蛋白质组学技术鉴定的PC12细胞的细胞骨架蛋白

目的:使用蛋白质组学的技术手段,鉴定大鼠肾上腺皮质细胞瘤细胞系PC12细胞内的细胞骨架蛋白。方法:提取PC12细胞的蛋白质,建立固相pH梯度双向电泳图谱,应用图像扫描仪及ImageMaster 2D Elite分析软件获得蛋白质点的数字化和匹配性信息,挑选匹配良好的高峰度蛋白点,进行基质辅助激光解吸／电离飞行时间质谱(MALDI- TOF-MS)分析,鉴定。结果:用二维电泳技术分离,并用MALDI-TOF-MS成功鉴定出5个PC12细胞的细胞骨架蛋白。结论:PC12细胞蛋白质组中部分细胞骨架蛋白胶图位点的建立,为今后探讨这一类蛋白在神经系统疾病中的作用奠定了基础,并提供了新的侯选治疗靶点。     

MPP+诱导PC12细胞损伤的蛋白质组学研究

目的研究Mpp~ 作用PC12细胞48h后蛋白质表达谱的改变,进一步在蛋白质水平上阐明帕金森病的发病机制。方法建立Mpp 诱导的PC12细胞帕金森病模型,提取对照组与实验组的细胞总蛋白,应用荧光差异凝胶电泳(Differential Gel Electrophoresis,DIGE)系统构建双向电泳图,DeCyder软件分析蛋白表达差异信息,运用MALDI-TOF质谱鉴定差异蛋白质。结果与对照组相比,实验组共有32个蛋白点发生变化;鉴定了其中7种结构和功能各异的蛋白。结论本研究鉴定出氧化应激和线粒体损伤相关的蛋白thioredoxin、MPPs,与细胞骨架相关的蛋白NF-L、ezrin,具有分子伴侣活性的蛋白NAC、crystaillin,与免疫炎症相关的蛋白gClqBP。这些蛋白的显著改变可能与PD的发病机制密切相关。     

Aβ_(25-35)诱导PC12细胞损伤的蛋白质组学研究

目的 识别AD细胞模型中蛋白质组改变,在蛋白质水平上揭示Aβ的作用机制.方法 利用双向差异凝胶电泳技术(2D-DIGE)和质谱(MS)技术.探索20μmol/L浓度Aβ_(25-35)肽段作用48h后PC12细胞蛋白质组的改变.结果 2D-DIGE图像上出现约2000个蛋白点.与对照组比较,Aβ_(25-35)作用下共有29个蛋白的表达有显著差异,其中25个蛋白表达量上调及4个蛋白表达量下调超过30%.质谱鉴定出7个蛋白点,分为3类:(1)具有分子伴侣活性的蛋白:葡萄糖调节蛋白75(glucose-regulated protein75,GRP75)、热休克同源蛋白71(heat shock cognate 71 kDa protein,HSC71)、calreticulin表达量均上调.(2)细胞骨架蛋白:β-微管蛋白(tubulin beta chain 15,TBETA-15)和低分子量神经细丝蛋白(neurofilament light polypeptide,NF-L)表达量亦上调.(3)与能量代谢有关的酶:肌酸激酶B(creatine kinase-B,CKB)和醛缩酶A(aldolaseA)蛋白表达量均下调.结论 本实验首次将DIGE和MS方法应用于Aβ_(25-35)神经毒性作用机制研究,在蛋白质组水平上揭示了Aβ_(25-35)毒性作用的早期机制.     

蛋白酶体抑制诱导的PC12细胞帕金森病模型

目的探讨蛋白酶体抑制剂对PC12细胞的作用以及用该药物制作帕金森病(PD)模型的可能性。方法用不同浓度蛋白酶体抑制剂PSI作用于PC12细胞24、48、72 h后,以MTT法检测细胞活性,荧光染色检测凋亡细胞百分率,HE染色观察细胞形态变化,透射电镜观察细胞超微结构变化。结果不同浓度PSI作用于PC12细胞24 h时,细胞存活率无变化;作用48~72 h时,1~20μmol/L PSI使细胞存活率分别降至47.03%~58.98%和19.58%~34.72%;凋亡细胞由1.15%升至5.27%。HE染色显示经PSI处理的PC12细胞胞浆内有嗜酸性包涵体出现,透射电镜下细胞呈凋亡的超微结构特点。结论PC12细胞蛋白酶体受抑模拟了PD的两大病理特点,蛋白酶体功能异常可能是PD的发病因素之一,短期抑制PC12细胞的蛋白酶体功能可作为PD的细胞模型。     

应用差异荧光双向凝胶电泳法进行大鼠局灶性脑缺血早期蛋白质组学研究

目前对缺血性脑血管病发病的危险因素研究较多,但从蛋白质水平对其发病机制进行研究并不多见[1],国内外应用蛋白质组学方法对缺血性脑血管病研究多集中于对血浆[2, 3]、体液[4]的研究,而对于脑组织研究只是刚刚起步[5]。由于局部脑血流被阻断或者减少,而使脑缺血对于基因表达起到强大的刺激作用[6],势必导致蛋白质水平发生相应变化。因此,本研究应用先进的荧光差异双向凝胶电泳(two-dimensional differential in-gel electrophoresis, 2D DIGE)蛋白质组学方法, 对大鼠脑缺血大脑中动脉(MCAO)模型进行研究,揭示脑缺血发病的病理生理机制,寻找缺血性脑血管病早期作为疾病标志物的蛋白质,为发现新型的脑缺血治疗药物靶点提供线索。     

蛋白质组学在小儿神经系统疾病中的应用

蛋白质组学研究方法包括双向凝胶电泳、质谱分析、计算机软件分析等。在小儿神经系统疾病研究中通过表达蛋白质组学和相互作用蛋白质组学揭示其发病机制。为小儿神经系统疾病中遗传代谢性疾病的新生儿筛查、肿瘤、感染性疾病和中枢神经系统损伤、脱髓鞘等疾病的研究提供了有力的工具。     

NGF诱导PC12细胞早期分化的DIGE分析

目的筛选神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)处理后PC12细胞分化早期相关蛋白,寻找NGF药物作用靶点,为深入进行神经保护药物的研发提供理论依据。方法在建立NGF诱导PC12细胞分化模型的基础上,分别提取NGF处理前后的细胞总蛋白,应用荧光差异凝胶电泳(Differential Gel Electrophoresis,DIGE)系统获得蛋白点表达差异信息,运用MALDI-TOF质谱鉴定出差异蛋白质。结果NGF处理组有7个蛋白点发生变化;通过数据库检索,鉴定了3种结构和功能各异的蛋白。结论eEF-2、Rab GDIα和DPP与NGF诱导PC12细胞分化早期过程有关,可能是NGF的作用靶点。     

美满霉素对帕金森病细胞凋亡模型保护作用的研究

目的探讨美满霉素(MC)对1甲基4苯基吡啶离子(MPP+)诱导的帕金森病细胞凋亡模型保护作用的机制。方法将不同浓度(10、50、250、500μmol/L)MPP+加入培养的PC12细胞中,选择最适当浓度的MPP+建立多巴胺神经元凋亡模型(MPP+组);通过四甲基偶氮唑盐法(MTT法)检测经不同浓度(0、10、50、100、200μmol/L)MC预处理后多巴胺神经元凋亡模型的活性,以此筛选出具有最佳保护作用MC浓度建立MC+MPP+组;用电泳法、流式细胞术和逆转录聚合酶链式反应分别检测MPP+组、MC+MPP+组细胞的凋亡率,以及此2组细胞caspase3mRNA的表达,并与空白对照组比较。结果(1)在MPP+为10μmol/L时可见细胞凋亡最典型的梯状DNA条带,以此浓度建立多巴胺神经元凋亡模型(MPP+组);用100μmol/LMC预处理的MPP+组细胞活性最高(P<0.05),以此作为此后实验用MC浓度。(2)MC+MPP+组细胞凋亡率及caspase3mRNA的灰度比值分别为(22.83±2.10)%及68.08±1.14,极显著低于MPP+组的(45.89±2.28)%及86.50±1.43(均P<0.01),但仍明显高于空白对照组的(11.05±1.02)%及53.75±1.23(均P<0.05)。结论MC可能通过下调caspase3mRNA表达保护MPP+诱导的PC12细胞凋亡。     

硫辛酸抑制帕金森病模型细胞铁聚积的实验研究

目的观察硫辛酸(LA)对6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的PC12细胞铁代谢的影响,并探讨其作用机制。方法 MTT法确定6-OHDA最适造模浓度,筛选LA低、高保护浓度。实验分为正常对照组、模型组(6-OHDA 50μmol/L)、LA低剂量(0.001μmol/L)组和LA高剂量(0.1μmol/L)组。比色法测定细胞内MDA、铁含量,Western blot检测铁代谢相关蛋白DMT1(+IRE)、IRP1、IRP2水平,实时荧光定量PCR分析DMT1(+IRE)、IRP1、IRP2的mRNA表达。结果 (1)与对照组相比,模型组细胞活力明显下降(P<0.01),MDA、铁含量显著增加(P<0.01),DMT1(+IRE)、IRP1、IRP2蛋白及mRNA水平明显上调(P<0.01)。(2)与模型组相比,LA低、高剂量组细胞活力均上升(P<0.05,P<0.01),MDA、铁含量均显著减少(P<0.01),DMT1(+IRE)、IRP1、IRP2蛋白及mRNA水平均下调(P<0.05,P<0.01)。(3)与LA低剂量组相比,LA高剂量组MDA、铁含量减少(P<0.05),DMT1(+IRE)、IRP1蛋白及mRNA水平降低(P<0.05,P<0.01);而LA低剂量组与LA高剂量组相比,两组的IRP2蛋白及mRNA表达差异不具有统计学意义(P>0.05)。结论 LA对6-OHDA诱导的PC12细胞损伤具有保护作用,其机制可能是通过抑制IRP/IRE途径下调6-OHDA诱导的DMT1(+IRE)上升,从而减少细胞对铁离子的吸收,减轻铁聚集引起的氧化应激对细胞的损伤。     

蛋白质组学技术在神经系统疾病中的应用进展

随着科学技术的蓬勃发展,蛋白质组学技术已广泛运用于生物医学研究领域,其主要技术包括双向凝胶电泳、计算机图像分析与大规模数据处理及质谱等.本文通过查阅近几年国内外文献,归纳了蛋白质组学技术发展的最新动态,阐述蛋白质组学技术应用于神经系统疾病的研究,如精神分裂症、阿尔茨海默症、帕金森氏疾病及神经系统其他疾病的最新研究进展.     

MPP^＋诱导SHSY5Y细胞凋亡的可能机制

探讨MPP 诱导SHSY5Y细胞凋亡的可能机制。采用流式细胞仪测定SHSY5Y细胞的凋亡率、Bcl 2 /Bax蛋白的表达率、活性氧的生成量 ,免疫细胞化学染色法观察活化型CPP32的表达。结果显示 ,MPP 诱导SHSY5Y细胞凋亡 ,两者间呈明显的量效和时效关系。在凋亡过程中Bcl 2蛋白表达显著降低 ,Bax蛋白表达随之增高。随着MPP 作用浓度的增加和作用时间的延长 ,ROS的生成逐渐增加 ,活化型Caspase 3阳性细胞的百分比也逐渐增加 ,均有明显的量效和时效关系。提示Bcl 2 /Bax蛋白是MPP 诱导SHSY5Y细胞凋亡的重要调节蛋白 ,ROS和CPP32在凋亡过程中可能具有重要作用。     

氧化应激是MPP+诱导SHSY5Y细胞凋亡的可能机制

探讨MPP+诱导SHSY5Y细胞凋亡的可能机制.采用流式细胞仪测定SHSY5Y细胞的凋l亡率、Bcl-2/Bax蛋白的表达率、活性氧的生成量,免疫细胞化学染色法观察活化型CPP32的表达.结果显示,MPP+诱导SHSY5Y细胞凋亡,两者间呈明显的量效和时效关系.在凋亡过程中Bcl-2蛋白表达显著降低,Bax蛋白表达随之增高.随着MPP+作用浓度的增加和作用时间的延长,ROS的生成逐渐增加,活化型Caspase-3阳性细胞的百分比也逐渐增加,均有明显的量效和时效关系.提示Bcl-2/Bax蛋白是MPP+诱导SHSY5Y细胞凋亡的重要调节蛋白,ROS和CPP32在凋亡过程中可能具有重要作用.     

帕金森病炎症/免疫异常细胞模型的建立

目的 观察小胶质细胞激活后形态和功能的变化。以探讨活化的小胶质细胞对多巴胺能神经元产生损伤作用的可能机制。阐明帕金森病发病的免疫机制。方法 建立原代小胶质细胞培养。筛选和鉴定的方法，以细菌细胞壁脂多糖为工具药激活小胶质细胞，通过免疫组化，MTT，ELISA等方法观察小胶质细胞形态，数量和功能的文化。结果 LPS激活的小胶质细胞体积增大，OX-42表达上调，释放一氧化氮（NitricOxide,NO)，合成超氧阴离子（O2）及分泌细胞因子TNF-α量显著增多，而细胞数量无明显改变。结论 激活的小胶质细胞对多巴胺能神经元的损伤作用。可能与释放NO，O2^-及细胞因子TNF-α等细胞毒性物质有关。     

美满霉素对脂多糖诱导帕金森病模型多巴胺能神经元保护作用的研究

目的 探讨美满霉素(Mino)对脂多糖(LPS)诱导小胶质细胞(Mic)激活的抑制作用和对黑质多巴胺能神经元的保护作用.方法 20只雄性SD大鼠随机分为单纯LPS干预组和LPS+Mino干预组,并设5只作为生理盐水注射对照组,于不同时间点观察大鼠行为学改变,并采用免疫组织化学、原位杂交、Western-blot等方法观察Mic的激活情况以及酪氨酸羟化酶(TH)神经元、mRNA、蛋白的表达水平.结果 LPS+Mino干预组在LPS诱导后7、14 d的旋转次数均较单纯LPS干预组明显减少;两组均以激活型Mic为主,LPS+Mino组"阿米巴样"Mic数目较单纯LPS组明显减少,尚存有少许"分支样"Mic;LPS术后2组术侧中脑OX-42蛋白水平较生理盐水注射对照组均明显增高,LPS+Mino组(0.91±0.04)增加水平明显低于单纯LPS组(1.03±0.03,P＜0.01);2组术侧中脑TH阳性神经元数量、mRNA、蛋白水平均较生理盐水注射对照组明显下降,单纯LPS组(21.5±4.9,39.9±7.0,0.42±0.03)下降水平显著高于LPS+Mino组(53.4±8.4,65.1±9.1,0.63±0.04;P＜0.01).结论 Mino的干预可显著抑制LPS诱导的Mic激活,减轻LPS对黑质多巴胺能神经元的毒性作用,并延缓PD模型的病情进展.     

帕金森病猴丘脑底核神经元的电生理特性

目的探讨帕金森病(PD)猴模型丘脑底核(STN)神经元的电生理特性,为研究帕金森病的病理生理过程提供动物实验依据。方法应用颈内动脉注射MPTP建立PD猴模型。在立体定向仪引导下应用细胞外记录的方法记录"造模"前后猴病理及正常生理状态下STN神经元的放电活动,并对其放电模式进行分析。结果电生理记录显示STN神经元放电频率在生理状态下为2.03±1.12Hz;在病理状态下为9.58±0.85 Hz(P<0.01)。在生理状态下有20个(20/35,57.14%)神经元呈现簇发放电,有15个(15/35,42.86%)神经元呈现连续放电;在PD病理状态下有10个(10/12,85.71%)神经元呈现簇发放电,有2个(2/12,14.29%)神经元呈现连续放电(P<0.05)。生理状态下STN神经元的ISI序列散在分布于30～980ms之间;在PD病理状态下当STN神经元呈连续放电时,ISI分布于50～360ms之间,在150ms以下有一个分布密集条带,当STN神经元呈簇发放电时,ISI分布于30～470ms之间,在40ms以下有一个分布密集条带。结论PD猴模型STN神经元较生理状态下放电频率明显增加,其放电模式也有明显变化,簇状放电模式比例增大,ISI序列发生明显变化。     

卡麦角林治疗帕金森病的临床研究

目的探讨卡麦角林结合左旋多巴治疗帕金森病的效果。方法将80例帕金森患者随机分为2组：治疗组和对照组，两组均予以左旋多巴治疗，其中治疗组加有卡麦角林治疗，治疗3年后评价疗效，观察不良反应。结果治疗组疗效与对照组疗效相当，但治疗组左旋多巴用量明显小于对照组，治疗组运动波动症状的发生率明显小于对照组。结论卡麦角林结合左旋多巴治疗帕金森病可明显降低左旋多巴的用量，减少运动波动症状的发生。     

MPP+-induced neuronal death in rats involves tyrosine 33 phosphorylation of WW domain-containing oxidoreductase WOX1

WW domain-containing oxidoreductase (named WWOX, FOR or WOX1) is a pro-apoptotic protein and tumor suppressor. Animals treated with dopaminergic neurotoxin 1-methyl-4-phenyl-pyridinium (MPP⁺) develop Parkinson's disease (PD)-like symptoms. Here we investigated whether WOX1 is involved in MPP⁺-induced neurodegeneration. Upon insult with MPP⁺ in rat brains, WOX1 protein was upregulated and phosphorylated at Tyr33 (or activated) in the injured neurons in the striatum and cortex ipsilaterally to intoxication, as determined by immunohistochemistry and Western blotting. Also, WOX1 was present in the condensed nuclei and damaged mitochondria of degenerative neurons, as revealed by transmission immunoelectron microscopy. Time-lapse microscopy revealed that MPP⁺ induced membrane blebbing and shrinkage of neuroblastoma SK-N-SH cells. Dominant-negative WOX1, a potent inhibitor of Tyr33 phosphorylation, abolished this event, indicating a critical role of the phosphorylation in apoptosis. c-Jun N -terminal kinase (JNK1) is known to bind and counteract the apoptotic function of WOX1. Suppression of JNK1 function by a dominant-negative spontaneously induced WOX1 activation. WOX1 physically interacted with JNK1 in SK-N-SH cells and rat brain extracts. MPP⁺ rapidly increased the binding, followed by dissociation, which is probably needed for WOX1 to exert apoptosis. We synthesized a short Tyr33-phosphorylated WOX1 peptide (11 amino acid residues). Interestingly, this peptide blocked MPP⁺-induced neuronal death in the rat brains, whereas non-phospho-WOX1 peptide had no effect. Together, activated WOX1 plays an essential role in the MPP⁺-induced neuronal death. Our synthetic phospho-WOX1 peptide prevents neuronal death, suggestive of its therapeutic potential in mitigating the symptoms of PD.     

Glutamate is not involved in the MPP+-induced dopamine overflow in the striatum of freely moving C57BL/6 mice

Summary. The role of glutamate in the N-methyl-4-phenyl-dihydropyridinium (MPP⁺) toxicity has been argued in the past decade. However, the effects of glutamate efflux and NMDA antagonist on MPP⁺-induced dopamine overflow have not been documented. To clarify this, we perfused MPP⁺ through a microdialysis probe in the striatum of freely moving mature C57BL/6 mice. The 60-min perfusion of 10 and 100 μM MPP⁺ strikingly increased dopamine levels to 28- and 93-fold of the basal values, respectively. In contrast, an administration of MPP⁺ did not induce marked glutamate release: the MPP⁺-perfusion slightly increased the glutamate level at 100 μM, but not at 10 μM. The addition of 100 μM (+)-MK-801 or 200 μM (±)-AP-7 to the perfusate did not attenuate MPP⁺-induced dopamine overflow. The extent of dopamine release only depended on the amount of MPP⁺ accumulation into the cells. These results indicated that, at least in the striatum, neither glutamate release nor the NMDA antagonist, including (+)-MK-801, could regulate MPP⁺-evoked dopamine overflow. Received November 7, 2000; accepted February 28, 2001