增强型绿色荧光蛋白原核表达纯化与多克隆抗体的制备

目的：进行增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的克隆、原核表达和纯化以及多克隆抗体的制备，为以后纯化EGFP融合蛋白奠定基础。方法：构建pGEX-4T3—EGFP重组质粒，在大肠杆菌BL21中进行原核表达，用亲和层析法纯化GST—EGFP，免疫BAB／c小鼠制备EGFP多克隆抗体。结果：①目的蛋白GST—EGFP表达量为8g／L。②获得纯抗体溶液5m1。浓度为0．4g／L。③EGFP抗体在1：100000稀释度时，Western blot检测条带清晰，背景干净。结论：通过优化诱导条件，利用大肠杆菌可低成本获得大量GST—EGFP。直接使用GST—EGFP融合蛋白免疫BAB／c小鼠，可在较短时间内大量制备EGFP多克隆抗体。     

李斯特菌载体结核疫苗候选株基因重组构建及蛋白表达验证

目的 基因重组构建以单增李斯特菌、绵羊李斯特菌为载体的新型结核疫苗候选株,并进行蛋白表达验证,为结核疫苗研究和结核防控提供新思路和新方法。方法 以体外基因连接、质粒转化等技术,将本实验室已有的分别编码结核抗原Ag85C、ESAT-6蛋白的两种基因盒,插入携带单增李斯特菌、绵羊李斯特菌同源序列的打靶质粒中。将打靶质粒电转化单增李斯特菌、绵羊李斯特菌,在42 ℃和30 ℃连续传代,利用同源重组杂交原理和基因打靶技术,将打靶质粒携带的两种编码结核抗原的抗原基因盒,分别整合至致病基因（actA和plcB）被敲除的单增李斯特菌、绵羊李斯特菌减毒株及未经减毒的绵羊李斯特菌基因组中。重组菌经蓝白斑、抗生素抗性及PCR筛选,再经Western blot检测其菌体蛋白及分泌蛋白的表达情况。结果 构建了携带抗原基因盒的重组菌株5株,其重组基因序列PCR验证结果均符合预期,且测序验证成功;重组菌不携带红霉素抗性基因,表型特征符合预期;其中,重组菌Li-Rv0129c、Li-ΔactAplcB-Rv0129c按预期表达了结核杆菌Ag85C抗原蛋白,Li-ΔactAplcB-Rv3875按预期表达了结核杆菌ESAT-6抗原蛋白,Lm重组菌未表达相应结核抗原蛋白。结论 成功构建并筛选得到3株以绵羊李斯特菌为载体的、携带结核杆菌Rv0129c（编码Ag85C）抗原基因盒或Rv3875（编码ESAT-6）抗原基因盒,且表达相应抗原蛋白的新型结核疫苗候选株。     

绵羊李斯特菌载体结核疫苗株inlB1基因缺失减毒株的构建及评价

目的 对以绵羊李斯特菌（Listeriaivanovii,LI）为载体的结核疫苗候选株LI-Ag85C进行基因减毒,初步评价其体内外生物学特性。方法 构建含有inlB1基因上、下游同源序列的打靶质粒,电转原始菌LI-Ag85C感受态细胞,同源重组敲除inlB1基因;测定减毒株LIΔinlB1-Ag85C和原始株LI-Ag85C的体外生长曲线;测定两株菌对于肝癌细胞系HepG2细胞的黏附、侵袭能力的影响,比较两株菌溶血能力的差异,两株菌对于小鼠的半数致死量（median lethal dose,LD50）差异。结果 敲除inlB1基因的重组结核疫苗候选株LIΔinlB1-Ag85C的基因序列符合预期结果。减毒株与原始株的体外生长情况基本一致;对于HepG2细胞的黏附率分别为6.66%和7.46%,侵袭率分别为0.031%和0.042%,减毒株的黏附、侵袭能力均低于原始株,但差异无统计学意义;减毒株的溶血活性较原始株无明显变化;对小鼠的LD50值分别为3.2×108 CFU/只和6.7×107 CFU/只,减毒株LD50相较于原始株明显提高。结论 成功构建inlB1基因缺失的新型结核疫苗候选株LIΔinlB1-Ag85C,其毒力较原始株降低。     

绿色荧光蛋白表达质粒的构建及鉴定

目的构建能表达绿色荧光蛋白的载体———pCDNA3.1-GFP。方法使用基因重组方法从质粒pGreenlantern中获取绿色荧光蛋白基因片段,克隆入PCDNA3.1的多克隆区,构建成PCDNA3.1-GFP,通过限制性核酸内切酶NotI与BamHI对所建质粒进行分析后,转染HepG2细胞并观察绿色荧光蛋白表达。结果经限制性内切酶及转染HepG2细胞表达鉴定,证实成功构建了PCDNA3.1-GFP。结论成功构建成携有绿色荧光蛋白报告基因哺乳动物表达载体,该质粒可用于融合表达目的蛋白,并将目的蛋白表达定位。     

增强型绿色荧光蛋白原核表达载体的构建及表达

目的 构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为标记的原核表达栽体,并观察EGFP基因在大肠杆菌中的表达情况.方法 据已知的EGFP基因序列,设计引物,并引入Nde Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点.采用PCR技术从含有EGFP的质粒pEGFP-C1中克隆EGFP编码序列;将其亚克隆入表达载体pTWIN1,得到以EGFP为标记的原核表达载体pTWIN-EGFP.转化大肠杆菌ER2566菌株,IPTG诱导EGFP基因表达.结果 经过IPTG诱导后,细菌培养物在长波紫外线的照射下,发出明亮的绿色荧光.结论 成功构建了原核表达载体pTWIN-EGFP,为应用EGFP作为报告基因和筛选标记奠定了实验基础.     

hTEFT重组绿色荧光表达载体的构建与表达

目的构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)片段的真核表达质粒。方法用RT-PCR方法从肝癌组织中提取总RNA扩增出hTERT基因片段,将其连接pGEM-TEasy质粒上,将重组质粒pGEM-T-hTERT和pEGFP-C3真核绿色荧光蛋白表达载体同时用HindⅢ和BamHⅠ双酶切后进行连接,再将重组的pEGFP-C3-hTERT基因片段转染NIH3T3细胞,经G418筛选获得稳定转染的细胞系,荧光倒置显微镜观察并检测转染细胞的hTERTmRNA表达水平。结果DNA序列分析证实了重组载体pGEM-T-hTERT和pEGFP-C3-hTERT内插入片段的碱基组成与公开发表的hTERT序列一致。转染pEGFP-C3-hTERT的NIH3T3细胞可见绿色荧光,并检出高水平表达的hTERT。结论成功构建高效表达hTERT的真核表达载体,为以hTERT为靶点的肿瘤治疗打下实验基础。     

绿色荧光蛋白报告基因与ZNF580基因重组真核表达载体的构建与鉴定

【目的】构建具有绿色荧光蛋白报告 (GFP)基因的ZNF5 80真核表达载体 ,为转染细胞提供基础。【方法】根据ZNF5 80cDNA序列的开读框架设计上、下游引物 ,利用PCR技术扩增ZNF5 80cDNA开放阅读框序列 ,将PCR目的片段与PGEM T载体连接并克隆 ,酶切含目的片段PGEM T质粒及 pEGFP C1载体 ,回收纯化后做定向克隆连接 ,BglⅡ及HindⅢ双酶切电泳筛选、鉴定并测序。【结果】酶切 pEGFP C1 ZNF5 80 ,电泳分析插入片段长度为 :5 2 4bp ,与预期的结果一致 ,经连接点两端进行测序 ,测序结果显示接头两端序列连接正确。【结论】成功构建真核表达载体pEGFP C1 ZNF5 80。     

含绿色荧光蛋白基因与人疱疹病毒8型K12基因重组真核表达载体的构建

目的：构建含绿色荧光蛋白（GFP）基因与人疱疹病毒8型K12基因重组真核表达载体。方法：将人疱疹病毒8型（HHV－8）K12基因插入到真核表达质粒pCR3.1的EcoRI和XhoI位点，构建重组质粒pCR-K12；PCR扩增GFP基因，将GFP基因插入到重组质粒pCR-K12中K12上游的KpnI和EcoRI位点中，获得重组表达质粒pCR-GFP-K12。结果：重组表达质粒pCR-GFP-K12的酶切鉴定符合预期结果，此重组质粒中的K12与GFP融合表达并受上游启动子pCMV控制。结论：重组表达质粒pCR-GFP-K12已构建成功，为研究K12的生物学活性及春作用机制打下基础。     

野生型DNA聚合酶β重组绿色荧光蛋白表达载体的构建

目的：构建携带野生型DNA聚合酶β基因(wtDNA polβ)的重组真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP—C3——polβ。方法：运用PCR方法，从质粑pcDNA3．1-polβ中扩增出wtDNA polβ的开放阅读框序列，T-A克隆至pGEM—T载体，再定向克隆至pEGFP—C3，重组质粒pEGFP—C3—polβ用限制性内切酶酶切鉴定，通用鉴定引物PCR扩增鉴定，并进行DNA序列分析。结果与结论：多种鉴定方法让实了重组载体pEGFP—C3—polβ中的wtDNA polβ序列与GenBank中已知的序列相符。携带wtDNA polβ的重组增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP—C3—polβ构建成功。     

ILO与LLO协助李斯特菌黏附、侵袭细胞及胞内增殖的比较研究

目的研究李斯特菌溶血素的主要功能,比较两种李斯特菌——绵羊李斯特菌（Listeria ivanovii,LI）和单增李斯特菌（Listeria monocytogenes,LM）的溶血素对细菌黏附细胞等作用的强弱。方法构建含有LI i-hly基因上、下游同源序列和lacZ基因或hly基因的打靶质粒,利用基因重组技术构建LI溶血素（ILO）缺陷的LI重组菌株LIΔi-hly∷lacZ和回补表达LM溶血素（LLO）的重组菌株LIΔi-hly∷hly;比较2株重组菌与野生LI对人肝癌HepG2细胞的黏附、侵袭能力;比较3株菌在巨噬细胞RAW264.7内的增殖能力。结果重组菌株LIΔi-hly∷lacZ和LIΔi-hly∷hly的基因序列与预期相符;LIΔi-hly∷hly、LI和LIΔi-hly∷lacZ对HepG2细胞的黏附率分别为（3.43±0.82）%、（3.43±1.59）% 和（3.41±1.12）%,侵袭率分别为（1.74±0.46）%、（1.22±0.75）% 和（1.39±0.46）%,差异均无统计学意义;胞内增殖实验结果表明,与野生株相比,ILO缺陷株LIΔi-hly∷lacZ在巨噬细胞内的增殖量降低,LIΔi-hly∷hly的增殖量升高。结论LI在细胞内的增殖水平与ILO有关,ILO缺失抑制了LI在细胞内的增殖能力,LM溶血素LLO协助细菌逃离吞噬泡进入宿主细胞质的能力强于LI溶血素ILO。     

绵羊李斯特菌为载体的结核多阶段T细胞表位疫苗的构建及评价

  目的  构建以绵羊李斯特菌（Listerria ivanovii,LI）为载体的表达结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）特征性抗原蛋白的疫苗候选菌株,并评价其生物安全性和免疫效果。  方法  将MTB早期感染、潜伏感染和复发阶段的4种抗原基因的细胞表位串联形成融合抗原基因,即多阶段结核杆菌抗原基因,命名为msv。将msv插入含有LI同源序列的打靶质粒,利用同源重组技术构建基因组整合msv抗原基因的重组LI菌株。观察重组菌株的体外生长情况,通过Western blot验证靶抗原蛋白的表达情况,测定重组菌株对C57BL/6小鼠的半数致死量（50% lethal dose,LD₅₀）,以0.1×LD₅₀为免疫剂量,通过尾静脉接种小鼠,通过接种前及接种后1、2、3、5、7、14 d的血清谷丙转氨酶（ALT）水平、脏器载菌量和脏器病理切片评价疫苗候选株的安全性。为测定疫苗候选株的免疫效果,另取3组小鼠分别尾静脉免疫LI-msv、LI、NS,免疫后第9天制备脾悬液,流式细胞术检测分泌干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-2（IL-2）等细胞因子的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞水平。  结果  成功构建能表达多阶段结核杆菌抗原的疫苗候选株LI-msv。LI-msv 对C57BL/6小鼠的LD₅₀为3.3×108 CFU/只。通过尾静脉接种小鼠后,LI-msv主要在小鼠肝脏和脾脏内短期繁殖,7 d后能被机体清除,对肝、脾的病理损伤时间短且可恢复;流式细胞术检测结果表明接种LI-msv的小鼠脾淋巴细胞分化出了特异的IFN-γ+ CD4+ T细胞和IFN-γ+ CD8+ T细胞,阳性细胞比率较相应载体对照组和生理盐水对照组高（P<0.005）;特异性TNF-α+ CD4+ T细胞比率高于相应载体对照组（P<0.01）和生理盐水对照组（P<0.005）,TNF-α+ CD8+ T细胞比率高于生理盐水对照组（P<0.005）。  结论  成功构建了一株以LI为载体的表达结核杆菌多阶段抗原的疫苗候选株。该菌株具有生物安全性,且能诱导一定的特异性细胞免疫应答,有望作为结核疫苗候选株进行深入研究。     

铜绿假单胞菌重组Bb-pGEX-OprI疫苗的构建及其保护力的研究

目的 构建并鉴定含有铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, Pa）外膜蛋白I（OprI)基因与两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum, Bb）疫苗 （Bb-pGEX-OprI）,并研究该疫苗对小鼠Pa感染的保护作用。方法 PCR扩增OprI抗原编码基因并将其定向克隆至pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-OprI,将pGEX-OprI电穿孔转化Bb,构建Bb-pGEX-OprI疫苗,进行双酶切、PCR和测序鉴定后,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分别分析并鉴定表达产物。21只小鼠随机分为3组,分别灌胃接种Bb-pGEX-OprI 疫苗、空载体疫苗（Bb-pGEX-1λT)和Bb。首次免疫后4周用PA01株攻击。攻击后2周处死小鼠取肺组织,计数肺组织的细菌菌落数。免疫前、首次免疫后4周和PA01株攻击后2周采小鼠静脉血,常规ELISA检测血清IgG及其亚类和IgE。结果 PCR成功扩增出194 bp的OprI抗原编码基因;双酶切、PCR和测序证实OprI基因成功克隆入pGEX-1λT中,并且pGEX-OprI成功转化Bb,构建为Bb-pGEX-OprI疫苗;SDS-PAGE显示Bb-pGEX-OprI 表达相对分子质量约32×103的OprI-谷胱甘肽转移酶（GST）融合蛋白;Western blot证实融合蛋白能被Pa感染的鼠血清特异性识别。Bb-pGEX-OprI疫苗组小鼠肺组织的细菌菌落数低于Bb-pGEX-1λT组和Bb组（P<0.01）,Bb-pGEX-OprI疫苗组小鼠血清IgG、IgG2b、IgG3和IgE水平在首次免疫后4周和攻击后2周依次升高,相同时间点Bb-pGEX-OprI疫苗组小鼠血清抗体水平均高于Bb-pGEX-1λT和Bb组（P＜0.01或P<0.05）。结论 成功构建了重组疫苗Bb-pGEX-OprI,其在小鼠抗Pa感染过程中可产生有效的体液免疫应答。     

重组幽门螺杆菌多表位疫苗工程菌株的构建及其微生物学特性研究

目的 构建含有幽门螺杆菌尿素酶（\ureI、ureB）及霍乱毒素B亚单位（\ctB）融合片段的多表位疫苗工程菌,并研究其微生物学特性。方法 通过生物信息学方法从\ureI、ureB基因中筛选出T细胞和B细胞优势表位,通过柔性Linker相连,并在其N端加入分子内佐剂序列\ctB,按照大肠杆菌BL21(DE3)的密码子偏好性进行密码子优化,即为BIB序列。人工合成之后,插入原核表达质粒pET28a(+)中,构建pET28a(+)/\ctB-ureI-ureB〔pET28a(+)/BIB〕重组质粒。经限制性内切酶酶切鉴定及DNA测序鉴定正确后,将质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中。BIB工程菌经乳糖诱导表达后,SDS-PAGE检测重组蛋白BIB的表达情况,并对其N端氨基酸序列和相对分子质量进行测定,Western blot对其进行抗原性鉴定。结果 原核表达质粒pET28a(+)/BIB经双酶切和测序鉴定构建正确,SDS-PAGE电泳显示在相对分子质量33×10^\3处有一条明显条带,其N端氨基酸序列和相对分子质量与设计序列100%一致,Western blot结果显示BIB可以与抗幽门螺杆菌悉尼株（SS1株）小鼠血清及鼠抗CTB单抗产生特异性反应。结论 成功构建了幽门螺杆菌多表位重组原核表达工程菌,该工程菌表达的BIB蛋白抗原性良好。     

嗜肺军团菌mip/flaA二联优势抗原表位基因融合表达载体的构建及表达

目的 选取嗜肺军团菌mip/flaA优势抗原表位基因,构建mip/flaA二联优势抗原表位基因融合表达载体,并在原核系统中表达,为后续制备嗜肺军团菌蛋白疫苗提供初步的实验基础。方法 运用生物信息学方法对Mip和FlaA蛋白的二级结构和表面特性如理化性质、亲水性、可塑性、抗原指数以及胞外区等方面进行分析,选择其活性表位可能存在的区域为优势抗原表位区。通过PCR扩增和T4连接酶构建pET-mip、pET-flaA和pET-mip/flaA优势抗原表位基因融合表达载体,并诱导其在大肠杆菌中表达。结果 Mip和FlaA都存在多个潜在的抗原表位位点,选取其优势抗原表位区域进行克隆和表达获得成功,并成功表达了mip/flaA二联优势抗原表位融合蛋白。结论 DNA Star软件和Expasy在线蛋白分析系统能够成功预测嗜肺军团菌Mip和FlaA 抗原的表位;选取其优势抗原表位成功构建了pET-mip/flaA二联原核表达载体,并高效表达。     

分泌表达人IL-12基因重组卡介苗菌株的构建和筛选

目的 筛选获得分泌表达人白介素12(IL-12)的基因重组卡介苗菌株.方法 采用PCR反应从pORF-h IL-12载体中扩增得到人IL-12基因的完整序列,克隆入大肠杆菌-分枝杆菌(E.coli-BCG)穿梭载体pMV361中,构建含人IL-12基因的重组质粒rpMV-IL-12.将纯化的rpMV-IL-12电穿孔转化卡介苗(BCG),通过卡那霉素抗性筛选、基因组PCR方法进行初步鉴定,再经热休克诱导表达后,分别收集培养上清液和细菌沉淀,进行SDS-PAGE分析,筛选得到IL-12基因重组BCG(rBCG-12).结果 成功构建含人IL-12基因的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒rpMV-IL-12,测序结果与GenBank收录序列一致,未发生突变.rpMV-IL-12电穿孔转化BCG,经卡那霉素抗性筛选及基因组DNA的IL-12目的 片段PCR扩增筛选得到rBCG-12重组菌.rBCG-12热休克诱导表达后的SDS-PAGE电泳,从培养上清液中检测到相对分子质量为70×103的蛋白质条带,而细菌沉淀中未见到特异性条带.结论 分泌表达人IL-12蛋白的重组BCG菌株构建、筛选成功.     

靶向线粒体绿色荧光蛋白表达载体的构建及初步应用

目的：构建靶向线粒体绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体,观测其在蛋白质细胞内定位中的应用价值。方法：化学合成细胞色素C氧化酶8A亚单位信号肽编码序列,克隆该序列到载体pEGFP-N1多克隆区Nhe Ⅰ和Hind Ⅲ位点得到质粒pMito-EGFP,经测序鉴定后,用线粒体探针mitotracker染色已转染该载体的Hela...     

研究生实验动物学实验课的教学体会

实验动物学吸纳了生物学、医学、兽医学、遗传学等诸多学科的知识,是一门具有很强的综合性和交叉性的学科。人们普遍认为实验动物是生物医学乃至整个生命科学研究的重要支撑条件之一,在新技术革命蓬勃发展的当今世界中占有重要地位,因而也受到了各个医学院校的高度重视,成为许多学校本科生的选修课和研究生的必修课。实验动物学实验课作为理论知识的验证和补充,也受到学校和学生的高度重视。但由于师资、经费和教学条件的限制,多数学校只能选择性地面向研究生开设实验课。我系对研究生开设实验动物学实验课程已10年有余,对于普及实验动物学的有关知识和研究生的动手能力起到了一定的推动作用。通过长期的实验课教学,作者的有关认识是:     

结核分枝杆菌 Rv0757基因的原核表达及其编码蛋白对巨噬细胞功能的影响

目的构建结核杆菌Rv0757基因原核表达重组质粒pET28a-Rv0757,并研究表达的目标蛋白对小鼠骨髓巨噬细胞株ANA-1细胞的作用。方法将扩增出的Rv0757基因重组到原核表达质粒pET28a(+),并通过SDS-PAGE和Western blot鉴定诱导表达的目的蛋白。纯化目标蛋白后将目标蛋白PhoP作用于小鼠ANA-1细胞,检测活细胞数、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、一氧化氮(NO)和细胞凋亡指标。结果成功构建出pET28a-Rv0757原核表达质粒,诱导表达的目标蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定分析,其相对分子质量约为32×103。目的蛋白作用于小鼠ANA-1细胞后对活细胞数和细胞上清LDH活力无明显影响,但可以明显抑制细胞释放NO和细胞凋亡。结论本研究成功构建了原核表达载体pET28a-Rv0757,并成功表达出目标蛋白,该蛋白对小鼠ANA-1细胞没有毒性损伤,但可以抑制细胞释放NO和细胞的凋亡。