CGRP对人骨髓间充质干细胞增殖影响的研究

目的探讨外源性重组人降钙素基因相关肽（hCGRP）对人源性骨髓间充质干细胞（human mesenchymal stem cells,hMSCs）的增殖的影响,进而探索CGRP促进成骨的作用机制。方法采用梯度离心法和选择性培养基分离、纯化骨髓间充质干细胞,培养体系中添加不同浓度CGRP。于传代第三代进行细胞鉴定,光镜下观察细胞形态、MTT法检测细胞增殖能力、流式细胞仪测定细胞周期,以观察CGRP对MSCs增殖能力的影响。结果CGRP对MSCs增殖形态无明显影响,MTT示CGRP组细胞增殖速率快于对照组,流式细胞仪检测示CGRP组的MSCs的G2/G1期比例明显升高。结论CGRP对MSCs的增殖有直接促进作用,从而有利于骨形成。     

人骨髓间充质干细胞表面CGRP受体存在的研究

目的寻找CGRP受体在MSCs表面存在与否的证据。方法采用梯度离心法和选择性培养基分离、纯化骨髓间充质干细胞,根据分组,培养体系中添加CGRP、CGRP（8-37）。于传代第三代,MTT法检测细胞增殖能力,RT-PCR检测细胞mRNA表达,Western blot检测细胞蛋白表达,以证实MSCs表面是否存在CGRP受体。结果CGRP受体特异性拮抗剂能阻断CGRP对MSCs增殖的促进作用,RT-PCR法证实MSCs表达CGRP受体mRNA,Western blot法证实MSCs表达CGRP受体蛋白。结论MSCs表达CGRP受体,从受体拮抗有效、mRNA表达、蛋白表达角度能得以证实。     

细胞间直接接触对骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞作用的研究

目的探讨体外心肌细胞(cardiomyocytes,CM)与骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,MSCs)共培养时,骨髓间充质干细胞与心肌细胞间直接接触对其分化为心肌细胞的影响.方法 API(4,6-二咪基-2-苯吲哚盐酸)标记后,分别与心肌细胞按接触组和非接触(millicellTM-HA半透膜)组培养,1周后应用免疫荧光检测MSCs肌钙蛋白T(cTnT)的表达,并用RT-PCR方法检测NKx-2.5、GATA-4、TGF-β的表达.结果接触培养组中可见DAPI标记的骨髓间充质干细胞表达cTnT,NKx-2.5、GATA-4、TGF-β有高表达,非接触组的MSCs未见cTnT的表达,相关基因仅有低表达.结论心肌细胞与MSCs的直接接触,是诱导MSCs分化为心肌细胞的重要因素.     

慢病毒载体介导CG RP基因体外转染及对M SC生物学特性的影响

目的：探讨慢病毒载体介导降钙素基因相关肽（CGRP）基因体外转染间充质干细胞（MSC）及其对MSC生物学特性的影响。方法大鼠MSC进行分离、培养及鉴定。CGRP重组慢病毒转染MSC后,采用荧光显微镜和流式细胞技术测定其转染率。实时定量PCR、免疫荧光细胞化学及ELISA法检测MSC中CGRP的表达。慢病毒转染后通过MTT、β‐半乳糖苷酶染色和诱导分化评价MSC的增殖、衰老及分化能力。结果慢病毒载体介导CGRP基因转染 MSC后48 h可稳定表达,MOI＝30时,转染率达80％以上。与MSC组和空载病毒转染（MSC‐EGFP组）比较,CGRP修饰的MSC（MSC‐CGRP组）中CGRP的mR‐NA和蛋白表达水平增高（均 P＜0．01）。MTT、β‐半乳糖苷酶染色和诱导分化结果显示,病毒转染后对MSC增殖、衰老及向内皮分化基本没有影响。结论 MSC是一种理想的基因载体细胞,可作为CGRP基因转染的靶细胞用于基因治疗,为后续体内、体外实验奠定基础。     

康复训练对大鼠脑梗死后CGRP表达的影响

目的 研究康复功能训练对脑梗死大鼠大脑降钙素基因相关肽（CGRP）表达的影响。方法 采用60只SD大鼠制作脑梗死模型;24h后随机分为康复组和制动组;康复组每日给予平衡、抓握、旋转、行走等功能训练,制动组置于网状笼内固定,各组在24h,1,2,3和4wk检测CGRP表达。结果 康复组和制动组大鼠中枢神经系统中皮质、脊髓前角均出现CGRP阳性神经元,康复组反应比制动组强。结论 康复功能训练可引起CGRP表达增加,有促进神经功能恢复的作用。     

骨髓间充质干细胞对大鼠胶质瘤细胞的趋化性实验

目的用Transwell细胞迁移实验观察骨髓间充质干细胞是否具有对C6大鼠胶质瘤细胞的趋向性。方法在Transwell培养板的Transwell上室中放置一定量的用B rdU标记的骨髓间充质干细胞,Transwell培养板的培养孔中分别放置:IMDM培养基、C6细胞条件培养液、MRC-5细胞、C6鼠胶质瘤细胞。将以上Transwell培养板在CO2恒温培养箱中培养2h后,然后取胰酶加入培养孔中消化细胞5min,拿掉Transwell上室,取适量细胞悬液滴加在载玻片上,然后将4%多聚甲醛滴加在载玻片上的细胞上将其固定30min,然后对载玻片上的细胞进行B rdU免疫组化染色(S-ABC法)。免疫组化染色处理后,用显微图像分析仪计数载玻片上的阳性细胞数。结果迁移到C6及其条件培养液组的骨髓间充质干细胞明显多于IMDM和MRC-5组,并有统计学意义上的差异,且C6及其条件培养液组之间也有统计学意义上的差异,IMDM和MRC-5组两组之间差异无统计学意义。结论实验表明骨髓间充质干细胞对C6细胞及其分泌的各种因子具有趋向性。     

成人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的体外研究

目的 探索成人骨髓间充质干细胞在体外定向分化为神经元样细胞的条件。方法 采用Ficoll-paque(1．077g／m1)分离液密度梯度离心从人的骨髓分离出骨髓间充质干细胞，体外扩增到第10代，选择4组不同组合的神经分化诱导条件，分别诱导骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化，通过免疫细胞化学鉴定诱导后细胞神经元烯醇化酶、神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白的表达情况。结果各组诱导剂诱导后，骨髓间充质干细胞分化为具有典型的神经元形态的细胞，免疫细胞化学显示、NF-M呈强阳性反应，NSE表达强度提高，在最佳的分化条件下，即加入bFGF、ATRA、BME、BHA、DMSO诱导条件下，大约80％细胞表达NF—M，86％的细胞为NSE强阳性。结论 成人MSCs在体外可定向诱导分化为神经元样细胞，且具有较高的阳性分化率。     

转LacZ基因骨髓间充质干细胞体内造血分化的初步研究

目的 初步探讨小鼠骨髓间充质干细胞在体内向造血细胞分化的潜能。方法 利用转LacZ基因小鼠MSCs输注X射线亚致死量照射的BALB／C小鼠，2个月后取骨髓细胞作体外甲基纤维素培养和X-Gal染色，取肝脏X-Gal染色。结果 MSCs输注组和对照组骨髓细胞体外集落培养均能形成鹅卵石样造血细胞集落，经X-gal组化染色后，输注组部分造血集落产生蓝绿色，对照组没有颜色变化。肝脏X-Gal染色输注组部分产生蓝色，对照组没有颜色变化。结论 小鼠MSCs具有向造血细胞分化的潜能。     

CGRP影响人牙髓干细胞增殖分化的研究

目的 研究降钙素基因相关肽(CGRP)对人牙髓干细胞增殖分化的调控作用,并初步探讨CGRP的调控信号通路.方法 首先获取健康的牙髓,体外培养并筛选牙髓干细胞;采用MTT法检测不同浓度的CGRP对牙髓干细胞的增殖作用,获取适宜的作用浓度;利用茜素红染色法观察CGRP作用下牙髓干细胞形成矿化结节的效果;在实时定量RT-PCR法及免疫印迹法检测CGRP作用下牙髓干细胞中Ⅰ型胶原(Col-1)、转录因子Runx2的mRNA和蛋白表达水平;最后利用实时定量RT-PCR法检测MAPK信号通路抑制剂作用下CGRP对牙髓干细胞中Ⅰ型胶原、Runx2 mRNA表达水平的影响.结果 经过筛选培养获得生长稳定的牙髓干细胞;MTT法检测可知CGRP可促进牙髓干细胞的增殖,在CGRP的浓度达到10-7 mol/L时效果最显著;在CGRP作用牙髓干细胞28 d后,经茜素红染色可见矿化结节;经实时定量RT-PCR法和免疫印迹法检测可知CGRP作用下牙髓干细胞中Col-1、Runx2的mRNA和蛋白表达水平得到显著提高;MAPK信号通路中ERK激酶通路能够调控CGRP作用下牙髓干细胞中Runx2表达的水平,ERK激酶和p38通路能够调控CGRP作用下牙髓干细胞中Col-1表达的水平.结论 CGRP能够促进牙髓干细胞的增殖分化,这一作用受到MAPK信号通路的调控.     

pcDNA3-EGEP基因转染骨髓间充质干细胞的实验研究

目的探讨外源性pcDNA3-EGFP基因转染修饰兔骨髓间充质干细胞的可行性.方法用增荧光绿色蛋白(enhanced greenfluorescent protein,EGFP)cDNA作为报告基因,采用重组真核表达载体系统(pcDNA3-EGFP)以脂质体法转染原代骨髓间充质干细胞,观察转染结果、表达情况及对靶细胞活力的影响.结果经荧光显微镜下观察证实成功地对骨髓间充质干细胞实现了基因转染,持续表达时间超过8周;没有发现明显的细胞毒作用及对细胞活力的显著影响.结论采用真核转染技术可以介导外源基因转染骨髓间充质干细胞,为今后采用基因增强组织工程方法治疗肌肉、骨骼系统疾病提供了实验基础.     

接种密度对人脐静脉间充质干细胞原代培养的影响

目的:探讨不同接种密度对人脐静脉间充质干细胞(hUV-MSCs)原代培养的影响,从而确定原代培养hUV-MSCs的适宜条件。方法:分离人脐静脉内皮及内皮下层细胞,按不同接种密度分组进行原代培养,记录原代培养时间,然后进行传代和成骨诱导培养,并检测细胞钙结节的表达情况。结果:hUV-MSCs原代分离培养消化30min,种植细胞密度为5×105~1×106/cm2的方法较合理。经化学药物(如地塞米松、β-甘油磷酸、维生素C)成骨诱导后,可形成钙结节。结论:合理hUV-MSCs原代培养方法,可以快速获得最大量的自体种子细胞,从而为组织工程化骨的体外构建创造条件。     

人骨髓间充质干细胞的培养及研究

目的　了解间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)的培养条件、生物特性及分化能力。方法　抽取健康成人骨髓,利用密度梯度离心分离培养人MSC,并用流式细胞仪检测细胞表面标记,体外诱导MSC向成骨细胞分化。结果　成功地进行了人MSC的原代和传代培养;MSC CD34、CD45、HLA DR、CD62p等为阴性,CD29、CD44、CD166、CD90 等为阳性;MSC能够分化为成骨细胞。结论　人骨髓MSC在体外有较强的扩增能力,并能够向成骨细胞分化。     

人间充质干细胞对人前列腺癌细胞上皮-间质转化和侵袭能力的影响

目的探讨间充质干细胞（MSCs）对人前列腺癌细胞上皮-间质转化（EMT）和侵袭能力的影响。方法以干扰素γ（IFNγ）预处理的间充质干细胞[MSCs（IFNγ）]的培养上清处理人前列腺癌PC-3细胞,观察PC-3细胞形态的变化,并以划痕实验、Transwell实验检测PC-3细胞的迁移、侵袭能力,使用实时定量聚合酶联反应（qRT-PCR）法检测EMT相关的基因E-cadherin、Vimentin、N-cadherin的mRNA表达情况。结果与PBS预处理的对照组相比,实验组的PC-3细胞有从上皮的类圆形细胞向间质的梭形细胞转化的趋势;与对照组相比,实验组中E-cadherin mRNA表达下调,而Vimentin及N-cadherin mRNA表达上调（P均〈0.05）;实验组PC-3细胞的迁移和侵袭能力均强于对照组（P〈0.05）。结论 IFNγ预处理的MSCs可促进前列腺癌细胞发生EMT,并使得前列腺癌细胞迁移、侵袭能力增强。     

人羊膜间充质干细胞的分离与鉴定

目的：探讨从人胎盘组织中分离羊膜间充质干细胞（hAMSCs）。方法：收集剖宫产足月胎儿胎盘,采用组织块贴壁法分离出羊膜问充质干细胞并传代培养,对P1-P3代细胞进行细胞形态的观察,用流式细胞仪检测细胞膜表面阳性分子CD73．APC、CD90-FITC、CIM4．PE、CDl05．Cy5．5和阴性分子CDllb-PE、CDl9．PE、CD34-PE、CD45-PE、HLA-DR-PE,并采用六孔板法检测细胞增殖情况。结果：hAMSCs的细胞形态呈成纤维状,hAMSCs在培养3-d达到对数增长期,通过流式检测,发现细胞可表达CD73、CD90、CD44和CDl05,未表达CDllb、CDl9、CD34,CD45、HLA-DR。结论：从体外成功分离培养出人羊膜间充质干细胞。     

流体切应力作用于间充质干细胞对其内皮分化后细胞间黏附因子1表达的影响

目的探讨流体切应力作用于成体骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSCs）后,其定向内皮诱导所得细胞的细胞间黏附因子1（intercellularadhesionmolecule-1,ICAM-1）的表达变化。方法体外培养大鼠骨髓MSCs,于流室系统中加载不同强度的流体切应力后,将其向内皮细胞系诱导,以荧光实时定量RT-PCR检测所得细胞ICAM-1的mRNA表达水平,以流式细胞仪检测ICAM-1蛋白表达水平,并进一步观察细胞传代后ICAM-1mRNA及蛋白表达水平变化。结果大鼠MSCs经过流动加载后,定向内皮诱导所得细胞的ICAM-1mRNA及蛋白表达水平均较静态对照组有所升高（P〈0.05）,但当细胞传代后,ICAM-1蛋白水平回落至对照组水平（P〉0.05）,而mRNA表达水平继续升高。结论流体切应力能增加MSCs来源的内皮细胞黏附因子的表达,证实了血流动力学因素在动脉粥样硬化发病机制中所起的重要作用。     

人脐带间充质干细胞过敏性试验

目的：观察人脐带间充质干细胞对豚鼠的过敏性反应,为临床使用人脐带间充质干细胞的安全性提供参考。方法：培养扩增人脐带来源的间充质干细胞,制备成细胞生理盐水混悬液。将30只豚鼠分成3组,分别是模型1组、模型2组和对照组。2个模型组隔日肌注细胞生理盐水混悬液3次,实验1组于首次注射后第14天,实验2组于首次注射后第21天分别静脉注射混悬液进行攻击。观察动物有无过敏反应症状。结果：动物无明显过敏反应症状,反应级数为0级。结论：人脐带间充质干细胞免疫原性低,不易导致过敏反应。     

脂肪间质干细胞对肝星状细胞活化、增殖、凋亡相关作用的研究

目的探讨脂肪间质干细胞(ADSCs)对活化态肝星状细胞(HSCs)增殖、活化凋亡的影响及其探讨产生作用的原因。方法从肝脏及腹腔脂肪分别分离纯化培养HSCs及ADSCs,通过半透膜(transwell insert)在6孔塑料培养板上建立HSCs与ADSCs的双层培养体系,大鼠正常肝细胞系(BRLs)及HSCs培养分别作为对照。通过CCK-8比色法检测ADSCs对HSCs增殖的影响;Western blotting检测HSCsα-肌动蛋白(α-SMA)的表达,了解HSCs的活化状态;流式细胞仪检测ADSCs对HSCs凋亡的影响。最后通过检测培养液中细胞因子的含量探讨可能的作用机制。结果 HSCs与ADSCs共培养72h,ADSCs明显抑制HSCs的活化与增殖,促进HSCs的凋亡,培养液细胞因子检测显示ADSCs比BRLs分泌更多的HGF,而较少分泌TGF。结论 ADSCs具有分泌细胞因子抑制HSCs活化增殖,促进凋亡的潜能。ADSCs的治疗作用可能与其分泌的细胞因子有关。     

间充质干细胞治疗强直性脊柱炎的临床疗效

目的:分析探讨间充质干细胞对强直性脊柱炎(AS)患者的临床治疗效果.方法:对2016年5月至2017年5月收治的82例AS患者进行回顾性研究,其中42例患者采用间充质干细胞进行治疗为观察组,40例患者采用抗风湿药物治疗为对照组,分析两组患者治疗前后血常规变化、肝功能水平变化、血沉指数、夜间疼痛VAS评分、Bath强直性脊柱炎功能指数(BASFI)评分和Bath强直性脊柱炎疾病活动性指数(BASDAI)评分变化.结果:经治疗后,观察组患者血常规红细胞计数(RBC)、白细胞计数(WBC)、血小板计数(PLT)、血红蛋白(HB)分别为[(3.20±0.24)×1012/L]、[(893.65±121.85)×109/L]、[(192.64±7.68)×109/L]、[(106.84±12.35)g/L],与治疗前相比差异具有统计学意义(t=9.40,30.14,7.08,5.34;P<0.05),且治疗后显著优于对照组(P<0.05);观察组患者谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)以及总胆红素(TBIL)水平分别为[(17.24±4.96)U/L]、[(28.03±4.96)U/L]、[(10.07±1.42)μmoL/L],与治疗前相比差异显著(t=3.44,3.74,3.02;P<0.05);观察组患者治疗后VAS评分、BASFI评分以及BASDAI评分均显著优于治疗前(P<0.05),与对照组相比差异也具有统计学意义(P<0.05).结论:AS患者采用间充质干细胞治疗可以有效的改善患者的血常规和肝功能水平,且可以有效的缓解患者的临床症状,改善脊柱功能,效果显著,值得临床推广.