microRNA-155在缺氧肺癌脑转移中的作用

  目的  明确缺氧与肺癌细胞释放microRNA-155的关系, 揭示肺癌脑转移的可能机制。  方法  建立人A549肺癌细胞缺氧模型，缺氧培养肺癌细胞0.5、2、4、8、12和24 h(并设同期常氧对照组)后，免疫荧光法和Western blot法测定肺癌细胞内热休克蛋白70 (hsp70)的表达水平；建立hsp70过表达的人肺癌细胞株A549/hsp70，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法测定缺氧各时点A549细胞和A549/hsp70细胞培养液内microRNA-155含量。构建体外血脑屏障模型，给予缺氧不同时间点的A549肺癌细胞培养液后，辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)检测体外血脑屏障模型的通透性变化；自动细胞计数仪计数Transwell下室培养液中的A549肺癌细胞数。将缺氧不同时间点的A549肺癌细胞培养液经尾静脉注入Wistar大鼠体内，Western blot法测定紧密连接蛋白occludin在脑组织血脑屏障内皮细胞中的表达水平；伊文思兰检测动物血脑屏障通透性改变。  结果  肺癌细胞缺氧8 h时，肺癌细胞内hsp70和培养液内microRNA-155的表达均达最高水平(P < 0.05)。与A549细胞相比，缺氧2~24 h时，A549/hsp70细胞培养液内microRNA-155含量的增加更显著。缺氧8 h，血脑屏障通透性最大，透过血脑屏障模型的肺癌细胞数最多。在动物水平，给予缺氧8 h的肺癌细胞培养液后，动物脑组织血脑屏障内皮细胞的occludin表达最低，且此时实验动物的血脑屏障通透性亦最大。  结论  缺氧可引起肺癌细胞内hsp70生成增多，促进了microRNA-155的表达，进而导致血脑屏障occludin表达减少，血脑屏障通透性增大，最终引起肺癌细胞转移入脑。     

缺氧诱导因子-1α对肺癌脑转移的作用及其机制的研究

目的探讨缺氧与肺癌细胞释放缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的关系,揭示肺癌脑转移的可能机制。方法建立A549肺癌细胞缺氧模型,缺氧培养A549细胞0.5、2、4、8、12 和24 h（设同时点常氧培养为对照组）后,ELISA法测定A549细胞培养液内HIF-1α质量浓度。Transwell小室构建体外血脑屏障模型,A549细胞培养液缺氧不同时间后,检测体外血脑屏障模型的跨内皮阻抗（TER）变化,以反映体外血脑屏障通透性的改变;计数Transwell下室培养液中的A549细胞数。将缺氧不同时间的A549细胞培养液经尾静脉注入Wistar大鼠,伊文思兰检测动物血脑屏障通透性改变; Western blot 法测定紧密连接相关蛋白Claudin-5在大鼠脑组织中的表达变化。结果与对照组比较,A549细胞缺氧培养2 h后,其细胞培养液内HIF-1α质量浓度增高,体外血脑屏障模型TER减小,穿过Transwell进入下室的缺氧A549细胞数增多（P均＜0.05）,以缺氧8 h时上述作用最明显（P＜0.01）,24 h恢复至对照组水平。在大鼠体内实验中,与同时点对照组比较,尾静脉注入缺氧2 h 的A549细胞培养液后,大鼠脑组织中伊文思兰质量百分比增加,大鼠脑组织中Claudin-5蛋白表达降低（P均＜0.05）,并且以注入缺氧8 h的A549细胞培养液作用最明显（P＜0.01）,注入缺氧24 h的A549细胞培养液则与同时点对照组水平相当。结论缺氧可引起肺癌细胞释放HIF-1α增多。增多的HIF-1α导致血脑屏障紧密连接蛋白Claudin-5表达减少,血脑屏障通透性增大,肺癌细胞转移入脑。     

大鼠脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养血脑屏障体外模型的建立

[目的]建立大鼠脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养血脑屏障体外模型。[方法]采用原代培养脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养方法建立血脑屏障体外模型。[结果]星形胶质细胞与脑微血管内皮细胞共培养可提高血脑屏障特异性酶——γ-谷胺酰胺转肽酶、碱性磷酸酶的表达,提高脑微血管内皮细胞跨细胞间电阻。[结论]成功建立脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养血脑屏障体外模型,而且较单层内皮细胞模型更接近在体状态。     

12外泌体对体外血脑屏障模型功能的影响

目的在体外建立血脑屏障模型,研究非小细胞肺癌a549细胞来源的外泌体对血脑屏障模型功能的影响。方法利用小鼠脑微血管内皮细胞与星型胶质细胞建立体外血脑屏障模型。模型建立后通过4 h渗漏实验鉴定是否成模。建模成功后分为对照组与实验组,将利用超速离心法及Exo-spin试剂盒分离提纯的非小细胞肺癌A549细胞培养基中外泌体接种至实验组Transwell上室,置于培养箱孵育,分别于共培养24 h、48 h、72 h后进行跨内皮电阻检测实验及48 h辣根过氧化物酶渗透试验,以评估体外血脑屏障模型的功能。结果 (1) 80%血脑屏障模型在建立建模成功;(2) 2组TEER值比较24 h后2组间差异无统计学意义(P> 0.05);48 h后实验组TEER降低,与对照组比较差异有统计学意义(P <0.01);72 h后实验组TEER进一步降低且与对照组相比差异有统计学意义(P <0.01);(3)共培养48 h后实验组通透性较对照组明显升高,差异有统计学意义(P <0.05)。结论人非小细胞肺癌细胞外泌体可以影响小鼠体外血脑屏障模型的功能,人非小细胞肺癌细胞外泌体可使BBBM通... 更多     

MEG8对阿尔茨海默病微环境下血脑屏障通透性的影响及其作用机制

目的 探讨长链非编码RNA—MEG8对阿尔茨海默病（AD）微环境下血脑屏障通透性的影响及作用机制。方法 应用β淀粉样蛋白（Aβ）处理人脑微血管内皮细胞hCMEC/D3 (AD-ECs),模拟体外AD微环境下血脑屏障。实时荧光定量PCR检测正常人脑微血管内皮细胞（ECs）和AD-ECs中MEG8的表达。稳定转染沉默MEG8质粒后,应用微孔电阻系统检测跨内皮阻抗（TEER）,TMB显色法测量辣根过氧化物酶（HRP）渗出量。免疫荧光法比较对照组、转染MEG8阴性对照组（sh-NC组）、转染MEG8沉默质粒组（sh-MEG8组）紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin的分布变化,Western blotting检测ZO-1和occludin的表达。结果 MEG8在ADECs中的表达显著高于ECs (P <0.01)。与sh-NC组比较,sh-MEG8组TEER值显著升高,HRP渗出量显著降低（均P <0.01）。紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin在AD-ECs边界呈现相对连续的分布。与sh-NC组比较,sh-MEG8组紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin的表达显著增...     

大鼠原代脑微血管内皮细胞体外分离与培养的实验研究

目的 探讨获取大鼠脑微血管内皮细胞(BMEC)的简单、有效方法,为构建体外血肿瘤屏障(BTB)模型提供材料.方法 采集出生3～5 d的Wistar胎鼠大脑皮质,应用酶消化法及葡聚糖离心法获得脑微血管段后,接种于培养皿中进行原代培养,采用倒置显微镜对所培养的细胞进行形态学观察;以Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色法鉴定细胞;将BMEC与C6脑胶质瘤细胞共培养,构建体外BTB模型,并采用免疫组化法和免疫荧光法检测BMEC间紧密连接相关蛋白occludin的表达.结果 体外培养2h时脑微血管段贴壁,12～48 h见圆形生发中心形成,2～3d单层内皮细胞自生发中心长出,4～5 d见较大单层内皮细胞团,5～7 d可见融合成片的内皮细胞单层,外观呈“铺路石”样;第Ⅷ因子免疫组化结果显示“铺路石”样细胞胞质呈棕黄色染色;紧密连接相关蛋白occludin的免疫组化和荧光结果证明共培养的BMEC间表达BTB的特性.结论 本方法能成功地进行大鼠原代BMEC培养,构建大鼠体外BTB模型,进而应用于BTB的生理、生化及药理学研究.     

豚鼠耳蜗微血管内皮细胞体外通透性的研究

目的　研究豚鼠耳蜗微血管内皮细胞的体外通透性特征。方法　在成功建立豚鼠耳蜗微血管内皮细胞体外通透性模型的基础上 ,研究该体外模型跨细胞电阻及对12 5I 牛血清白蛋白的通透性。结果　①耳蜗微血管内皮细胞在培养增殖过程中其跨细胞电阻呈动态变化过程 ,以 5× 10 4/cm2 的细胞密度接种时 ,7d左右电阻到达峰值 ,其跨细胞电阻峰值大小为 (118 9± 18 5 )Ω/cm2 ;②体外模型中加入12 5I 牛血清白蛋白后 ,其通透性呈上升期抛物线型曲线 ,90min内几乎呈直线。结论　跨细胞电阻及对12 5I 牛血清白蛋白变化曲线能反映体外耳蜗微血管内皮细胞的通透性特征     

小窝蛋白-1对N-甲基-D天冬氨酸诱导的脑微血管内皮细胞紧密连接蛋白带状闭合蛋白1的破坏作用研究

目的:探索小窝蛋白(Cav)-1对N-甲基-D天冬氨酸(NMDA)诱导的脑微血管内皮细胞紧密连接蛋白带状闭合蛋白1(ZO-1)和血脑屏障完整性的破坏作用.方法:体外培养人脑微血管内皮细胞HBEC-5i并构建血脑屏障模型.以不同浓度的NMDA孵育HBEC-5i,并观察其对细胞活力的影响.细胞分别用NMDA受体(NMDAR...     

补铁对生长发育期铅接触大鼠血脑屏障通透性的影响

目的: 探讨补铁对生长发育期慢性铅接触大鼠血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)通透性及内皮细胞紧密连接蛋白的影响.方法: 选择 21 d龄的雄性SD大鼠38只,随机分为对照组(n=10)、染铅组(n=14)和补铁且染铅组(n=14).除对照组外,其他两组均自由饮用含400 mg/L的Pb(AC)2水溶液;补铁且染铅组以20 mg/kg浓度的FeSO4水溶液隔日进行ig,其他两组以相同的方法隔日用去离子水ig.饲养6 wk后,检测大鼠的血红蛋白和血铅含量,用硝酸镧示踪法观察血脑屏障的通透性,并测定脑组织内皮细胞紧密连接蛋白occludin的表达.结果: 补铁且染铅组与染铅组相比,大鼠的血红蛋白含量显著增高(P<0.05),血铅含量显著降低(P<0.05);电镜下观察可见,染铅组大鼠毛细血管内的镧盐颗粒穿过血脑屏障进入到脑组织内,而补铁且染铅组与对照组均未见镧盐颗粒渗透过血脑屏障.同时,补铁且染铅组内皮细胞紧密连接蛋白occludin的表达水平与染铅组相比明显增加.结论: 生长发育期铅接触可使血脑屏障通透性增加,脑毛细血管内皮细胞紧密连接蛋白occludin表达降低可能是血脑屏障通透性改变的主要分子机制之一;铅接触的同时适量补充铁元素,可保护由慢性铅接触所造成的血脑屏障紧密连接的损伤.     

星形胶质细胞水通道4表达变化与胶质瘤性脑水肿的关系

目的研究脑胶质瘤细胞对体外血脑屏障模型水转运及星形胶质细胞水通道4的影响。方法利用重水的荧光特性及高效液相系统检测体外血脑屏障模型对水转运的变化。采用半定量RT-PCR的方法分析胶质瘤细胞作用后星形胶质细胞水通道4的表达变化。结果胶质瘤细胞可以明显增强体外血脑屏障模型对水由内皮细胞腔面至基底面的扩散。这一过程不依赖于白蛋白等大分子物质的通透性变化。同时,胶质瘤细胞明显降低了胶质细胞水通道4的表达水平。结论胶质瘤细胞可以明显增强体外血脑屏障模型对水由内皮细胞腔面向基底面的扩散。胶质瘤性脑水肿不一定是血浆中大分子物质通透性增加的结果。胶质瘤细胞对胶质细胞水通道4的影响可能是胶质瘤性脑水肿产生的分子机制之一。     

Detrimental Effect of Electromagnetic Pulse Exposure on Permeability of In Vitro Blood-brain-barrier Model

Objective To study the effect of electromagnetic pulse (EMP) exposure on permeability of in vitro blood-brain-barrier (BBB) model. Methods An in vitro BBB model, established by co-culturing brain microvascular endothelial cells (BMVEC) and astroglial cells (AC) isolated from rat brain, was exposed to EMP at 100 kV/m and 400 kV/m, respectively. Permeability of the model was assayed by measuring the transendothelial electrical resistance (TEER) and the horseradish peroxidase (HRP) transmission at different time points. Levels of BBB tight junction-related proteins were measured at 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24 h after EMP exposure by Western blotting. Results The TEER level was lower in BBB model group than in control group at 12 h after EMP, exposure which returned to its normal level at 24 h. The 24 h recovery process was triphasic and biphasic respectively after EMP exposure at 100 kV/m and 400 kV/m. Following exposure to 400 kV/m EMP, the HRP permeability increased at 1-12 h and returned to its normal level at 24 h. Western blotting showed that the claudin-5 and ZO-1 protein levels were changed after EMP exposure. Conclusion EMP exposure at 100 kV/m and 400 kV/m can increase the permeability of in vitro BBB model and BBB tight junction-related proteins such as ZO-1 and claudin-5 may change EMP-induced BBB permeability.     

肿瘤坏死因子α对急性肝功能衰竭小鼠中血脑屏障紧密连接的影响及机制

目的探讨急性肝功能衰竭中肿瘤坏死因子α(TNF-α)对血脑屏障(BBB)渗透性的影响。方法通过施加D-氨基半路糖(D-GalN)和脂多糖或D-GalN和TNF-α形成急性肝功能衰竭小鼠模型。通过依文思蓝染色研究BBB的渗透性,并在电镜下观察其形态改变。Western blot检测Occludin蛋白的表达。结果在急性肝功能衰竭小鼠中BBB渗透性增加,电镜下观察到组织的紧密连接瓦解和内皮细胞皱缩,并伴随囊泡和空泡增加。此外,急性肝功能衰竭小鼠的脑组织紧密连接相关蛋白Occludin的表达显著降低。结论 TNF-α在急性肝功能衰竭小鼠脑水肿中的形成过程中起到重要的作用,BBB渗透性增加可能是由于紧密连接丧失和其相关蛋白Occludin下调所致。     

老年小鼠血脑屏障在术后认知功能障碍中的作用

 目的    观察老年小鼠在异氟醚暴露或阑尾切除术后学习和记忆能力变化及海马区血脑屏障通透性变化情况,寻找血脑屏障改变的原因。方法    30只C57BL 老年小鼠(18月龄)随机分为3组:对照组(C组)不予任何干预,手术组(S组)接受阑尾切除术,吸入组(I组)吸入异氯醚。采用伊文思蓝(Evans-blue,EB)透过率检测各组海马区血脑屏障通透性的改变,并通过Western blot检测occludin和claudin-5 蛋白,观察手术后紧密连接蛋白的变化,检测MMP-2和MMP-9的改变。结果    相比于吸入组及对照组,手术组的潜伏期延长,平台穿越次数减少,EB透过率增加,紧密连接蛋白occludin表达减少,MMP-2和MMP-9表达增加。结论    通过增加MMP-2和MMP-9的表达,引起紧密连接蛋白occludin表达的减少,并导致血脑屏障破坏,最终引起术后认知功能障碍的发生。     

Effect of thrombin on blood brain barrier permeability and its mechanism

Muchattentionhasbeengiventothrombin (TM )inthestudyofthepathogenesisofbrainedemaafteranintracerebralhemorrhage (ICH) PreviousstudieshaveindicatedthatanintracerebralinjectionofTMinducesmarkedbrainedema ,aneffectthatisreducedbytheTMinhibitorhirudin Therefore,TMmayplayamajorroleinbrainedemaafterICH However,themechanismbehindTM inducedbrainedemaispoorlyunderstood Inthisstudy ,wesoughttofurtherinvestigatetheeffectofTMonbloodbrainbarrier(BBB ) permeabilityandinvestigateits possiblemechanis…     

中药补阳还五汤对沙鼠脑缺血再灌注损伤及微循环障碍的治疗作用

目的 探讨中药补阳还五汤对脑缺血再灌注损伤的治疗作用及机制.方法 48只长爪沙鼠随机分成假手术组、脑缺血再灌注损伤模型组、补阳还五汤治疗组.夹闭沙鼠双侧颈总动脉45 min后松开夹子造成脑缺血再灌注损伤模型,干预组术前30 min、术后24 h后每天1次腹腔内注射补阳还五汤25.74 mg/kg,连续给药7 d,应用激光多普勒血流计观察脑组织血流量变化;单宁酸-氯化铁媒染标记微血管密度;伊文思蓝法标记微血管通透性;干湿法测定脑组织含水量;4-PTT旱路迷宫法(4-pellet taking test)评定沙鼠的学习记忆功能.结果 与模型组比较,补阳还五汤能够增加缺血1、5 min海马区血流量(P＜0.05),抑制再灌注15 min的急性高灌注,增加再灌注30、60、120 min延迟性低灌注期的血流量(P＜0.05);减轻脑缺血45 min再灌注48 h的脑微血管结构破坏程度,抑制血管通透性增加,减轻脑组织含水量(P＜0.05);4-PTT早路迷宫实验显示,补阳还五汤可改善沙鼠脑缺血再灌注损伤后的学习记忆能力(P＜0.05).结论 补阳还五汤对脑缺血再灌注损伤有很好的治疗作用,其机制与改善缺血再灌注损伤后的微循环障碍有关.     

丹酚酸B对缺糖缺氧／复糖复氧的体外血脑屏障模型的影响

目的：探讨丹酚酸 B 对体外血脑屏障缺糖缺氧／复糖复氧的保护作用。方法利用人脑微血管内皮细胞与 C6细胞非接触共培养建立体外血脑屏障模型并分为正常组、实验组和给药组。利用无糖 Earle′s 液代替培养液在93％ N2、2％ O2和5％ CO2条件下孵育2 h 模拟缺糖缺氧环境。辣根过氧化物酶通透性实验检测血脑屏障通透性变化。免疫荧光和电子显微镜观察紧密连接变化情况。结果给药组对辣根过氧化物酶的通透性明显低于实验组（P ＜0．05）;免疫荧光和超微结构图片显示正常的紧密连接连续和致密,而实验组紧密连结中断和疏松,给药组介于二者之间。结论丹酚酸 B 能直接保护缺糖缺氧／复糖复氧引起的血脑屏破坏和降低通透性,为丹酚酸 B 对血脑屏障的保护机制提供的研究基础。