结核分枝杆菌特异性抗原ESXO的重组制备及其免疫原性评估

目的 评估结核分枝杆菌(MTB)重组特异性抗原ESXO在大肠埃希菌中的高效表达,并评价其免疫原性.方法 采用常规分子克隆方法获得MTB重组蛋白ESXO.酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测84份确诊结核病(TB)患者血清和48份健康人血清中相应的抗结核ESXO抗体水平,评价血清学抗原活性,并与结核早期分泌蛋白ESAT-6和CFP-10的检测结果进行比较.结果 重组特异性抗原ESXO在大肠杆菌中获得成功表达,其在E.coli BL 21 plysS (DE3)中以可溶性和包涵体两种形式存在,相对分子质量(27 300)与预期相符,血清学抗原活性评估结果显示其特异度和敏感度分别为94.0％ (45/48)和32.1％(27/84),特异度与ESAT-6和CFP-10相当,敏感度高于ESAT-6.结论 结核特异性抗原ESXO有望成为新的TB诊断与疫苗设计的候选抗原.     

结核分枝杆菌特异性蛋白片段Rv3388和6种特异抗原在结核抗体检测中的应用价值

目的 对结核分枝杆菌( MTB) PE家族的所有成员的结构进行分析,预测其抗原表位,截取Rv3388蛋白的优势抗原片段,对重组Rv3388蛋白及其它6种MTB特异性抗原进行评估,探讨不同结核特异性抗原与血清抗体的反应模式,评价血清学检测在结核病诊断中的价值. 方法 利用基因合成技术重叠延伸PCR扩增Rv3388蛋白637~731位的编码基因片段, 原核表达并纯化重组蛋白pET32a/Rv3388637-731 ,将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA法对该抗血清进行免疫原性分析. 同时对这7种MTB特异性蛋白的特异性及敏感性进行评价. 结果 重组蛋白pET32a/Rv3388637-731在大肠杆菌中的表达量占全菌蛋白的80%,ELISA显示有较强的免疫原性. 7 种 MTB特异性抗原具有不同的反应模式,单个抗原检测敏感性较差. 结论 对MTB PE家族的蛋白结构分析,表达并纯化重组蛋白pET32a/ Rv3388637-731 ,7种蛋白在血清抗体检测中具有抗原互补性,不同抗原与机体反应存在不同反应模式,提高结核抗体检测敏感性应多种抗原联合检测.     

结核分支杆菌14KDa蛋白的基因克隆、表达、纯化及其抗原性的研究

目的基因克隆、表达、纯化结核分枝杆菌14KDa蛋白,研究其抗原性,评价其在血清学诊断中的价值。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增14KDa蛋白基因片断,将其插入到高效表达载体PET-22b（＋）上,构建重组质粒PET-22b（＋）/14KDa,重组质粒在大肠杆菌中由IPTG诱导表达,表达产物经金属离子鳌合亲和层析方法纯化,免疫印迹和酶联免疫吸附（ELISA）试验分析重组蛋白的抗原性。结果构建了具有正确基因序列的14KDa蛋白重组质粒,在大肠杆菌BL21（DE3）中以可溶性蛋白形式表达,重组蛋白的表达量占菌体蛋白的40.8%,经过一步金属离子鳌合亲和层析后得到纯度为94.3%的目的蛋白。免疫印迹试验结果表明该蛋白能与羊抗结核血清发生特异免疫结合反应。应用ELISA方法对结核血清参考品进行检测,敏感性和特异性分别为75.6%和96.0%。结论获得了能高效表达14KDa蛋白的大肠杆菌工程菌,目的蛋白以可溶性形式表达,该重组蛋白具有良好的免疫原性,可望成为结核血清学的诊断抗原之一。     

结核分支杆菌ESAT6蛋白的表达、纯化及抗原性研究

目的：获得重组ESAT6蛋白,研究其免疫学特性,评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法：分别用生理盐水和卡介苗免疫小鼠8周后,以结核分支杆菌接种小鼠。应用基因工程技术表达、纯化ESAT6蛋白,分别以结核分支杆菌PPD或纯化的rESAT6蛋白为抗原,通过ELISA方法及结核病一步法检测小鼠或人血清中抗结核抗体。结果：重组质粒pET24b-ESAT6在大肠杆菌BL2（DE3）细胞内以包涵体形式存在,分子量约6kDa,每100ml培养菌可获得约18mg纯化的重组蛋白。生理盐水和卡介苗免疫小鼠血后血清中抗ESAT6抗体无区别。结论分支杆菌攻击后,两组小鼠血清中抗ESAT6抗体均明显升高,但只有卡介苗组小鼠抗体水平超过平均值＋2标准误。以33例正常人血清的OD值＋2S为正常界限值,33例正常人和32例结核病人血清一步法和PDD、rESAT6 ELISA检测抗结核抗体的特异性和敏感性分别为：一步法87.9%(29/33),65.6%(21/32),PPD93.9%(31/33),62.5%(20/32);rESAT6 97%(32/33),18.2%(4/32)。结论：pET24b-ESAT6大肠杆菌工程菌能以包涵形式高效表达重组ESAT6蛋白,卡介苗免疫对血清中ESAT6抗体无影响,结核病人血清中抗ESAT6抗体阳性率低,rESAT6纯化蛋白可作为结核病血清学诊断的混合抗原之一。     

结核分支杆菌MPT64基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达、纯化和诊断运用

目的利用大肠杆菌表达系统大量获得重组MPT64蛋白,分析其生物学、免疫学特性,并初步评估其在结核病血清学诊断方面的价值.方法用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分支杆菌H37Rv中获得了MPT64基因,并构建大肠杆菌表达株;聚丙烯酰胺凝胶电泳重组蛋白;Western印迹及酶联免疫吸附测定法(ELISA)分析重组蛋白免疫原性,并检测血清的抗结核抗体.结果构建了能表达重组MPT64的大肠杆菌工程菌,表达的重组蛋白蛋白为可溶性形式,表达量占细胞总蛋白的30%,分子量约23kD.经离子交换柱纯化后,重组蛋白纯度达90%以上.Western印迹结果证实该重组蛋白能与抗结核分支杆菌多克隆抗体发生特异免疫结合反应.ELISA分析表明该纯化的重组抗原能区别抗结核抗体阳性患者血清及正常人血清.结论该实验获得了能高效表达MPT64蛋白抗原的大肠杆菌工程菌.纯化的该重组蛋白具有特异的免疫原性,有一定的诊断运用价值.     

重组结核分枝杆菌38KDa蛋白抗原制备及其血清学诊断价值

目的通过基因工程技术获取纯化的结核分枝杆菌重组38KDa蛋白并评价其血清学诊断价值。方法在大肠杆菌中表达38KDa蛋白，通过亲和层析纯化并复性后用于ELISA检测结核患者血清中特异性抗结核抗体。结果38KDa蛋白表达量占总蛋白的22．80％，以包涵体的形式存在。纯化复性后的蛋白抗原检测54例肺结核患者敏感性为62．96％，其中检测痰涂阳性和痰涂阴性患者的敏感性分别为64.29％和62．50％，二者无显著性差异（X^2=0.02，P〉0．05），检测38KDa抗体特异性为84．38％。另外，通过与结核蛋白芯片检测，结果比较发现研制的重组38KDa蛋白免疫活性与国外进口的蛋白免疫活性相当。结论制备的重组38KDa蛋白抗原具有血清学诊断价值，可用于结核病诊断试剂的开发。     

结核分枝杆菌重组Ag85A蛋白的血清学诊断

目的 评价结核分枝杆菌重组Ag85A蛋白为抗原进行结核病血清学诊断的价值.方法 以重组Ag85A蛋白为抗原,通过酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测健康体检者147例和结核患者143例血清中的抗结核抗体;同时以结核杆菌特异性抗体快速检测试剂盒为对照.结果...     

结核分枝杆菌蛋白芯片检测对结核病诊断的价值

目的探讨结核分枝杆菌IgG抗体的检测及其临床应用价值。方法应用蛋白芯片识别仪分析结核病人血清中结核菌蛋白16Kda和38Kda以及脂阿拉伯甘露糖（LAM）抗体含量,同时与ELISA法进行比较,判断其敏感性、特异性和总符合率。结果结核蛋白芯片检测的敏感性和特异性分别为68.96%、81.11%,而ELISA法检测的敏感性和特异性分别为61.81%、85.56%。两者检测的总符率为73.90%,两种方法的敏感性差异具有显著性（χ2=4.1,P〈0.05）。结论结核蛋白芯片检测对肺结核及肺外结核病人具有较好的诊断价值,可作为结核病的血清学辅助诊断之一。     

结核分枝杆菌特异性分泌蛋白的原核表达、纯化和免疫原性分析

目的 构建结核分枝杆菌rv1837c、rv3803c基因原核表达重组质粒,进行表达、纯化,并分析其免疫原性.方法 PCR扩增结核分枝杆菌H37Rv rv1837c、rv3803c基因,并克隆入pTA2质粒.测序正确后,再亚克隆入pET30a(+)质粒,构建pET30a(+):rv1837c、pET30a(+):rv3803c重组体.然后转化入表达宿主大肠杆菌B121(DE3),经0.4 mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导;分别与组氨酸标签单克隆抗体及结核患者血清进行Western blot,鉴定Rv1837c、Rv3803c重组蛋白.经镍离子螫和氮川乙酸-组氨酸标签亲和树脂纯化,将纯化的重组蛋白分别免疫家兔,取兔血清与纯化蛋白通过Western blot方法,检测家兔血清中的抗体.结果 pET30a(+):rv1837c、pET30a(+):rv3803c重组体表达相对分子质量为92000及38 000的重组蛋白,表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中,表达量分别占全菌蛋白质的30%及50%.获得纯度为90%的重组蛋白.纯化蛋白通过Western blot鉴定证实为目的 蛋白,有较强的免疫原性.结论 成功构建原核表达重组质粒pET30a(+):rv1837c、pET30a(+):rv3803c,并获得Rv1837c及Rv3803c重组蛋白,为血清学诊断活动性结核病奠定了基础.     

重组融合蛋白CFP10-ESAT6在结核病血清学诊断中的初步应用

目的探讨结核分枝杆菌重组融合蛋白CFP 10-ESAT 6用于结核病血清学诊断的价值。方法分别用CFP 10-ESAT 6、ESAT 6和PPD检测220例确诊的结核病患者血清、30例非结核病呼吸系统疾病患者血清和50例健康人血清。结果rCFP 10-ESAT 6、rESAT 6和PPD检测的敏感性分别为45%、25%和57%;特异性分别为93%、95%和75%。rCFP 10-ESAT 6的敏感性高于rESAT 6,特异性高于PPD（P〈0.05）。结论rCFP 10-ESAT 6应用于结核病血清学诊断具有较好的敏感性和很高的特异性,对于结核病的诊断有很好的应用价值。     

结核分枝杆菌TB15.3蛋白的原核表达及纯化

目的通过原核表达及亲和层析技术,得到纯化的重组TB15.3蛋白。方法通过PCR从结核分枝杆菌H37Rv菌株的基因组中扩增出TB15.3蛋白的编码基因,再将其连接入PET-30a表达载体中,以E.coli BL21（DE3）菌株为宿主菌通过IPTG诱导表达,并通过亲和层析法纯化目的蛋白。结果通过IPTG诱导后得到目的蛋白,并且目的蛋白以可溶性蛋白形式表达。结论成功得到纯化的目的蛋白,为以后的实验奠定基础。     

重组结核分枝杆菌异柠檬酸裂解酶表达特性的研究

目的通过对所构建的重组结核分枝杆菌异柠檬酸裂解酶表达特性的研究,获取最佳可溶性表达。方法以IPTG诱导重组质粒pET28a（＋）-icl和pET28a（＋）-aceA在大肠杆菌BL21（DE3）和BL21（DE3）plysS细胞表达,筛选最佳诱导浓度、时间和温度。结果以0．25mmol／L和0．1mmol／L的IPTG在25℃诱导8h和6h后可溶性重组ICL蛋白和AceA蛋白的最高含量。结论本研究构建的结核分枝杆菌异柠檬酸裂解酶重组表达质粒,可获得可溶性表达蛋白,为抗结核药物的筛选奠定了基础。     

结核分枝杆菌CFP-10蛋白的克隆及表达

目的通过构建结核分枝杆菌CFP-10蛋白表达载体,在大肠杆菌表达,为探索重组多肽在结核病血清学诊断的应用奠定前期实验基础。方法用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出CFP-10基因片段,连接到表达载体PET30a上,在大肠杆菌中表达;组氨酸标签（His-Tag）镍柱层析纯化重组蛋白。结果构建了含CFP-10重组质粒的大肠杆菌工程菌,发现目的蛋白主要以可溶性蛋白形式存在。结论 CFP-10蛋白基因克隆入宿主菌中并表达成功。     

HIV-1基质蛋白P17的原核表达与纯化

目的 :HIV- 1p17基因在大肠杆菌中高效表达并纯化目的蛋白。方法 :1PCR法扩增的 HIV-1p17基因片段克隆至 p ET2 8c质粒 ;2重组质粒分别在大肠杆菌 BL 2 1、BL 2 1(DE3)、BL 2 1(DE3) plys S及 HMS174 (DE3)中表达 ;3用 Ni- NTA金属树脂层析法纯化目的蛋白 ;4用酶联免疫法和免疫印迹法检测纯化蛋白的特异性。结果 :重组质粒在 BL (DE3)中表达量最高 ,目的蛋白表达量占全菌体裂解物的32 % ,纯化后其纯度达 95% ,纯化蛋白可与 p17Mc Ab和 HIV- 1阳性血清发生特异反应。结论 :带有HIV- 1p17片段的重组质粒 p ET2 8c在大肠杆菌 BL2 1(DE3)中获得高效表达 ,蛋白表达量可满足其免疫、生物活性的进一步研究 ;用 Ni- NTA金属树脂层析法纯化蛋白 ,方法简便 ,蛋白丢失少 ,纯度高 ;纯化的重组蛋白 HIV- 1p17可用来临床早期诊断 HIV- 1感染者 ,同时可预测患者的临床进程。     

结核分枝杆菌Mtb81蛋白的表达及应用研究

目的克隆结核分枝杆菌Mtb81蛋白的编码基因Rv1837c,并在大肠杆菌中表达、纯化,获得重组蛋白Mtb81。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,PCR扩增Rv1837c基因序列,克隆入原核表达载体pET-28a,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌后用IPTG诱导表达,纯化表达产物,获得重组Mtb81。ELISA检测重组Mtb81蛋白的敏感性和特异性。结果重组质粒pETRv1837c测序表明具有正确的编码序列,质粒构建成功,重组蛋白Mtb81在大肠杆菌中以包涵体和可溶性形式稳定表达。以Mtb81为抗原ELISA检测结核病患者血清抗体总敏感性为20.83%,特异性为95.83%。结论结核分枝杆菌Mtb81重组蛋白能在大肠杆菌工程菌种成功表达,为进一步的应用研究奠定基础。     

模式抗原破伤风毒素C蛋白的克隆、表达条件优化及免疫原性初步分析

目的 获得高纯度、高免疫原性的破伤风毒素C片段(TTC)蛋白.方法 以PCR从破伤风杆菌质粒DNA中扩增TTC基因片段,将其插入载体pET43.1a( )并导入大肠杆菌BL21(DE3)plysS中表达.用Ni2 NTA琼脂糖柱纯化融合蛋白,经凝血酶酶切,再用Ni2 -NTA琼脂糖柱分离目的 蛋白.SDS-PAGE和免疫印迹分析目的 蛋白的相对分子质量和抗原性,动物免疫实验鉴定其免疫原性.结果 获得1373 bp的TrC基因片段,构建成重组表达载体pET43.1a( )-TTC并在大肠杆菌中表达.TTC-Nus融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的22％,酶切后TTC蛋白可与载体蛋白有效分离,获得纯度为95.5％的TTC蛋白,该蛋白可被破伤风抗毒素识别;将TTC蛋白免疫小鼠后,免疫血清可与破伤风毒素特异性结合,三次免疫后其抗体效价可达1:25 600.结论 所获TTC蛋白纯度高,免疫原性好,为研究体内外抗原提呈、免疫应答提供了良好的模式抗原.     

重组结核分枝杆菌 MPT64的克隆与表达

目的：克隆和表达结核分枝杆菌抗原 MPT64,并分析其免疫活性。方法：以结核分枝杆菌 H37Rv 基因组 DNA 为模板,PCR 扩增 mpt64基因,克隆至 T 载体 pMD18-T,转化入 E.coli DH5α,菌落 PCR 鉴定阳性克隆并测序分析。将测序正确的 pMD18-T-mpt64的 mpt64基因亚克隆至表达载体 pET-28a,构建重组质粒 pET-28a-mpt64,转化 E.coli BL21中,PCR 和双酶切鉴定阳性重组子,IPTG 诱导 MPT64表达,亲和层析纯化,western-blot 分析其免疫活性。结果：成功构建 pET28a-mpt64重组表达质粒,表达、纯化获得分子量约为26kDa 的 MPT64,并能被结核病人血清识别。结论：克隆表达获得具有免疫活性的重组结核分枝杆菌 MPT64蛋白。     

间日疟原虫MSP1 C重组蛋白的制备及其在血清学诊断中的应用

目的在大肠埃希菌（E，coli）中表达、纯化间日疟原虫裂殖子表面蛋1C端重组蛋白（rGST—PvMSP1C）作为诊断抗原，评价其在间日疟血清学诊断中的应用价值。方法将含有重组质粒pGEX-4T-2／PvMSP1C的工程菌E．coil BL21（DE3）以IPTG进行诱导表达，表达产物以SDS—PAGE与Western—blot免疫印迹进行鉴定；采用GST融合蛋白层析柱进行分离纯化；以纯化重组蛋白包被酶标板，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测间日疟患者血清中的特异性IgG抗体。结果含有重组质粒pGEX-4T-2／PvMSP1C工程菌经IPTG诱导表达的rGST—PvMSP1C重组蛋白大小约63ku，能够被间日疟患者的血清所识别。纯化的重组蛋白SDS—PAGE电泳显示一条预期大小的蛋白条带；以重组蛋白作诊断抗原，67份镜检阳性的间日患者血清标本ELISA均为阳性。55份健康人血清ELISA均为阴性．5份恶性疟患者血清及7份血吸虫患者血清检测结果亦为阴性。结论在大肠埃希菌中表达纯化的间日疟原虫rGST—PvMSP1C蛋白具有免疫反应性，以其作为诊断抗原建立的血清中特异性IgG抗体ELISA检测方法具有良好敏感性和特异性，在间日疟的免疫学诊断中具有一定的推广使用价值。