人胚胎干细胞培养及其cDNA文库的构建

目的 构建人胚胎干细胞cDNA文库,为筛查疾病抗原基因奠定基础.方法 培养和收集人胚胎干细胞克隆,提取胚胎干细胞总RNA,分离纯化mRNA,利用mRNA作模板反转录合成双链cDNA,双链DNA经pfu-DNA聚合酶将链末端补平,与EcoRⅠ接头连接,XhoⅠ酶切消化产生粘端.用Sepharose CL2B柱分离纯化及除去小分子cDNA片段,与Uni-ZAP XR噬菌体连接,体外转化XL1-blue MRF菌,建成cDNA文库并计算重组效率.对cDNA文库进行扩增,测定扩增文库的滴度.阳性重组子用EcoRⅠ+XhoⅠ双酶切鉴定插入片段的大小.结果 构建成含1.2×106重组子的人胚胎干细胞cDNA文库,重组子插入外源DNA片段长度不小于1000 kb.结论 已成功构建人胚胎干细胞cDNA文库,适合用于筛选目的基因克隆.     

人胃癌混合组织cDNA文库的快速构建和鉴定

目的 :构建人胃癌混合组织cDNA文库 ,筛选克隆胃癌相关基因。方法 :以纯化的 poly(A) + RNA为模板 ,含NotⅠ切点的Oligo (dT) 15为引物 ,利用改良的cDNA快速合成方法 ,反转录合成cDNA第一、二链 ,连接连接子 ,经层析柱纯化去除小片段和多余连接子后 ,重组于噬菌体载体 ,行体外包装后以大肠杆菌Y10 90行滴度测试及扩增后 ,建成cDNA文库。结果 :构建的cDNA文库 ,含 3 2× 10 6重组子 ,重组率为 96 %。扩增后文库的滴度达1 2× 10 12 pfu/L。 结论 :成功地构建了人胃癌混合组织cDNA文库 ,为进一步筛选克隆胃癌的相关癌基因或抑癌基因奠定了基础     

云南个旧肺鳞癌YTMLC细胞cDNA文库构建和鉴定

目的构建云南个旧人肺鳞癌YTMLC-90细胞cDNA文库。方法从培养的人肺鳞癌YTMLC-90细胞株中提取总RNA,利用经修饰的oligo(dr)引物(含S6 ⅠB酶切位点)合成cDNA第一链,同时根据真核生物mRNA5’端帽子结构特点。利用SMART寡核苷酸(含S6 Ⅰ A酶切位点)作为cDNA第一链在mRNA5’端延伸出去的模板,进而以此序列为引物,利用LD-PCR(long-distance PCR)合成双链cDNA,双链cDNA经S6Ⅰ(ⅠA和ⅠB)酶切和过柱分级分离后,克隆入经S6Ⅰ酶切的载体后经体外包装而成cDNA文库。结果人肺癌细胞YTMLC-90的cDNA文库获得1.01×10~6pfu/ml个重组子,重组率为93.2％,文库扩增后,滴度达5.24×10~6pfu/ml,插入cDNA的长度为750～3000bp。结论所构建的cDNA文库具有较好的质量,该文库为进一步筛选、克隆肺癌特异表达基因奠定了基础。     

新疆中麻黄基因组DNA文库的构建

目的:构建新疆中麻黄(EphedraIntermedia)的基因组DNA文库。方法用Sau3AI对所提新疆中麻黄基因组DNA进行酶切,回收15-23Kb之间的酶切产物片段,然后与LambdavectorBamHIArms进行连接、包装形成文库,计算文库重组噬菌体滴度、包装效率。结果,所建文库的重组噬菌体滴度为1×106pfu/ml、包装效率为2×106重组子/μg载体DNA。结论成功构建了基因组DNA文库,为进一步研究奠定了基础。     

人早幼粒细胞cDNA文库的构建及其鉴定

目的：构建人早幼粒细胞HL60的cDNA文库,阐明文库内相关基因在急性早幼粒细胞白血病（APL）发生发展中的相关机制。方法：采用Trizol法提取HL60细胞总RNA,离心柱法分离纯化样本中的mRNA,逆转录PCR法合成cDNA第一链,酶促法直接合成cDNA第二链,胶回收目的长度的cDNA片段后将其与pPR3-N载体连接,通过同源重组方法在酵母Y187菌株中构建人早幼粒细胞cDNA文库。将培养的菌液涂布于LB平板进行库容量鉴定,PCR法鉴定插入片段大小及分布。结果：提取到的HL60细胞RNA条带清晰无降解且弥散度低,以纯化后的细胞mRNA为模板成功合成cDNA,经胶回收cDNA片段后顺利将其与pPR3-N载体连接。将重组载体转化至酵母菌株Y187,通过同源重组方法在菌株中成功构建人早幼粒细胞cDNA文库。在原始电转化菌稀释100倍后取10 μL涂板,共长约250个克隆子,库容量为2.5×10⁶ CFU·mL^-1,转化后原始菌液共计5 mL,总库容量为1.25×10⁷ CFU。文库的插入片段电泳检测,平均插入片段大于1200 bp,阳性率为100%。结论：成功构建人早幼粒细胞的cDNA文库,为白血病的发病机制及治疗机制的研究奠定了基础。     

人胃癌组织定向cDNA文库的构建

目的快速构建成人胃癌组织cDNA文库。方法从人胃癌组织分离总RNA,以含有轴IB酶切位点的oligo（dT）引物合成第1链cDNA,以含蛳IA酶切位点的SMART寡核苷酸为引物经LD-PCR扩增双链cDNA,双链cDNA经sGI（IA＆IB）酶切,以CHROMA SPIN＋TE-1000柱分级分离cDNA,收集符合需要的cDNA片段并纯化,随后将之与λTriplEx2载体连接经体外包装成噬菌体λ文库。结果经检测共获得2．73×10^6个重组子,重组率约为94％,插入片段大小平均为1．2kb。结论用SMART方法构建的胃癌组织cDNA文库质量较高,为以后筛选胃癌相关基因奠定了基础。     

恶性疟原虫基因组文库的构建及未知抗原cDNA片段的筛选

恶性疟原虫FCC1／HN株基因组DNA经Sau3AⅠ部分酶切，取14－23kb片段连接入GEW-11λ噬菌体置换型载体构建基因组文库。所得重组体数目为7.3×104pfu，近达构建完整恶性疟原虫基因组文库理论值的10倍。随机挑取该库10个噬菌斑，抽提λDNA，用XhoⅠ酶切，得到14－23kb的插入片段和载体双臂，符合建库要求．以抗体筛选恶性疟原虫cDNA表达文库所获得的未知抗原cDNA片段为探针，在其中筛选到了阳性克隆，为阐明该未知cDNA对应的基因奠定了基础．