脐血CD34+细胞分化为树突状细胞过程中JAK2、STAT5蛋白的表达及活化

目的检测脐血CD34 造血干/祖细胞分化为树突状细胞过程中JAK2、STAT5蛋白的表达及活化,从而了解JAK-STAT信号途径在CD34 造血干/祖细胞向DC分化中的作用.方法体外诱导脐血CD34 细胞向DC分化,用免疫印迹方法检测CD34 细胞、分化第7天细胞和分化第14天的细胞中与GM-CSF密切相关的JAK2和STAT5蛋白的表达及其在GM-CSF作用下蛋白酪氨酸磷酸化水平.结果分离的CD34 细胞和诱导分化第7天、第14天的细胞在正常静止状态下,均表达一定量的JAK2,而且在所有的时间点JAK2蛋白的表达量类似,随着细胞向DC分化酪氨酸磷酸化JAK2水平明显增加;STAT5在CD34 细胞分化前即有明显表达,随着向DC分化,其表达量增加.随着DC的分化成熟,STAT5的酪氨酸磷酸化水平提高.STAT5的活化高峰较JAK2的酪氨酸磷酸化滞后.结论 JAK-STAT途径可能参与了GM-CSF刺激作用下CD34 细胞诱导向DC分化的调控机制.     

人参多糖对K562细胞凋亡与细胞周期的影响及其机制

目的探讨人参多糖(ginseng polysaccharide,GPS)诱导白血病细胞K562凋亡和周期阻滞的机制。方法取对数生长期的K562细胞,调整密度为7×108/L,空白对照组予以常规培养;GPS组加入400 mg/L GPS。流式细胞仪测定细胞的凋亡率及细胞周期分布变化;RT-PCR检测细胞ERK表达的变化。免疫组化的方法检测细胞中p-ERK、NF-κB、Cyclin D1蛋白定位及表达量的变化。Western blot检测细胞中ERK、p-ERK、NF-κB、Cyclin D1蛋白的变化。结果与对照组比较,K562细胞在400 mg/L GPS的作用下,体外培养24、48、72 h后,GPS组细胞凋亡率显著增高(P<0.05),周期分布检测结果显示,与对照组相比,GPS组K562细胞G0/G1期细胞数量呈时间依赖性增多(P<0.05),G2+M、S期细胞数量则明显减少(P<0.05)。RT-PCR检测结果显示,400 mg/L GPS处理48 h组ERK mRNA的表达水平明显低于对照组(0.20vs 0.50,P<0.05)。免疫组化显示p-ERK、NF-κB、Cyclin D1主要分布在细胞核和细胞质,与对照组相比,GPS组K562细胞内p-ERK、NF-κB、Cyclin D1的表达明显减弱。Western blot检测结果显示,ERK总蛋白无明显变化(P>0.05),而p-ERK、NF-κB、Cyclin D1随时间变化有减少趋势,且在48 h减少明显,差异有统计学意义(P<0.05)。结论人参多糖GPS可促使K562细胞周期阻滞在G0/G1期,并诱导K562细胞凋亡,且均呈时间依赖性。GPS促进K562细胞凋亡、导致其细胞周期阻滞的机制可能是通过抑制ERK/NF-κB信号通路的激活,进而下调Cyclin D1来实现的。     

Mechanism of ginseng polysaccharide on apoptosis and cell cycle in leukemia K562 cells

目的 探讨人参多糖(ginseng polysaccharide,GPS)诱导白血病细胞K562凋亡和周期阻滞的机制.方法 取对数生长期的K562细胞,调整密度为7×108/L,空白对照组予以常规培养;GPS组加入400 mg/L GPS.流式细胞仪测定细胞的凋亡率及细胞周期分布变化;RT-PCR检测细胞ERK表达的变化.免疫组化的方法检测细胞中p-ERK、NF-κB、Cyclin D1蛋白定位及表达量的变化.Western blot检测细胞中ERK、p-ERK、NF-κB、Cyclin D1蛋白的变化.结果 与对照组比较,K562细胞在400mg/L GPS的作用下,体外培养24、48、72 h后,GPS组细胞凋亡率显著增高(P＜0.05),周期分布检测结果显示,与对照组相比,GPS组K562细胞G0/G1期细胞数量呈时间依赖性增多(P＜0.05),G2+M、S期细胞数量则明显减少(P＜0.05).RT-PCR检测结果显示,400 mg/L GPS处理48 h组ERK mRNA的表达水平明显低于对照组(0.20vs0.50,P＜0.05).免疫组化显示p-ERK、NF-κB、Cyclin D1主要分布在细胞核和细胞质,与对照组相比,GPS组K562细胞内p-ERK、NF-κB、Cyclin D1的表达明显减弱.Western blot检测结果显示,ERK总蛋白无明显变化(P＞0.05),而p-ERK、NF-κB、Cyclin D1随时间变化有减少趋势,且在48h减少明显,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 人参多糖GPS可促使K562细胞周期阻滞在G0/G1期,并诱导K562细胞凋亡,且均呈时间依赖性.GPS促进K562细胞凋亡、导致其细胞周期阻滞的机制可能是通过抑制ERK/NF-κB信号通路的激活,进而下调Cyclin D1来实现的.     

白血病细胞株耐药与核因子κB蛋白质诱导表达的关系

目的:探讨慢性粒细胞性白血病细胞K562与其耐药株K562/ADR细胞中IκB-α和NF-κB的表达,以及三氧化二砷(As2O3)诱导白血病细胞凋亡的关系.方法:应用不同浓度的As2O3诱导K562和K562/ADR细胞凋亡,以Western-blot免疫印迹电泳检测NF-κB、IκB-α的表达,流式细胞术检测细胞凋亡及分析IκB-α的阳性表达率变化.结果:As2O3诱导K562/ADR细胞凋亡率明显低于K562细胞,当As2O3浓度为1 μmol/L时,两种细胞凋亡率分别是(6.33±1.51)%、(13.25±1.83)%,当As2O3浓度增高到4 μmol/L时,细胞凋亡率则分别为(8.00±1.47)%、(50.56±8.62)%(P＜0.05).在K562细胞胞浆中,IκB-α阳性表达率则由(88.07±0.99)%减少到(49.21±0.95)%(P＜0.01),胞核中P65量逐渐增加;而K562/ADR细胞中无明显变化.结论:As2O3可诱导K562细胞凋亡,伴有IκB-α的降解及NF-κB的激活;K562/ADR细胞NF-κB表达增加,对As2O3诱导的反应无明显改变.     

miRNA-21调节JAK2/STAT3通路关键因子在急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征中的作用研究

目的 探究miRNA-21调节JAK2/STAT3通路及其关键因子在脂多糖(LPS)诱导急性肺损伤(ALI)/急性呼吸窘迫综合征(ARDS)中的作用.方法 构建LPS诱导ALI/ARDS细胞模型.通过实时荧光定量聚合酶链反应检测miRNA-21表达;蛋白质印迹技术检测JAK2、STAT3、BAX、BCL-2、NF-κB表达,细胞计数实验检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 不同时间点内,1 mg/L LPS干预促进细胞凋亡,促进JAK2、STAT3表达,使miRNA-21表达下调.抑制miRNA-21表达,细胞活力下降,凋亡表达增加.抑制JAK2、STAT3表达,细胞活力上升,凋亡表达减少;抑制miRNA-21表达,促进JAK2/STAT3激活,进而增加BAX、NF-κB表达;反之,增加miRNA-21表达,抑制JAK2/STAT3激活,降低BAX、NF-κB表达.结论 LPS诱导ALI/ARDS致miRNA-21表达下调,JAK2/STAT3激活,BAX、NF-κB表达增加.JAK2/STAT3抑制剂干预可在一定程度上逆转由ALI/ARDS诱导促炎、促凋亡反应.抑制miRNA-21表达下调可在LPS诱导ALI/ARDS中发挥保护作用.     

小豆蔻明诱导K562细胞凋亡及其相关凋亡蛋白的表达

目的：探讨小豆蔻明诱导K562细胞凋亡与PTEN、p-Akt、NF-κB、Bcl-2等抑凋亡蛋白及促凋亡蛋白表达量的关系。方法①普通光镜观察小豆蔻明作用K562细胞48h后的细胞形态学变化。②采用MTT法检测小豆蔻明作用K562细胞48h后的凋亡情况,计算IC50。③应用流式细胞仪检测小豆蔻明作用K562细胞48h后的细胞凋亡率。④采用RT-PCR技术检测小豆蔻明作用K562细胞48h后Bcl-2、Bax的mRNA表达量。⑤采用Westernblot技术检测小豆蔻明作用K562细胞48h后PTEN、p-Akt、NF-κB、Bcl-2的蛋白表达量。结果小豆蔻明作用K562细胞48h后,形态学出现明显凋亡现象。MTT提示K562细胞增殖抑制明显且呈量效和时效关系。早期凋亡率与空白组比有显著增加（P＜0.05）,呈剂量依赖关系。Bcl-2mRNA的表达较空白组明显下降（P＜0.05）,BaxmRNA的表达较空白组明显升高（P＜0.05）,呈现浓度依赖性。PTEN蛋白表达量随小豆蔻明的浓度增加明显增加,而p-Akt、NF-κB、Bcl-2蛋白表达量则减少。结论小豆蔻明通过增加PTEN蛋白的表达量,同时下调p-Akt、NF-κB、Bcl-2蛋白的表达量促进K562细胞的凋亡,且呈剂量依赖性。     

PDTC逆转K562/AO2细胞多药耐药性机制研究

目的研究核因子κB（NF-κB）抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC）逆转K562/AO2细胞耐药效应及其机制。方法采用MTT比色法分别检测K562/AO2细胞的耐药性、PDTC对K562/AO2细胞增殖的影响以及非细胞毒剂量PDTC、维拉帕米（Ver）预作用后K562/AO2细胞药物敏感性的变化,采用免疫细胞组织化学法、RT-PCR检测K562、K562/AO2细胞NF-κB、mdr-1 mRNA表达水平以及PDTC作用一定时间对其影响。结果①K562/AO2细胞对阿霉素（ADM）的耐药性是K562细胞的59倍;非细胞毒剂量PDTC预作用后,ADM对K562/AO2细胞的半数抑制浓度（IC50）显著降低,相对逆转耐药效率为93.03%,强于经典耐药逆转剂Ver的作用81.07%（P〈0.01）;②K562/AO2细胞NF-κB表达水平高于K562细胞（P〈0.01）;PDTC可有效抑制K562/AO2细胞NF-κB表达,伴随mdr-1 mRNA表达减少,呈时间依赖性。结论抑制NF-κB异常活化可部分逆转K562/AO细胞耐药性,其机制与mdr-1 mRNA转录表达减少有关。     

小分子酪氨酸激酶抑制剂AG-490对人慢性髓系白血病急变细胞株K562细胞增殖凋亡的影响

目的探讨酪氨酸激酶抑制剂AG-490对人慢性髓系白血病急变细胞株K562细胞的增殖及凋亡的影响。方法采用MTT法观察AG-490在体外对人慢性髓系白血病急变细胞株K562细胞增殖的影响,光学显微镜下观察AG-490对K562细胞形态的变化,流式细胞术检测AG-490对K562细胞凋亡及细胞周期的影响,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及实时荧光定量PCR技术检测AG-490作用后K562细胞bcr/abl融合基因及凋亡相关基因c-myc mRNA的表达水平。结果 AG-490可明显抑制K562细胞的增殖,并随药物作用时间的延长和浓度的增加,抑制作用越明显（P〈0.05）;AG-490可使细胞周期阻滞于G1期,促使其凋亡（P〈0.05）。AG-490作用于K562细胞48 h后bcr/abl融合基因的表达无明显改变（P〉0.05）,而c-myc的表达水平明显降低（P〈0.05）。结论 AG-490可能通过阻断JAK2信号通路而下调c-myc的表达,使K562细胞阻滞于G1期,从而抑制K562细胞增殖,促使其凋亡。     

选择性抑制转录核因子κB活性对白血病K562细胞生存素表达的影响

目的探讨高选择性的蛋白酶抑制药MG132诱导的K562细胞凋亡及其对转录核因子KB（NF-κB）活性和抗凋亡蛋白生存素（Survivin）表达的影响。方法采用细胞形态学观察和流式细胞术检测细胞凋亡,免疫细胞化学和Western印迹分析NF-KB的活性和Survifin的表达。结果不同浓度的MG132作用24h后可诱导K562细胞凋亡,呈剂量依赖效应。NF-κB和Survivin在K562细胞中异常高表达,MG132作用后均明显下调。2、4、6、8μmol／LMG132作用于K562细胞24h后,NF-κB活性分别下调至作用前的75．0％±3．7％、59．9％±5．3％、45．4％±5．7％和25．0％±4．2％,而Survivin蛋白表达分别下调至作用前的90．9％±10．1％、66．7％±5．2％、45．4％±5．7％和30．3％±6．6％,NF-κB活性降低的同时Survivin蛋白的表达也下调,两者密切相关（Pearson相关系数0．989,P〈O．01）。结论MG132可有效地抑制NF-κB的活性,诱导K562细胞发生凋亡,同时抗凋亡蛋白Survifin的表达也随之下调。     

JAK2/STAT3通路对低氧诱导的THP-1细胞炎症因子表达的影响

目的探讨JAK2/STAT3信号通路是否影响低氧诱导的人单核细胞THP-1的炎症因子表达。方法体外低氧(1%O2)培养THP-1细胞24 h构建细胞氧化损伤的实验模型。ELISA法检测IL-1β和TNF-α的分泌水平,Westernblot检测p-JAK2、p-STAT3、JAK2、STAT3和细胞核内NF-κB p65的蛋白表达,实时荧光定量PCR检测炎症因子IL-1β、TNF-α的m RNA表达水平。结果与空白对照组相比,低氧诱导THP-1细胞24 h后,IL-1β、TNF-α的分泌和m RNA表达水平增加,差异均有统计学意义(P0.05);细胞内p-JAK2、p-STAT3和胞核NF-κB p65蛋白表达增加,差异具有统计学意义(P0.05)。使用JAK2抑制剂AG490能明显抑制低氧诱导的THP-1细胞的p-JAK2、p-STAT3和胞核NF-κBp65的蛋白表达,以及能够降低IL-1β、TNF-α的分泌和m RNA表达水平,差异均具有统计学意义(P0.05)。结论低氧可诱导细胞炎症因子的表达增加,其机制可能与激活JAK2/STAT3信号通路有关。     

H2S对氧化型低密度脂蛋白诱导人单核巨噬细胞核转录因子-κB的影响及机制

目的:研究硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)对氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)诱导人单核巨噬细胞NF-κB通路的调节作用及其机制。方法:人单核细胞系THP-1细胞采用12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇(phorbol myristate acetate,PMA)诱导分化为巨噬细胞后,分为4组:对照组、ox-LDL组、ox-LDL+H2S100μmol/L组及ox-LDL+H2S 500μmol/L组。用Western blot检测细胞IκBα蛋白表达及NF-κB磷酸化水平,激光共聚焦法检测细胞胞浆IκBα及NF-κB的核转位改变,免疫共沉淀方法检测细胞核中NF-κB p65与IκBα结合情况。结果:Western blot结果显示,与对照组相比,ox-LDL组人单核巨噬细胞中NF-κB p65磷酸化水平明显升高(0.855±0.116 vs.0.502±0.218,P=0.046),IκBα表达明显减少(0.612±0.216 vs.0.997±0.167,P=0.029);与ox-LDL组相比,ox-LDL+H2S 100μmol/L组及ox-LDL+H2S 500μmol/L组细胞中NF-κB p65磷酸化水平显著降低(0.424±0.225 vs.0.855±0.116,P=0.020;0.378±0.071 vs.0.855±0.116,P=0.011),IκBα表达显著增多(1.037±0.111 vs.0.612±0.216,P=0.015;1.046±0.084 vs.0.612±0.216,P=0.013)。激光共聚焦结果显示:与对照组相比,ox-LDL组THP-1源性巨噬细胞胞浆中IκBα表达明显降低,NF-κB p65核转位明显增加;与ox-LDL组相比,ox-LDL+H2S 100μmol/L组及ox-LDL+H2S 500μmol/L组细胞胞浆IκBα表达显著增多,NF-κBp65核转位明显减少。免疫共沉淀结果显示,对照组人单核巨噬细胞胞核内未检测到NF-κB p65与IκBα的结合,ox-LDL组细胞核内NF-κB p65与IκBα结合较少,ox-LDL+H2S 100μmol/L组及ox-LDL+H2S 500μmol/L组细胞核内NF-κB与IκBα结合明显增多。结论:H2S可抑制ox-LDL诱导人单核巨噬细胞中NF-κB通路激活,其作用机制可能与抑制胞浆中IκBα降解,减少NF-κB p65磷酸化激活及核转位,同时可促进胞核中IκBα与NF-κB的结合,进而抑制NF-κB的活性有关。     

Ad5F35-IκBαΔN重组腺病毒对K562/DNR细胞耐药性逆转的研究

目的:研究Ad5F35-IκBαΔN重组腺病毒对K562/DNR细胞耐药性的逆转作用及相关机制。方法:采用流式细胞仪分析细胞凋亡;NF-κB p65活性分析试剂盒检测K562/DNR细胞NF-κB活性。结果:感染Ad5F35-IκBα△N腺病毒后,K562/DNR细胞NF-κB活性受到明显抑制,从0.224±0.021活性单位/μg核蛋白降至0.132±0.015;凋亡率明显增高,从(10.4±1.5)%升至(43.2±4.8)%。结论:感染Ad5F35-IκBα△N腺病毒后,可通过抑制NF-κB的活性,增加K562/DNR细胞凋亡率,从而逆转K562/DNR细胞的耐药性。     

曲古抑菌素A下调人肺腺癌细胞A549内IDO表达的分子机制

【目的】研究曲古抑菌素A (-TSA)抑制γ干扰素（IFN-γ）诱导的人A549细胞内吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）表达的分子机制。【方法】 采用蛋白质免疫印迹技术检测TSA在IFN-γ诱导的A549细胞中IDO的表达、信号转导及转录激活子1（STAT1）的磷酸化和干扰素调节因子1（IRF-1）的激活等过程中的作用,在激光共聚焦显微镜下观察TSA对STAT1核转位的影响,利用双荧光素酶报告基因系统检测TSA对γ-干扰素激活位点（GAS）、干扰素刺激应答元件（ISRE）和核因子-κB （NF-κB）的激活的影响。【结果】 TSA以浓度依赖方式下调A549细胞中IFN-γ诱导的IDO表达,并能明显抑制STAT1第701位酪氨酸的磷酸化和STAT1的核转位。双荧光素酶报告基因分析和Western blot结果表明：TSA能显著抑制GAS、ISRE和IRF-1 的激活却不能抑制NF-κB的激活。【结论】TSA能下调IFN-γ诱导的A549细胞中IDO的表达,其机制可能是与其抑制STAT1的磷酸化和核转位,以及抑制STAT1与GAS的结合有关。     

TF-1细胞增殖特性与信号蛋白JAK2/STAT3表达研究

目的 探索JAK／STAT途径活化与细胞增殖和凋亡之间的关系。方法 通过表达内源性GM-CSF、受体的TF-1细胞，观察细胞增殖与凋亡；建立免疫沉淀和Western blot印迹方法，检测经GM-CSF100 ng／ml瞬时诱导的TF-1细胞信号蛋白JAK2和STAT3酪氨酸磷酸化情况。结果 经过GM-CSF刺激，细胞不但免于凋亡，TF-1细胞还呈现剂量与时间信赖性的增殖反应。当耗竭细胞因子6～12h后，倒置显微镜下TF-1细胞呈现折光性改变，细胞开始凋亡，呈现凋亡特征性形态改变和出现DNA梯形条带，而加入0．1ng／ml的GM-CSF，TF-1细胞即开始进入增殖状态，提示GM-CSF对细胞具有凋亡保护作用。经过100ng／ml GM-CSF的瞬时诱导，在分子量130kd区域见到JAK2蛋白条带，显示GM-CSF可诱导TF-1细胞磷酸化JAK2表达；而在分子量90kd区域未见到STAT3蛋白条带，显示无磷酸化STAT3表达；而未经GM-CSF诱导的TF-1细胞，既无磷酸化JAK2也无磷酸化STAT3表达。结论 GM-CSF、为TF-1细胞增殖诱导和凋亡保护所必需；GM-CSF诱导的TF-1细胞生物学效应涉及到胞浆信号分子JAK2磷酸化而非STAT3磷酸化。     

As203联用华蟾素对K562细胞Bcr—Abl磷酸化的影响

目的研究As2O3,联用华蟾素对K562细胞Bcr—Abl蛋白酪氨酸磷酸化的影响,探讨其抗白血病的分子机制,为As2O3和华蟾素联合应用治疗CML提供理论依据。方法采用细胞增殖实验检测细胞生长;采用Annexin—V／PI双染实验、DNAPI染色及DNA电泳等方法测定细胞凋亡;运用Westernblot检测K562细胞Bcr—Abl蛋白酪氨酸磷酸化水平。结果在As2O3,和华蟾素作用下K562细胞生长受抑伴随活力下降,1．0pmol／LAs：O,、0．125肛g／mL华蟾素、0．25斗g／mL华蟾素、1．0卜mol／LAs20,＋0．125肛g／mL华蟾素、1．0斗mol／LAs20,＋0．25斗g／mL华蟾素作用K562细胞24h和48h后,增殖抑制率分另0为（24-4-1．3）％、（21±1．5）％、（38-4-3．1）％、（57±2．7）％、（66±3-3）％及（49±2．9）％、（48±2．7）％、（61±2．1）％、（77±3．8）％、（82±4．2）％,细胞凋亡率分别为（4_8±0．5）％、（5．6±0．7）％、（9．8±0．6）％、（11．9-4-1．2）％和（15．2±1．5）％及（11．0±0．9）％、（12．9±1．1）％、（18．4±1．5）％、（21．0±2．0）％、（28．0±1．9）％,凋亡细胞百分率呈时间剂量依赖关系;DNA电泳出现“梯”状条带;Bcr—Abl蛋白酪氨酸磷酸化水平出现时间剂量依赖性下调。结论As,O,和华蟾素能诱导K562细胞凋亡和抑制其增殖,两药联用具有协同作用,机制与下调K562细胞Ber—Abl蛋白酪氨酸磷酸化有关。     

替米沙坦对脂多糖诱导3T3-L1脂肪细胞炎症通路的影响

目的 研究替米沙坦对脂多糖诱导3T1-L1脂肪细胞炎症通路的影响,探讨替米沙坦的抗炎机制.方法将3T3-L1脂肪细胞诱导至90%成熟,按随机数字表法分为6组:对照组、LPS组、LPS+替米沙坦(0.01、0.1、1和10μg/ml)组(n=18),向对照组细胞中加DMSO,LPS+替米沙坦组细胞中加入不同浓度替米沙坦,孵育2h后,LPS组和LPS+替米沙坦组再加入脂多糖(1 μg/ml),孵育1h,Western免疫印记法比较各组核蛋白NF-κBp65、总蛋白p-IκBα、IκBα、p-ERK1/2、ERK1/2、P-p38MAPK、p38 MAPK的表达水平.结果 脂多糖刺激后IκBα磷酸化蛋白表达增强(P＜0.05),细胞核内NF-κBp65蛋白表达增多(P＜0.05),MAPK通路相关蛋白ERK1/2磷酸化和p38MAPK磷酸化水平明显增强(P＜0.05),替米沙坦可抑制IκBα磷酸化和NF-κBp65核转位,p-IκBα蛋白表达和核蛋白NF-κBp65表达均降低,大剂量替米沙坦(10 μg/ml)作用时该作用明显(P＜0.05).替米沙坦干预后,p-ERK1/2和p-p38MAPK蛋白表达也受到明显抑制(P＜0.05),大剂量(10μg/ml)时作用明显(P＜0.05).结论 在3T3-L1脂肪细胞中,替米沙坦可以抑制NF-κB通路中IκBα蛋白磷酸化、NF-κBp65蛋白核转位以及MAPK通路中ERK1/2蛋白和p38MAPK蛋白的磷酸化,从而发挥抗炎作用.     

IL-6通过调控JAK2/STAT3信号通路减轻急性肺损伤的机制研究

目的探讨IL-6通过调控酪氨酸蛋白激酶2（JAK2）/信号传导与转录激活因子3（STAT3）信号通路减轻急性肺损伤（ALI）的机制。方法将人肺癌细胞A549细胞分为空白对照组、脂多糖（LPS）组、LPS+IL-6过表达组、LPS+IL-6干扰组、LPS+空载组。空白对照组细胞正常培养,LPS组LPS处理细胞,LPS+IL-6过表达组LPS处理细胞后转染IL-6过表达质粒,LPS+IL-6干扰组LPS处理细胞后转染IL-6干扰质粒,LPS+空载组LPS处理细胞后转染空载质粒。采用细胞计数试剂盒法检测细胞增殖率,流式细胞术检测细胞凋亡率和活性氧（ROS）水平,试剂盒检测丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）水平,ELISA法检测炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平,qRT-PCR法检测IL-6、JAK2、STAT3mRNA表达水平,Westernblot法检测磷酸化JAK2（p-JAK2）/JAK2、磷酸化STAT3（p-STAT3）/STAT3蛋白表达水平。结果与空白对照组比较,过表达IL-6可增加LPS诱导的ALI细胞凋亡率、ROS、MDA、TNF-α、IL-6、IL-1β水平,JAK2、STAT3mRNA表达水平,p-JAK2、p-STAT3蛋白表达水平,降低细胞增殖率和SOD水平;干扰IL-6则相反。结论IL-6可通过抑制JAK2/STAT3信号通路的激活,降低氧化应激和炎症反应,从而减轻ALI。     

Pyk2/PI3K/NF-κB在心脏成纤维细胞表型转化及迁移中的作用

目的 用短发夹RNA干扰技术选择性下调大鼠心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)中富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(prolein-rich tyrosine kinase 2,Pyk2)的表达,检测Pyk2/PI3K/NF-κB在细胞表型转化及迁移的作用.方法 利用Pyk2特异短发夹RNA质粒载体,转染血管紧张素Ⅱ刺激的原代培养大鼠心脏成纤维细胞.使用Transwell小室模型、体外划痕法检测细胞迁移变化,并结合免疫荧光观察α-平滑肌肌动蛋白表达变化.蛋白印迹法检测Pyk2和磷酸化磷酸肌醇3激酶(phosphoinositide-3-kinase,PI3K) p85亚基的蛋白水平,EMSA检测核转录因子κB(NF-κB)活性.结果 Transwell实验显示CFs跨膜细胞数随培养时间延长而上升,但Pyk2 shRNA转染组在不同时相点跨膜细胞数较对照组均明显减少,在6 h分别为[(19.1±6.1)和(30.8±8.6),P<0.05],在12 h分别为[(37.7±12.4)和(53.6±11.3),P<0.05],而在24 h分别为[(78.9±18.5)和(102.3±21.7),P<0.01].转染Pyk2 shRNA后α-平滑肌肌动蛋白表达明显受抑制,绿色阳性染色细胞的比例下降,荧光强度减弱.体外划痕法显示Pyk2 shRNA转染组细胞迁移距离明显下降,在24 h 分别为0.838 mm和1.213 mm(P<0.05),在48 h分别为1.626 mm和2.049 mm(P<0.01).Pyk2 shRNA转染组Pyk2和PI3K p85表达的相对条带强度较对照组减弱(0.47 vs 0.61,P<0.05),磷酸化PI3K p85表达水平也较对照组有明显降低(0.31 vs 0.42,P<0.05).NF-κB平均光密度分别为2.17和3.59(P<0.05).结论 Pyk2/PI3K/NF-κB可能是促进CFs向肌成纤维细胞表型转化和介导细胞迁移的重要信号途径,Pyk2可能成为防治心脏纤维化的新靶点.     

人核因子κBp65核定位信号缺失突变对A549细胞恶性表型的影响

目的鉴定人核因子κB(NF-κB)p65核定位信号(NLS)缺失突变质粒即pc DNA3.1(+)-NF-κBp65ΔNLS(简称NF-κBp65ΔNLS)的表达功能,以及其对低表达NF-κBp65的A549细胞株即A549/NF-κBp65 shRNA细胞增殖、迁移和粘附能力的影响。方法培养人A549/NF-κBp65 shRNA细胞株,分为对照组、转染pc DNA3.1(+)组、转染NF-κBp65ΔNLS组。应用间接免疫荧光、实时荧光定量-PCR和Western blot技术检测NF-κBp65的细胞内定位及mRNA、蛋白表达水平的变化;应用MTT、Transwell和细胞粘附实验分析转染NF-κBp65ΔNLS质粒对A549/NF-κBp65 shRNA细胞增殖、迁移、粘附能力的影响。结果成功构建人NF-κBp65ΔNLS真核表达质粒。转染NF-κBp65ΔNLS质粒的A549/NF-κBp65 shRNA细胞与对照组及转染pc DNA3.1(+)组比较,NF-κBp65 mRNA表达水平明显上调(10.63±0.84比1.04±0.21和1.23±0.22,P0.01),NF-κBp65蛋白表达水平明显升高(1.07±0.06比0.53±0.02和0.59±0.04,P0.01),且NF-κBp65蛋白主要位于细胞浆内,在肿瘤坏死因子α刺激后NF-κBp65蛋白并未明显进入细胞核。与对照组及转染pc DNA3.1(+)组比较,转染NF-κBp65ΔNLS质粒的A549/NF-κBp65 shRNA细胞的增殖、迁移和粘附能力均有不同程度增强。结论通过基因突变技术构建无NLS的NF-κBp65真核表达质粒,可明显增强A549/NF-κBp65shRNA细胞株内NF-κBp65 mRNA和蛋白的表达水平,并使NF-κBp65蛋白定位于细胞浆内;同时,细胞浆内过表达NF-κBp65ΔNLS蛋白可明显增强A549/NF-κBp65 shRNA细胞的增殖、迁移和粘附能力,提示滞留于细胞浆内的NF-κBp65仍可通过影响NF-κB信号通路相关蛋白参与调节肺癌细胞的生物学行为。