抗SARS冠状病毒单克隆抗体的制备及其体外中和活性鉴定

2002年11月在我国广东省的南部出现了严重急性呼吸综合征(severacuterespiratorysyndrome,SARS)病例,并迅速传播到其他地方。在世界卫生组织(WHO)的统一组织和协调下,通过各国科学家的共同努力,在较短的时间内完成了确定其病原体和控制流行的工作,但许多问题仍有待回答,此次疫情的病原体来自何处,会不会再次暴发流行仍不能确定。本研究的目的是获得该病毒的单克隆抗体,为SARS的早期诊断治疗和病原追踪提供技术支持。1材料和方法1.1病毒株SARS CoV P11病毒株是从确诊SARS患者咽拭子中分离所得[1]。将其感染VeroE6细胞,待80%以上细…     

腺病毒抗独特型单克隆抗体的制备及性质研究

采用了多种免疫方式及一种新的检测方法：用经固定的杂交瘤细胞（Ａｂ１）包被酶标板，加入待测上清孵育后加入只与哺乳类动物抗体Ｆｃ段结合的ＨＲＰ－ＰｒｏｔｅｉｎＡ。共得到了６株分泌抗独特型单抗的杂交瘤细胞。其中两株与Ａｂｌ的结合可被腺病毒抑制，且都能在Ｂａｌｂ／ｃ小鼠诱导出与腺病毒结合的Ａｂ３。因此为Ａｂ２β。     

一株具有中和活性抗rHuIL—4单克隆抗体的制备和鉴定

白细胞介素４（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－４，ＩＬ－４）是１９８２年由Ｈｏｗａｒｄ发现于Ｔ细胞培养上清中、具有促进Ｂ细胞增殖活性的细胞因子，１９８６年基因克隆成功统一命名。成熟人ＩＬ－４分子为糖蛋白，由１２９个氨基酸残基组成，Ｍｒ１５０００，具有广泛的免...     

具有抗凝活性抗人组织因子单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备并鉴定具有抗凝血活性的抗人组织因子(h TF)单克隆抗体(m Ab)。方法以截短型重组h TF243蛋白免疫BALB/c小鼠,细胞融合后,采用间接ELISA联合血浆凝血酶原时间(PT)测定方法,筛选具有抗凝血活性的抗h TF m Ab的杂交瘤细胞株,并进行效价测定和特异性鉴定。结果成功建立1株可稳定分泌具有抗凝血活性的抗h TF m Ab的杂交瘤细胞株,该m Ab属于Ig G1亚型。间接ELISA测定腹水效价为1∶200 000,Western blot、PT测定结果表明,该m Ab可特异性结合重组h TF243,同时与SW620结肠癌细胞表面天然TF作用,显著延长血浆凝血酶原时间,具有良好的抗凝血活性。结论成功制备了具有抗凝血活性的抗h TF m Ab。     

EV71病毒特异性单克隆抗体的筛选及鉴定

目的:筛选高亲和力和高中和活性的抗EV71病毒的单克隆抗体(mAb), 并对其特异性和抗原表位进行鉴定.方法:采用葡萄球菌A蛋白亲和层析法纯化mAb, 并进行抗体的中和效价、交叉反应性以及表位进行分析.结果:筛选出1株抗EV71病毒的mAb, 纯度大于95%, 抗体滴度达到10-7, 对EV71病毒具有广谱中和特性, 与CA16无交叉反应, 为VP1特异性, 并识别EV71的构象型表位.结论:筛选出1株具有高亲和力和中和活性的EV71病毒的mAb, 为研制EV71病毒感染性疾病的诊断试剂提供了重要工具, 并为研制治疗性mAb提供了条件.     

一株中和人IL-17免疫活性的单克隆抗体的制备

目的制备抗人IL-17单克隆抗体,并鉴定其中和活性。方法用hIL-17作为免疫和检测抗原,用间接ELISA法筛选分泌抗人IL-17抗体的杂交瘤细胞株,并对抗体进行中和活性鉴定。结果获得1株稳定分泌抗人IL-17单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的单抗类型重链为IgG2b,轻链为κ;该株杂交瘤细胞腹水效价为1∶8.192×105;传30代及液氮中保存6个月,抗体效价稳定;Western Blot检测证明该单抗与人IL-17蛋白特异地结合;单抗亲和常数为8.192×10-9 mol/L;ELISA及Real-time-PCR检测证明该单抗能够有效地阻断人IL-17刺激Hela细胞产生IL-6的作用。结论所制备的抗人IL-17单克隆抗体具有高度的特异性、稳定性及中和活性,为针对IL-17为靶点的抗体药物的开发奠定了基础。     

用于构建抗人TNF嵌合抗体的鼠单克隆抗体中和活性的鉴定

目的:筛选构建抗人TNF嵌合抗体所需高质量的鼠源性mAb。方法:从一组分泌抗人TNF mAb杂交瘤细胞中,挑取3株D2、E6和F6,按常规方法制备腹水。用饱和硫酸铵盐析后,分别用蛋白A亲和层析和QFF阴离子交换层析法,纯化D2株分泌的mAb(IgG2b)和E6和F6株分泌的mAb(均为IgGl)。纯化前后,3株mAb的效价,采用间接ELISA法测定。纯化的3株mAb的中和活性,通过它们对TNF诱导的L929细胞死亡和上调ECV304细胞上ICAM-1表达的抑制作用来进行鉴定。结果:间接ELISA检测表明,3株mAb D2、E6和F6纯化前的效价分别为1×10-6、1×10-7和1×10-7,纯化后效价分别为0.01、0.002和0.002 mg/L。mAb中和活性的检测表明,浓度为0.16、0.40和0.50 mg/L的D2、E6和F6,可保护2×104U/L TNF诱导的L929细胞半数不发生死亡。1.0 mg/L的mAb D2、E6和F6,对2×105U/L TNF使ECV304细胞上ICAM-1表达上调的抑制率,分别为70.1％、60.1％和60.1％;3株mAb的浓度降到0.1 mg/L时,抑制率仍可达到60.1％、53.7％和59.0％。结论:所选3株mAb的效价及中和活性均较高,可作为抗人TNF嵌合抗体的候选mAb。     

空斑法筛选具有中和活性的抗衣原体粘连蛋白McAb

本研究制备了抗１８ｋＤａ粘连蛋白的单克隆抗体，并证实在不同血清型之间，甚至不同种衣原体之间１８ｋＤａ粘连蛋白具有一定的共同抗原表位。我们建立的空斑形成试验和单克隆抗体空斑减少中和试验，实验结果明显、客观，易于判定，稳定性好。用此筛选出县有中和活性的２Ｂ９ＭｃＡｂ。该ＭｃＡｂ不同于目前已报道的ＭｃＡｂ，其中和活性不依赖于补体，而可能是抑制衣原体的粘附。     

抗人DcR3单克隆抗体的制备、鉴定及应用

目的 制备抗DcR3单克隆抗体(mAb),鉴定其生物学特性,并应用于ELISA、Western blot、How cytometry(FCM)检测.方法 以纯化的可溶性DcR3(sDcR3)免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗DcR3 mAb.用Ig亚类EHSA试剂盒鉴定抗DcR3mAb的亚类.用ELISA方法测定抗DcR3 mAb与sDcR3结合的特性,SDS-PAGE鉴定抗DcR3 mAb与SW480细胞上清中DcR3结合的特性,以鉴定mAb的特性.用间接ELISA法检测腹水mAb的效价、亲和常数并进行表位分析.Western blot检测mAb的特异性及应用,并用所获抗DcR3单克隆抗体(mAb)通过流式细胞仪检测肿瘤细胞表面DcR3的表达水平.结果 获得4株可分泌DcR3 mAb的杂交瘤细胞系ZZ-393、ZZ-394、ZZ-151和ZZ-268.其中DcR3 mAb ZZ-268(下文简称为ZZ-268)的Ig亚类为IgGl(k型);腹水效价为1×10-5;亲和常数为1.28×109水平;ZZ-268和ZZ-151可识别与其他2种抗体小同的抗原表位;Westem blot证实,获得的ZZ-268可特异性地识别DcR3;通过流式细胞术可敏感地检测到不同肿瘤细胞表面DcR3的表达水平.结论 获得4株抗DcR3的mAb,其中ZZ-268效价高、特异性强,将此抗体用于膜DcR3与sDcR3的检测分析.     

抗人白细胞介素15单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的 :制备鼠抗人白细胞介素 15(hIL 15)单克隆抗体 (mAb) ,并鉴定其特性。方法 :自重组人白细胞介素 15(rhIL 15)基因工程菌中 ,提取融合蛋白GST IL 15,以 12 0g/LSDS PAGE分离鉴定 ,切取含有目的条带的凝胶 ,免疫BALB/c小鼠。取免疫小鼠的脾细胞与Sp2 / 0骨髓瘤细胞常规融合 ,依次进行HAT选择培养 ,间接ELISA法筛选抗体阳性的杂交瘤细胞及克隆化。对杂交瘤细胞株的稳定性及其分泌的mAb的特性进行鉴定。另外 ,以rhIL 15包涵体蛋白 (rhIL 15IBP)免疫新西兰白兔 ,制备抗hIL 15的多克隆抗体 (多抗 )。用抗hIL 15的mAb与多抗建立双抗体夹心间接ELISA。结果 :获得 1株可稳定分泌特异性抗hIL 15mAb的杂交瘤细胞。建立了双抗体夹心间接ELISA ,检测rhIL 15蛋白的敏感性达 10 μg/L。结论 :成功地制备抗hIL 15mAb ,并建立了一种可用于hIL 15检测的双抗体夹心间接ELISA。     

诱导细胞凋亡的抗hDR5单抗的研究

目的 研制能诱导肿瘤细胞凋亡的抗人DR5单克隆抗体（McAb）。方法 以可溶性人死亡受体（death receptor，DR）5胞外段免疫小鼠，采用杂交瘤技术制备抗人DR5的McAb；MTT方法筛选分泌有细胞毒活性McAb的杂交瘤细胞；亲和层析方法纯化McAb；夹心ELISA法测定McAb亚型；Western blot和斑点ELISA法检测McAb的抗原表位类型；间接ELISA法检测McAb的特异性；流式细胞仪检测FITC-annexinⅤ／PI双色标记的Jurkat细胞的凋亡率；DNA琼脂糖凝胶电泳测定凋亡细胞的DNA片段化。结果 获得1株杂交瘤细胞，其分泌的McAb命名为mDRA-6，为IgG1；其抗原表位类型为构象表位；其特异性识别hDR5，与hFas、hDR4等无交叉反应。mDRA-6对Jurkat细胞具有细胞毒作用；经McAb mDRA-6处理后，Jurkat细胞膜表面高表达丝氨酸磷脂，并导致Jurkat细胞中的DNA片段化。结论 mDRA-6是一个具有诱导细胞凋亡活性的新的抗人DR5功能性抗体，在以TRAIL／DR5系统进行肿瘤治疗和探讨DR5的功能结构域研究方面具有广泛应用前景。     

抗CTLA-4嵌合抗体的制备及生物学活性鉴定

制备新型抗CTLA-4人鼠嵌合抗体并进行活性鉴定。通过杂交瘤技术获得高亲和力小鼠抗人CTLA-4单克隆抗体22G11和16C11;利用分子克隆技术将鼠源抗体可变区基因与人源抗体恒定区拼接后,最终通过CHO-K1工程株细胞表达高亲和力抗CTLA-4嵌合抗体。经SDS-PAGE电泳显示最终获得了纯度高于90%的CTLA-4嵌合抗体c22G11和c16C11,抗原结合活性结果表明两株嵌合抗体都能很好地与Jurkat细胞结合,竞争抑制实验表明它们都能与各自对应的鼠源抗体竞争。据此,本实验获得了两株抗人CTLA-4胞外区的高亲和力和特异性嵌合抗体。     

一株识别CD83单克隆抗体的研制及其生物学特性鉴定

目的:鼠抗人CD83功能性单克隆抗体(mAb)的研制及其生物学特性的鉴定.方法:以人CD83转基因细胞L929/CD83为免疫原,常规免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠;采用B淋巴细胞融合技术,将免疫小鼠脾脏细胞与Sp2/0融合,以L929/CD83、293/CD83转基因细胞为抗体筛选阳性细胞,经免疫荧光标记分析对杂交瘤进行反复筛选和多次的克隆化培养;采用Ig类和亚类快速定性试纸法、染色体核型分析、竞争结合抑制试验、间接免疫荧光法、Western blot对mAb的生物学特性进行鉴定.结果:获得1株稳定分泌鼠抗人CD83mAb的杂交瘤细胞株(命名为9D8),该mAb能特异性地识别成熟的DC、活化的T细胞及肿瘤细胞株Daudi、8226表达的CD83分子,该mAb识别的位点不同于商品化抗人CD83mAb(HB15e).结论:成功地研制1株鼠抗人CD83mAb,识别位点与HB15e不同,为更好地研究该分子的功能提供良好的物质基础.     

一株识别肿瘤细胞上CD40突变体分子的单克隆抗体的研制及其生物学功能研究

目的:以本科室发现肿瘤细胞上表达的CD40 787AA突变为基础,研制识别肿瘤细胞上CD40突变体分子的单克隆抗体(mAb),并对其生物学特性作初步分析.方法:以转人CD40突变体转基因细胞L929-CD40mu为免疫原,免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠;采用B淋巴细胞融合技术,将免疫小鼠脾脏细胞与Sp2/0融合,以L929-CD40mu转基因细胞为抗体筛选阳性细胞,免疫荧光标记法对杂交瘤进行反复筛选和多次的克隆化培养;采用快速定性试纸法及竞争抑制结合试验分析该mAb的亚类及抗原识别位点;免疫印迹法对该mAb进行鉴定;采用MTT法分析mAb在体外对肿瘤细胞的抑制增殖效应以及PI-annexin V方法进行细胞凋亡测定.结果:获得1株稳定分泌鼠抗人CD40mu mAb的杂交瘤细胞株(命名为10C5),该mAb能特异性地识别人肿瘤细胞株H08910表达的CD40突变体分子,而不识别正常扁桃体B淋巴细胞及血管内皮细胞表达的CD40分子,并且能够在体外促进肿瘤细胞凋亡.结论:成功地研制出1株特异性识别肿瘤细胞上CD40突变体分子的mAb,该mAb具有体外抑制肿瘤细胞生长并促进其凋亡的作用.     

抗人Toll样受体4单克隆抗体的制备及其生物活性研究

目的运用单克隆抗体技术制备抗人Toll样受体4(TLR4)单克隆抗体(mhTLR4抗体),并鉴定其生物学活性。方法以重组人TLR4(rhTLR4)作为抗原,腹腔注射免疫Balb/c小鼠。分离小鼠脾脏B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合并培养,挑选阳性杂交瘤细胞,扩大培养,制备和鉴定mhTLR4其生物学效应。结果经3次免疫后的小鼠血清中抗rhTLR4抗体的效价具有较高水平的表达。1∶500的小鼠免疫血清可明显抑制人PBMC的TNF-α表达。分离小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合,获得3株阳性单克隆杂交瘤细胞。其中2株经过增殖培养、纯化浓缩制备出较高产量的鼠抗人TLR4单克隆抗体。生物学活性测定表明,产生的抗rhTLR4单克隆抗体,能够明显地阻断脂多糖(LPS)诱导的人PBMC细胞对TNF-α的表达。结论本文制备的鼠抗人TLR4单克隆抗体,经鉴定具有较高的阻断内毒素信号传导的效应。为进一步研制人源化抗TLR4抗体、研制新一代抗内毒素靶向药物奠定了基础。     

一株鼠抗人TLT-2单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定

为了制备鼠抗人TLT-2单克隆抗体(mAb)并对其生物学特性进行初步的研究。以TLT-2基因转染细胞株免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备鼠抗人TLT-2 mAb,收集腹水,并用ProteinG亲和层析法纯化。以流式细胞术、IP和Western blot等方法鉴定该单抗的特异性。并通过流式细胞术、CCK8和ELISA等方法对单抗的生物学特性进行了初步分析。结果:获得一株持续稳定分泌鼠抗人TLT-2 mAb的杂交瘤细胞株,命名为8C10。杂交瘤细胞分泌的mAb的Ig亚类(型)为IgG1(κ)。IP和Western blot分析证明,8C10能特异性识别人TLT-2分子。经8C10荧光染色后流式细胞术的结果表明:TLT-2在T细胞表面呈弱阳性表达,在单核细胞和B细胞表面呈强阳性表达。细胞增殖实验结果显示,该mAb对T细胞的增殖有抑制作用。提示,成功获得了一株特异性鼠抗人TLT-2 mAb,该mAb对T细胞体外增殖及其细胞因子IFN-γ、IL-2、和IL-10的分泌均有明显的抑制作用。     

抗人BPI23单克隆抗体的制备和鉴定

目的 采用杂交瘤技术制备抗人BPI23单克隆抗体,并对其应用进行初步分析。方法 免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞按常规方法融合;用间接ELISA法和Western - blot筛选分泌抗体的杂交瘤细胞株;阳性克隆用有限稀释法亚克隆3次获得稳定分泌抗人BPI23单克隆抗体的杂交瘤细胞株;扩增杂交瘤细胞注入小鼠腹腔后制备腹水;纯化腹水中的单抗并对抗体类型进行鉴定;用Western-blot分析抗体的特异性;用间接ELISA法测抗体效价;将分离纯化的正常人外周血中性粒细胞和单个核细胞制成涂片,用抗人BPI23单克隆抗体进行免疫染色。结果 获得3个（1B4、9C12和2H11）稳定分泌抗人BPI23单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的单抗类型分别为κ型IgM、κ型IgG1和κ型IgG1;抗体效价分别为1.28×105、1.28×105和4.1×106,纯化后抗体含量分别为0.208g/L、2.03g/L和3.88g/L;3种纯化抗体均能与本实验制备的人BPI23和市售人BPI55标准品特异性结合,而不能与小鼠BPI25和人LBP结合;在免疫组化实验中,1B4、9C12和2H11单抗均能与人中性粒细胞中的BPI特异性结合。结论 成功制备了人BPI23特异性单克隆抗体,为BPI检测试剂盒的研制奠定了基础。     

氨甲酰磷酸合成酶单克隆抗体的制备、鉴定及应用

目的:制备抗人氨甲酰磷酸合成酶(CPSI)的单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定与应用.方法:将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体,用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备 mAb,并通过间接ELISA法、Western blot、免疫组化及免疫荧光染色的方法对mAb进行特性鉴定,通过免疫沉淀联合质谱、Uni-ZAP XR表达文库筛选鉴定抗原,借助免疫捕获的方法用抗体来分离复合物.结果:获得3株可稳定分泌抗人CPSI mAb的杂交瘤细胞系.mAb的Ig亚类(型)为IgGl(K),该mAb可用于ELISA检测、Western blot、免疫组化、免疫荧光染色、免疫沉淀实验和复合物的分离.结论:成功制备了抗人CPSI的mAb,为CPSI的研究提供了有力的工具.     

抗人整合素β3亚基单克隆抗体的制备及其抗肿瘤活性的研究

目的制备抗人整合素β3亚基的单克隆抗体(mAb),研究其对肿瘤治疗的作用。方法用RT-PCR方法扩增人β3胞膜外基因,将其克隆至原核表达载体pQE30中,获得含β3胞膜外基因的高效表达载体pQE30-β3,将其转化大肠杆菌M15,通过诱导表达及纯化,获得β3蛋白。将此蛋白免疫BALB/c小鼠,应用B淋巴细胞杂交瘤技术制备抗β3亚基mAb,Western blot鉴定mAb的特异性。通过小鼠体内抑制黑色素瘤生长实验筛选出具有抑制肿瘤生长作用的mAb。进一步用MTT法及流式细胞术观察该mAb体外抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖及诱导其凋亡的作用。结果扩增获得了β3胞膜外基因,构建了β3蛋白的原核表达载体,表达纯化了β3蛋白,成功制备了8株mAb,Western blot证明了其特异性。经过体内抑瘤实验筛选出一株具有显著抑制肿瘤生长的mAb4F12。该mAb可抑制HUVEC细胞增殖并诱导其凋亡。结论成功表达了β3蛋白,并制备了有活性的mAb,抗体具有抑制肿瘤生长的作用,这可能是通过抑制血管内皮细胞的增殖和诱发凋亡实现的。