构建重组质粒；将重组质粒体外转染真核细胞ＣＯＳ－７，Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测表达产物；于ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠后腿胫前肌注射免疫，０、２周各免疫１次，１００μｇ／次。初次免疫后０、２、４、６周眼眶采血，ＥＬＩＳＡ间接法检测抗体。结果重组质粒酶切出相应大小片段，经测序证实为ＨＳＶ－１ｇＤ序列。Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ证实能够在体外真核细胞中表达。免疫小鼠后，产生特异性抗体，抗体滴度１∶２０００。结论ＨＳＶ－１ｇＤ重组质粒ＤＮＡ有可能作为ＨＳＶ－１的ＤＮＡ疫苗，用于防治ＨＳＶ－１感染及其相关疾病。关键词单纯疱疹病毒角膜炎ＤＮＡ疫苗糖蛋白Ｄ     

结核病DNA疫苗的研究进展

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的世界性传染病。我国是世界上结核病发病率最高的22个国家之一,结核病患病人数仅次于印度,位居第二。卡介苗是目前唯一应用于结核的预防性疫苗,但对于成人肺结核的保护效力十分有限,再加上自身的不足以及外界因素的变化,研制新型的结核疫苗迫在眉睫。该文将对结核病传统和新型的单价DNA疫苗的研究进展进行综述。     

结核杆菌检测基因芯片的制备研究

目的　建立结核杆菌检测基因芯片的制备技术。方法　制备和标记靶基因 ,用点样仪将靶基因点于玻片介质上 ,并经点样后处理制成基因芯片 ,用扫描仪测定处理前后芯片上荧光强度的变化 ,计算 DNA固定率 ,同时测定和比较两种不同玻片、不同点样液和三种不同点样后处理方法的 DNA固定率。结果　制备结核杆菌检测基因芯片 ,用醛基修饰玻片作为介质 ,用 DMSO溶液作为点样液 ,点样后芯片处理以水合 1小时再干燥 30分钟为佳。结论　本研究所建立的结核杆菌检测基因芯片制备技术具有较高的效率和可靠的实用性能     

一种简捷的质粒DNA提取及纯化方法

介绍一种快速获取高纯度质粒ＤＮＡ方法,在碱裂解法快速获取质粒ＤＮＡ粗制品的基础上,利用一种不溶解蛋白质而溶解ＤＮＡ的溶液ＴＥＳ纯化质粒ＤＮＡ,同时对本法所提取的质粒的ＤＮＡ的回收率、纯度及可能的用途进行验证。此法简易,所得样品纯度高,可以直接用于转化、酶切和基因克隆。     

全血基因组DNA的提取和纯化方法比较

目的探讨全血基因组DNA的快速纯化方法。方法分别采用表面活性剂裂解法、传统酚抽提法、加热法分别制备DNA，分析各种方法提取DNA的产量、纯度，以及方法本身的优缺点、费用等，同时我们进行RAPD标记实验以比较纯化的DNA在PCR上应用的效果。结果表面活性剂裂解法简单快速，其制备的DNA产率、纯度明显高于传统酚抽提法，但其完整性不如后者。加热法快速制备的全血基因组DNA作为模板虽然纯度差，但仍可用于PCR，并得到满意的检测结果。同一份标本采用不同方法提取的DNA作为模板进行的RAPD标记实验，其多重PCR产物进行分离产生的DNA图谱基本一致。结论3种全血DNA纯化方法均可满足不同的实验要求。     

细菌质粒DNA纯化方法的研究

以HBV DNA的克隆菌E.coli.JM83为出发菌株,对比研究了三种纯化细菌质粒DNA的方法。实验结果表明,CsCl密度梯度超速离心法的得率和产品纯度均佳,但操作繁琐,花费昂贵;Sepharose 4B柱层析纯化法简便快速又勿需专门仪器,缺点是产品纯度不够高;电泳洗脱法的得率虽不及超速离心法,但产品纯度与之相同,由于操作简便,花费大大降低,因而适合普遍采用。