健脾化瘀方对肝癌bel-7402／5-FU细胞表面耐药蛋白影响的研究

目的初步明确健脾化瘀方对肝癌细胞表面多药耐药蛋白表达的影响,并探讨可能机制。方法选择肝癌细胞bel-7402、肝癌耐药细胞bel-7402／5-FU做为实验细胞,以流式细胞仪（FCM）检测细胞表面P～糖蛋白（P-gP）、MDR相关蛋白（MRPl）的表达率及细胞内罗丹明123（Rho123）的蓄积浓度。以MTT比色法测定不同浓度健脾化瘀方对bel-7402／5-FU细胞增殖的抑制。FCM检测复方作用后bel-7402／5-FU细胞表面P-gP的表达率及Rho123的蓄积浓度。结果bel-7402／5-FU细胞表面P-gP的表达高于亲本bel-7402细胞,细胞内Rho123蓄积浓度低于亲本细胞。健脾化瘀方可显著抑制细胞生长,并呈量效关系。浓度0．5mg·mL。的健脾化瘀方作用bel-7402／5-Fu细胞48h后,细胞表面P-gP的表达率明显下降,细胞内Rho123蓄积浓度升高。结论健脾化瘀方可能具有逆转肝癌耐药细胞多药耐药的作用,途径可能是通过降低P-gP的表达而实现的。     

抑制BCRP表达逆转肝细胞癌MDR的研究

目的：研究小片段RNA干扰对肝癌耐药细胞系HEPG2／ADM中BCRP基因及其蛋白产物BCRP表达的抑制作用和逆转其耐药性的效果。方法：构建针对BCRP基因pSUPER-RNAi质粒,转染肝癌耐药细胞HEPG2／ADM。通过RT-PCR和Western Blot在mRNA和蛋白水平评价RNAi对BCRP表达的影响。MTT法检测RNAi逆转HEPG2／ADM细胞耐药性的效果,按实验组和对照组细胞的半数抑制剂量（IC50）计算RNAi对各种细胞耐药倍数的改变。结果：在耐药肝癌细胞HEPG2／ADM中,RNAi明显抑制了BCRP mRNA和蛋白产物BCRP的表达水平,其表达仅为对照组细胞的22.55％和37.49％（P〈0.01）。在相同浓度化疗药物的作用下,RNAi组HEPG2／ADM细胞耐药性显著下降,对ADM的耐药逆转倍数为3.55倍。结论：针对多药耐药基因BCRP,RNAi具有强大的逆转肝癌耐药细胞HepG2多药耐药的作用,为从基因水平逆转MDR展示了良好的前景。     

黄芩苷体外抑制氟尿嘧啶耐药肝癌细胞的生长及作用机制

目的:观察黄芩苷体外对氟尿嘧啶(Fu)耐药肝癌细胞株生长的影响,并探讨其可能的作用机制.方法:体外培养人肝癌细胞BEL-7402及其耐药细胞BEL-7402/5-Fu,MTT法观察黄芩苷作用后细胞增殖情况;流式细胞术测定细胞内罗丹明123荧光强度;RT-PCR检测细胞多重耐药MDR1基因表达;Western印迹法检测细胞P-gP蛋白表达;应用Matrigel模型测定细胞黏附率;荧光免疫技术测定细胞β1-整合素(β1-integrin)和上皮钙黏附素(E-CD)蛋白表达.结果:黄芩苷明显抑制肝癌细胞BEL-7402及其耐药细胞BEL-7402/5-Fu的增殖,IC50分别为34.2、36.6 mg/L.5、10 mg/L黄芩苷能部分逆转耐药细胞对Fu的耐药,逆转倍数分别为28.6、46.7;5、10 mg/L黄芩苷增强BEL-7402对Fu敏感性,增敏倍数分别为1.4、2.1.5、10 mg/L黄芩苷增加耐药细胞内药物积聚,降低MDR1基因及P-gP蛋白表达,抑制耐药细胞黏附率,降低耐药细胞β1-整合素表达,促进E-CD蛋白表达;且10 mg/L黄芩苷效果优于5 mg/L(P均＜0.05).结论:黄芩苷体外能抑制肝癌细胞生长及降低细胞黏附性,并能部分恢复肝癌耐药细胞对Fu的敏感性,这可能与其增加细胞内药物浓度、抑制MDR1基因表达有关.     

RNA干扰技术沉默MDR1基因逆转大肠癌耐药细胞株LoVo/5-Fu的耐药性

目的  探讨多药耐药（MDR1）基因沉默对大肠癌耐药细胞系LoVo/5-Fu耐药性的逆转作用。方法  构建靶向MDR1的短发夹RNA(EASY-shRNA-MDR1)干扰质粒转染LoVo/5 Fu,实时荧光定量PCR（Realtime-PCR）在mRNA水平检测抑制效果,噻唑蓝（MTT）法检测细胞对5-Fu的敏感性,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果  与未转染组相比,EASY-shRNA-MDR1组细胞MDR1mRNA表达明显下调（P<0.05）;细胞对5-Fu的IC50及RI显著降低（P<0.05）,敏感性的相对逆转率为74.7%;凋亡率明显升高(P<0.05)。结论  EASY-shRNA-MDR1可有效抑制大肠癌耐药细胞中MDR1的表达,进而降低了大肠癌耐药株对5-Fu的耐药性。     

核糖体蛋白S29与人肝癌细胞Bel－7402耐5－氟尿嘧啶的关系

目的：探讨核糖体蛋白S29（ RPS29）与人肝癌细胞Bel－7402耐5－氟尿嘧啶（5－FU ）的关系。方法采用大剂量冲击法和逐渐增加剂量法构建人肝癌Bel－7402／5－FU耐药细胞系；用荧光定量PCR和West－ern blot检测RPS29基因和蛋白在敏感和耐药细胞中的表达；用siRNA干涉耐药细胞的RPS29，CCK－8法检测细胞存活率变化。用肝癌HepG2／5－FU耐药细胞株验证阻断RPS29表达与5－FU耐药的关系。结果 Bel－7402／5－FU耐药细胞对5－FU的IC50为62μmol／L，耐药指数为22．7。 RPS29基因和蛋白在耐药细胞中高表达，分别为敏感细胞的（2．21±0．19）倍和（1．79±0．28）倍（P＜0．01）。干涉RPS29后，耐药细胞在一系列浓度梯度的5－FU作用下存活率分别比对照组下降（15．1±6．5）％、（24．3±4．2）％、（19．2±5．1）％、（16．3±6．8）％（ P ＜0．05）。干涉RPS29表达后，肝癌HepG2／5－FU耐药细胞株在一系列浓度梯度的5－FU作用下存活率分别比对照组下降（8．4±1．2）％、（13．0±2．3）％、（17．1±3．1）％和（12．2±1．5）％（P＜0．05）。结论 RPS29基因和蛋白均在Bel－7402／5－FU耐药细胞高表达；低表达RPS29可提高Bel－7402／5－FU耐药细胞对5－FU的敏感性。低表达RPS29可提高Hep G2／5－FU耐药细胞对5－FU的敏感性。 RPS29与肝癌细胞对5－FU的耐药性有关。     

人肝癌多药耐药细胞系BEL-7402/ADM的建立及耐药相关基因表达检测

目的：建立人肝癌多药耐药细胞系,研究其耐药特性及机制。 方法：应用人肝癌细胞株BEL-7402,采用阿霉素（ADM）大剂量间歇诱导法,建立多药耐药细胞系BEL-7402/ADM。相差显微镜观察细胞,用MTT法检测该耐药细胞株对多种化疗药物的多药耐药性,采用流式细胞术检测该耐药细胞表面多药耐药基因(MDR)的表达产物P糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白(MRP)及谷胱甘肽硫转移系统(GSH／GST)的表达情况,应用RT-PCR检测MDR、MRP基因表达水平。 结果：BEL-7402/ADM对多种抗癌药物产生耐药,对ADM的耐药性(半数抑制浓度,IC₅₀)提高了17.31倍。流式细胞仪分析发现（65.5±5.8）%的BEL-7402/ADM细胞表面P-gp 表达阳性,而对照细胞BEL-7402表达仅为（31.3±4.3）%;（32.4±3.5）%的BEL-7402/ADM细胞表面MRP表达阳性,而对照细胞BEL-7402表达仅为（23.4±3.1）%,二者差异有显著性(P<0.01);BEL-7402/ADM和BEL-7402细胞的GSH／GST表达无明显变化（P>0.05）。RT-PCR检测发现BEL-7402/ADM中MDR及MRP mRNA高表达。 结论：BEL-7402/ADM具有明确的多药耐药性,其多药耐药相关基因MDR及MRP mRNA表达升高。     

靶向MDR1基因siRNA逆转HepG2/ADM细胞耐药性的研究

目的 采用RNA干扰技术逆转人类肝癌细胞系/阿霉素(human hepatocellular liver carcinoma cell line/adriamycin,HepG2/ADM)细胞中多耐药基因,探讨该基因能否有效地抑制多耐药基因(multidrug resistance gene,MDR1)及其编码的糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的表达,并检测对HepG2/ADM耐药表型的逆转效果.方法 采用药物大剂量冲击法建立HepG2/ADM耐药模型,构建靶向MDR1的小干扰RNA表达载体,并转染到HepG2/ADM细胞中,应用半定量逆转录-聚合酶链反应检测基因转染前后MDR1 mRNA表达水平的变化,Western-blot检测各组细胞P-gp蛋白表达的变化,用噻唑蓝法检测各组细胞对阿霉素、顺铂、长春新碱和氟尿嘧啶等药物的敏感性.结果 HepG2/ADM细胞系不仅对阿霉素耐药,而且对其他化疗药也有抗性,呈现多药耐药特性;重组质粒鉴定结果表明针对MDR1的小干扰RNA表达载体成功构建;与对照组比较,转入细胞后MDR1 mRNA水平明显下降,P-gp蛋白表达明显降低;转入细胞后HepG2/ADM细胞对化疗药物的敏感性明显提高,部分逆转其耐药性.结论 靶向MDR1的小干扰RNA可显著抑制HepG2/ADM细胞中MDR1基因和P-gp蛋白的表达,逆转P-gp介导的HepG2/ADM细胞的耐药性.     

靶向抑制肝癌耐药细胞多药耐药基因表达的实验研究

目的：构建含多药耐药基因MDR1的短发夹状RNA（shorthairp in RNA,shRNA）表达质粒,并观察其对肝癌耐药细胞Bel-7402/R的MDR1 mRNA的抑制作用。方法：利用分子克隆技术,将含MDR1的双链DNA,与经双酶切后的载体PGE-1连接,构建pshRNA-MDR1重组质粒,在脂质体的介导下转染肝癌耐药细胞株BEL-7402/R,RT-PCR分析MDR1mRNA的表达,流式细胞仪检测细胞P-gp的表达。结果：PCR和DNA测序证实了表达质粒构建成功,并能明显地抑制MDR1mRNA的表达;P-gp的表达阳性率降低了57.3%,P〈0.05。结论：构建的pshRNA-MDR1表达质粒能靶向抵制肝癌耐药细胞MDR1mRNA和P-gp的表达。     

P15逆转肝癌多药耐药的机制研究

目的：探讨P15逆转肝癌多药耐药（MDR）的可能机制．方法：①采用顺铂（CCDP）诱导法,建立肝癌HepG2细胞动态MDRHepG2／CDDP细胞模型;②在动态MDRHepG2／CDDP细胞模型中,RT—PCR检测P15mRNA的表达,WesternBlot检测P15蛋白的表达;③建立稳定转染P15正义表达载体的HepG2／CDDP—P15细胞系及转染pcDNA3．1（＋）空载体的HepG：／CDDP—PC对照细胞系;④流式细胞仪检测转染细胞HepG2／CDDP—P15,HepG2／CDDP—PC和亲本HepG2／CDDP的细胞周期及阿霉素（ADR）的蓄积和潴留;⑤WesternBlot检测耐药经典分子MRP-1和P-糖蛋白（P—gP）的表达．结果：HepG2／CDDP动态耐药细胞模型建立成功;P15的mRNA表达水平随着HepG2／CDDP耐药细胞株耐药表型的增强逐渐下降;上调p15基因的表达可显著提高HepG2／CDDP耐药细胞株细胞内ADR的蓄积和潴留,促进G1期细胞阻滞,抑制肿瘤细胞增殖,下调MRP-1,P-gP蛋白的表达．结论：P15与肝癌细胞MDR关系密切,其表达水平随着肝癌耐药细胞株耐药表型的增强而逐渐下降;上调P15的表达,可有效逆转肝癌HepG2／CDDP耐药细胞株的耐药表型．     

腺病毒介导p53基因逆转乳腺癌耐药的实验研究

目的探讨腺病毒介导p53基因（Ad-p53）对人乳腺癌阿霉素（ADM）耐药细胞株MCF-7／ADM的耐药性及多药耐药基因1（MDR1）的影响。方法以Ad-p53转染MCF-7／ADM细胞株,流式细胞术检测p53蛋白变化;锥虫蓝活细胞拒染法观察细胞生长情况;MTT法观察MCF-7／ADM细胞对阿霉素耐药性的变化,实时荧光RT—PCR法检测MDR1 mRNA变化。结果流式细胞术观察到MCF-7／ADM细胞经MOI50的Ad-p53作用48h后,p53蛋白表达率由10．24％升高到36．20％;细胞抑制率为7．4％（P=0．003）;逆转MCF-7／ADM对ADM的耐药倍数11．6倍（P=0．001）;实时荧光RT-PCR检测结果显示MDR1 mRNA相对表达量由1．25±0．01下降至0．91±0．01（P=0．011）。结论腺病毒介导p53基因能抑制MCF-7／ADM细胞MDR1基因的表达,并能部分逆转MCF-7／ADM的耐药性,增加阿霉素化疗敏感性。     

人肝癌多药耐药细胞中ERK5的表达

目的 检测人肝癌多药耐药细胞(hepG2/ADM和BEL-7402/5-FU)及亲本细胞(hepG和BEL-7402)中ERK5的表达,探讨其对肝癌细胞多药耐药的影响.方法 MTT法测定人肝癌多药耐药细胞株多种化疗药物的交叉耐药性,实时荧光定量PCR检测ERK5在人肝癌多药耐药细胞及亲本细胞中mRNA水平的表达,western-blotting检测ERK5蛋白水平的表达.结果 hepG2/ADM对ADM、5-FU 、CDDP的耐药指数分别为12.34、5.74、3.81;BEL-7402/ 5-FU对5-FU、VCR、OHP、MTX和ADM的耐药指数分别为15.32、10.08、5.85、6.74和3.26.与亲本细胞相比较,在hepG2/ADM细胞中ERK5 mRNA和蛋白表达均升高,而在BEL-7402/5-FU细胞中ERK5 mRNA表达降低,ERK5蛋白表达升高.结论 ERK5的表达与人肝癌多药耐药的发生密切相关,为逆转治疗肝癌细胞多药耐药研究提供了新思路.     

5-氟尿嘧啶及其与甲酰四氢叶酸合并用药对7402肝癌细胞株N-ras癌基因表达的影响

为了探讨5－氟尿嘧啶（5-Fu）和5-Fu合并甲酰四氢叶酸（FH4）用药对7402肝癌细胞N-ras癌基因表达的影响。采用了异硫氰酸胍法从加有5-FU和5-FU与FH4。合用的7402肝癌细胞中分别提取总RNA，应用缺口平移法，用[α-(32)P]-dATP，dCTP标记N-ras癌基因DNA探针，与各实验组提取的7402肝癌细胞RNA进行斑点杂交。结果显示：单独使用5-FU，杂交斑点明显变小。5-Fu与FH4合并使用，杂交斑点完全消失。表明5-Fu可以明显抑制7402肝癌细胞N-ras癌基因的表达。5-Fu与FH4联合使用，其抑制效果更为明显。实验提示N-rasRNA降低并不是细胞毒作用而是药物对细胞DNA合成抑制的结果。     

人肝癌BEL-7402/5-FU多药耐药细胞株的建立及其生物学特性观察

目的:建立人肝癌BEL-7402/5-FU多药耐药细胞株。方法:采用体外低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击的诱导方法建立5-FU获得性BEL-7402/5-FU多药耐药细胞株。MTT法检测耐药细胞株对多种化疗药物的交叉耐药性。观察其细胞形态学、生长曲线、倍增时间、平板克隆形成率、贴壁率、细胞周期分布、染色体核型以及裸鼠致瘤性。流式细胞术检测阿霉素在亲本及耐药细胞株内的积聚量。免疫细胞化学法检测胸苷酸合酶在耐药细胞内的表达。结果:成功建立人肝癌BEL-7402/5-FU多药耐药细胞株模型。该耐药细胞对阿霉素、长春新碱、奥沙利铂及甲氨蝶呤均有不同程度的交叉耐药性,但对羟基喜树碱仍较敏感。体外培养见细胞趋向群集性生长。耐药细胞株倍增时间较亲本细胞株长,克隆形成率则较亲本细胞株低,差异有统计学意义。耐药细胞贴壁率在23、h明显低于亲本细胞株,其G0/G1期细胞分布比率较低而S期比率明显增加。阿霉素在耐药细胞株内的积聚量低于亲本细胞株,耐药细胞株胸苷酸合酶的蛋白表达量较亲本细胞株明显增强。结论:人肝癌BEL-7402/5-FU多药耐药细胞株可以成为研究5-FU获得性耐药机制及开展多药耐药逆转剂筛选较好的体外模型。     

苦参碱与6种抗肿瘤药联用对KBV200耐药细胞株P-糖蛋白表达的研究

目的探讨6种常用抗肿瘤药物长春新碱、阿霉素、平阳霉素、顺铂、5-Fu、环磷酰胺等与苦参碱联合对KBV200耐药细胞株P-糖蛋白（P-gp）表达的影响。方法以喉癌KBV200耐药细胞株为研究对象，通过流式细胞仪（FCM）检测6种抗肿瘤药物作用于KBV200耐药细胞株后p-Pg表达以及分别联合苦参碱后对p-Pg表达的影响。结果苦参碱分别联合长春新碱、阿霉素作用后，KBV200耐药细胞株P—Pg表达水平下降。结论苦参碱分别与长春新碱和阿霉素联合作用后，可使KBV200耐药细胞株P-pg的表达水平下降，从而逆转其耐药性。     

应用SELDI-TOF-MS技术筛选人肝癌细胞多药耐药相关差异表达蛋白

【目的】通过SELDI-TOF-MS技术筛选体外培养人肝癌细胞多药耐药相关差异表达蛋白。【方法】采用体外培养人肝癌细胞Bel-7402及其耐5-氟尿嘧啶细胞Bel-FU,MTT法检测Bel-FU的多药耐药性;SELDI-TOF-MS技术结合CM-10芯片检测Bel-7402与Bel-FU蛋白质指纹图谱。【结果】细胞Bel-FU对于5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、长春新碱、阿霉素、柔红霉素的耐药指数分别为:89.6倍、3.9倍、37.2倍、16.5倍、3.7倍。在质荷比(M/Z)2 000～50 000的范围内,Bel-FU与Bel-7402间共检测到8个差异蛋白(P<0.05),其中上调蛋白有3个,下调蛋白有5个。【结论】SELDI-TOF-MS技术为筛选肝癌MDR蛋白标志物提供了一个简便、有效的方法。     

shRNA沉默DNA-PKcs表达对肝癌耐药细胞BEL7402/5-FU耐药性的影响

目的观察shDNA-PKcs沉默DNA-PKcs基因对肝癌耐药细胞Bel7402/5-FU耐药性的影响。方法采用双酶切、测序分析鉴定shDNA-PKcs干扰质粒;用阳离子脂质体法将shDNA-PKcs质粒转染BEL7402/5-FU细胞,根据荧光细胞数计算转染率,Real-time PCR及Western blot检测沉默效率;MTT法检测细胞药物敏感性;Real-time PCR和Western blot检测P-gp mRNA和蛋白表达。结果双酶切鉴定结果显示质粒约为6300bp,测序结果显示插入序列为shDNA-PKcs序列。荧光细胞计数显示质粒的转染率为62.2%。Real time PCR及Western blot检测结果显示DNA-PKcs mRNA及蛋白水平的沉默效率分别为82.6%、71.8%;MTT检测结果显示shDNA-PKcs实验组的ADM和5-FU的IC50值比对照组ADM、5-FU低（P〈0.05）,DDP和MMC的IC50值与对照组比无统计学意义（P〉0.05）。Real time PCR和Western blot检测结果显示实验组P-gp mRNA、蛋白表达水平均比对照组低（P〈0.01）。结论 shDNA-PKcs干扰质粒能够有效抑制BEL7402/5-FU细胞中DNA-PKcs表达,增加细胞对化疗药物的敏感性,其机制可能与P-gp蛋白的下调有关。     

三种细胞因子对恶性肿瘤多药耐受影响的实验研究

通过体外转染多药耐受相关蛋白(MRP)基因和化疗药物VP-16、5-Fu诱导的方法分别建立了膀胱癌多药耐受(MDR)细胞亚系EJ／MRP和鼻咽癌MDR亚系LCE／VP、LCE／Fu,并观察了细胞因子rhG-CSF、IFN-αlb和IL2对这些亚系MDR水平的影响。结果发现IFNalb和IL-2可以一定程度地逆转3种MDR细胞对VP-16耐受程度,逆转倍数在3．4与5．2之间,可以增加柔红霉素Dau在MDR细胞内的聚集程度;相反地,rhG-CSF增强了MDR细胞对VP-16的耐受程度和降低了Dau的胞内聚集程度。以上揭示IFNalb、IL-2对P-gp或(和)MRP介导的MDR具有逆转作用,rhG-CSF则增强了P-gp或(和)MRP介导的MDR程度,这为MDR研究和临床癌症治疗提供了一定参考。