人脐静脉血管内皮细胞培养、冻存、复苏与鉴定

目的:探讨人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)体外分离、培养、冻存、复苏与鉴定的可靠方法.方法:采用改良的胶原酶灌注消化法对HUVEC体外分离、培养,按慢冻速融原则对第3代细胞进行液氮冻存、复苏.采用免疫组化Ⅷ因子相关抗原染色和活体细胞荧光DiI-Ac-LDL鉴定.结果:分离的原代HUVEC总数平均为1×106个细胞,最多达3×106个细胞;两种鉴定结果HUVEC均为95%以上阳性;冻存后分3批复苏细胞活性均超过90%.结论:成功建立了人脐静脉血管内皮细胞体外培养、冻存、复苏与鉴定方法,获得了足够数目和纯度的血管内皮细胞,保持了细胞的同源同代性.     

人胚神经干细胞的冻存与复苏

目的：研究神经干细胞浆存复苏后的成活率及再培养生长情况。方法：利用无血清培养基短期体外培养胚胎来源的神经干细胞后，以冻存液（体积分数为70％DMEM／F12，体积分数为20％胎牛血清，10％DMSO）进行冻存，于1周，4周，8周，12周，16周，20周，24周分别复苏，计活细胞比例并进行再培养。结果：复苏后神经干细胞的成活比例分别为68％、65％、65％、62％、61％、60％、60％，再培养生长良好。结论：本实验对神经干细胞成功地进行了冻存，复苏和再培养，对临床择期进行神经干细胞移植手术和建立“神经干细胞库”具有重要的意义。     

人脐静脉血管内皮细胞培养、冻存、复苏与鉴定

目的：探讨人脐静脉血管内皮细胞（humanumbicicalveinendothelialcell,HUVEC）体外分离、培养、冻存、复苏与鉴定的可靠方法。方法：采用改良的胶原酶灌注消化法对HUVEC进行分离、培养与鉴定,并遵循”慢冻快复”的原则进行冻存与复苏,同时使用Ⅷ因子相关抗原染色法进行鉴定。结果：分离的HUVEC生长良好,细胞总数可达I-3×10^2。Ⅷ因子相关抗原染色鉴定结果为95％以上阳性,冻存后复苏的细胞活性超过90％。结论：HUVEC可以从脐带获得并通过原代培养成为细胞系,获得了人脐静脉血管内皮细胞体外培养、冻存、复苏与鉴定的可靠方法。     

原代人视网膜色素上皮细胞的冻存和复苏培养

目的 :观察对原代人视网膜色素上皮 (retinalpig mentepithelium ,RPE )细胞进行冻存和复苏培养的效果 .方法 :将 6只尸供眼 ,常规酶消化法分离、纯化的人原代RPE细胞 ,分为两组 ,实验组为即刻进行常规梯度降温液氮冷冻保存 ,1wk后行常规复苏培养 ;对照组为细胞直接进行后续实验 .台盼蓝拒染观察细胞存活率及生长状态 ;计算细胞贴壁率 ;初步计算克隆形成率 .结果 :RPE细胞存活率分别为试验组 (90± 7) % ,对照组 (87± 1 5 ) % ,两组相比无显著性差异(P >0 .0 5 ) ;两组接种细胞贴壁率从 2 4h开始分别为 (5 .0±3.1 ) %～ (6 1 .0± 7.3) %和 (1 5 .0± 6 .3) %～ (6 0 .0± 3.3) % ;培养 4 8h之前 ,两组之间存在统计学差异 (P <0 .0 5 ) ,4 8h之后组间无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ;培养 5 ,7和 1 0d初步克隆形成率两组分别为 (1± 0 ) % ,(1± 1 ) % ,(3± 1 ) %和 (1±0 ) % ,(3± 1 ) % ,(2± 1 ) % ,组间无显著性差异 (P >0 .0 5 ,n=3) .冻存后复苏培养的RPE细胞生长状态良好 ,增生活跃 ,与对照组类似 .结论 :对原代人RPE细胞进行冻存 ,复苏培养的RPE细胞活性、存活能力、单细胞分裂增生能力不受影响 .     

HL60细胞冻存复苏生物学特性对比分析

目的探讨不同冻存复苏条件对白血病细胞株HL60生物学特性的影响,并优化培养方法与条件。方法对比不同浓度DMSO冻存条件、不同复苏方法对复苏后细胞生物学特性的影响,并确定培养液血清最佳浓度。结果采用5%DMSO冻存防护效果好于其他组,改良后细胞的复苏存活率明显高于传统复苏方法。结论以5%DMSO作为HL60细胞冻存保护剂并采用改良复苏方法,可使细胞保持最佳生物学特性,12%血清为HL60细胞常规培养的最适浓度。     

正常人关节软骨细胞的培养及冻存复苏的影响

目的观察正常人关节软骨细胞的体外培养及冻存后再复苏对人体关节软骨细胞活性所产生的影响。方法在无菌条件下取因创伤所致离断且无再植条件残肢的关节软骨组织,采用Ⅱ型胶原酶一次消化的方法获取原代软骨细胞后进行体外培养,并经10%DMSO冻存液冻存及常规复苏,过程中均用倒置显微镜定期观察软骨细胞的形态生长变化以及复苏后细胞的存活率。结果常规消化传代后的第2～4代间贴壁时间无明显差别,但较原代明显变短,生长速度加快,在形态上仍以三角或多角形为主,传代在5代以内的软骨细胞仍能保持正常的组织学形态,且复苏后软骨细胞的存活率能达95%。结论原代培养获得的正常人体关节软骨细胞在5代以内者可以较好地保留软骨细胞的特性和活性。     

人胚神经干细胞的体外分离培养和长期冻存

目的建立从脑组织中分离人胚神经干细胞的方法和体外长期培养的稳定体系，为细胞治疗提供基础。方法采用机械酶学法从胎脑中获得神经干细胞，这些细胞在合成纤维细胞生长因子和上皮细胞生长因子的无血清培养基中生长，血清刺激诱导分化，程序冷冻法保存细胞。结果这些细胞可在体外持续增殖，并被诱导分化成神经元和神经胶质细胞，可以长期冷冻保存。结论人胚神经干细胞分离培养体系和冻存方法的成功建立为神经损伤、退行性疾病以及其他疾病的细胞治疗提供了潜在的细胞资源。     

HEK-293细胞复苏培养及冻存

目的通过对人胚肾293细胞的复苏培养及其冻存的研究,为进一步行干细胞标记实验奠定基础。方法复苏培养人胚肾293细胞,倒置显微镜观察人胚肾293细胞的生长状况,计算细胞贴壁率,绘制细胞生长曲线,冻存保留细胞。结果人胚肾293细胞在普通培养条件下生长良好,6h后大部分细胞已经贴壁,8h细胞已完全贴壁。结论人胚肾293细胞采用改进方法复苏培养及冻存是简便可行的,为进一步行干细胞标记实验奠定了坚实的前期基础。     

不同冻存液对人羊膜间充质干细胞-80 ℃冻存与复苏效果的影响

目的:观察不同冻存液对人羊膜间充质干细胞冻存复苏后的存活率及再培养情况的影响,并探索简单有效的冻存与复苏方法.方法:将含有血清培养基短期体外培养的人羊膜间充质干细胞分为4组,分别加入不同冻存液(体积分数):A组10%二甲基亚砜 40%胎牛血清 50%DMEM/F12,B组10%二甲基亚砜 90%胎牛血清,C组5%二甲基亚砜 4.5%羟乙基淀粉 20%胎牛血清 70.5%DMEM/F12,D组10%胎牛血清 90%DMEM/F12.以相同方法冻存并复苏细胞,比较4组细胞回收率及再培养情况.结果:A、C 2组细胞复苏后回收率高于另外2组(P均<0.05),且于复苏后再培养24 h内出现较多贴壁细胞.结论:以5%二甲基亚砜 4.5%羟乙基淀粉 20%胎牛血清 70.5%DMEM/F12作冻存液冻存羊膜间充质干细胞效果好.     

不同人羊膜间充质干细胞冻存液冻存细胞效果比较

目的:筛选冻存人羊膜间充质干细胞效果较好的冻存液.方法:①不同配方的细胞冻存液对细胞冻存效果的影响.人羊膜问充质干细胞培养至第三代后分为10组,分别加入以下10种不同组成的冻存液.A组:70%DMEM/F12+20%胎牛血清+10%DMSO;B组:60%DMEM/F12+30%胎牛血清+10%DMSO;C组:40%DMEM/F12+50%胎牛血清+10%DMSO;D组:90%胎牛血清+10%DMSO;E组:70%DMEM/F12+20%胎牛血清+10%甘油;F组:60%DMEM/F12+30%胎牛血清+10%甘油;G组:40%DMEM/F12+50%胎牛血清+10%甘油;H:90%胎牛血清+10%甘油;I组:90%DMEM/F12+10%DMSO;J组:90%DMEM/F12+10%甘油.调整细胞密度为5×106mL-1,放入程序降温盒中,入-80℃低温冰箱保存.1个月后复苏,MTT法筛选出吸光光度值较高的一种冻存液.②相同血清含量细胞冻存液对细胞冻存效果的影响.含体积分数为50%胎牛血清的细胞冻存液分3组保存细胞.K组:45%DMEM/F12+50%胎牛血清+5%DMSO;L组:40%DMEM/F12+50%胎牛血清+10%DMSO;M组:35%DMEM/F12+50%胎牛血清+15%DMSO;复苏冻存的细胞后.将细胞按冻存前的数量调整至5×1O5mL-1,台盼蓝染色后,计算细胞的成活率.在倒置相差显微镜下观察细胞的生长状况.结果及结论:配方为45%DMEM/F12+50%胎牛血清+5%DMSO的冻存液冻存复苏人羊膜间充质干细胞后细胞的成活率最高(P<0.05);冻存复苏后细胞的生长状况较好.     

大鼠血管平滑肌细胞的培养与鉴定

目的:改进大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)的培养方法。方法:采用机械刮除、差异贴壁等手段进行组织贴块法原代培养,胰蛋白酶消化传代,并应用相差显微镜和即用型SABC免疫组化染色试剂盒对细胞进行形态学和免疫组化鉴定。结果:镜下培养细胞呈典型的"谷-峰状"生长,免疫组化染色显示胞浆内-αactin阳性表达,锥虫蓝染色检测细胞传代成活率95%。结论:本法可获纯度高、结构和功能良好的VSMCs。     

人主动脉夹层血管平滑肌细胞的培养和鉴定

目的 建立人主动脉夹层(AD)血管平滑肌细胞(VSMC)体外培养的方法。 方法 以AD患者手术时切除的血管为原料,用组织块贴壁法进行VSMC的体外原代和传代培养,倒置显微镜观察细胞的生长情况,考马斯亮蓝染色、α-SMA及Ⅷ因子免疫荧光染色和透射电镜检测鉴定细胞。 结果 7～10 d原代细胞从组织块边缘迁移出来,3～4周细胞生长至融合,可进行传代。原代和传代的细胞生长良好,倒置显微镜下见细胞呈长梭形,有多个突起。细胞呈“峰谷状”生长,具有典型的VSMC特征。考马斯亮蓝染色和透射电镜下均可见细胞内有大量沿长轴生长的肌丝,α-SMA免疫荧光染色强阳性,Ⅷ因子免疫荧光染色阴性,证明所培养的细胞为VSMC。细胞传代至第6代以后开始出现老化现象。 结论 应用组织块贴壁培养的方法可成功地在体外培养人AD的VSMC,为今后研究AD的发病机制提供良好的实验基础。     

改良大鼠血管平滑肌细胞的原代培养

目的探讨提高大鼠血管平滑肌细胞原代培养效率的方法。方法采取组织块贴壁法进行原代培养,高糖DMEM培养基中加入血小板源性生长因子-B(platelet-derived growth factor-b,PDGF-B),用细胞形态学及免疫组织化学法对血管平滑肌细胞鉴定。结果原代培养,4～6天可见细胞长出,2周可以传代;传代培养,1周可以传代1次。镜下可见细胞以梭形为主,呈"峰-谷"状生长,免疫组化染色可见细胞浆内有大量染成棕黄色的肌丝。结论在采用组织块贴壁法进行培养时,加入PDGF-B培养,可获得纯度高、活性好的血管平滑肌细胞,并缩短了培养周期。     

动脉内膜损伤模型中合成型平滑肌细胞的培养

目的 建立更新近在体情况的合成型血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）的培养体系。方法 培养细胞取材于兔动脉内膜损伤后的增生内膜。结果 培养细胞１０天后光镜下表现典型的“峰”、“谷”样排列,免疫组化证实昌ＶＳＭＣ,电镜下细胞表现有全成型细胞的特点。结论直接对合成型ＶＳＭＣ的培养优于单纯中膜ＶＳＭＣ培养。     

二步酶消化法分离大鼠主动脉血管平滑肌细胞及活性鉴定

目的:建立一种有效、方便的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)的酶解分离方法.方法:采用二步酶消化法分离VSM-Cs,显微镜下观察细胞形态,锥虫蓝染色观察细胞成活率,荧光显微镜检测细胞内钙荧光强度(FI)在KCl激下的变化,全细胞膜片钳记录电压-依赖性钾电流.结果:分离的VSMCs镜下呈典型的梭状或长条状,成活率达68.0％;VSMCs内钙FI在KCl刺激下可增高;并可记录到稳定的电压-依赖性钾电流.结论:本法可获得大量形态和结构良好的VSMCs,且胞膜离子通道功能良好.     

雷公藤内酯醇对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 探讨雷公藤内酯醇对血清诱导的大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖的影响及其作用机制。方法体外培养大鼠胸主动脉VSMCs,细胞融合达60％时培养基中加入不同浓度的雷公藤内酯醇和雷帕霉素。采用细胞计数法观察细胞增殖情况,流式细胞仪分析细胞周期;RT-PCR法检测VSMCs内c-fos mRNA表达水平。结果雷公藤内酯醇和雷帕霉素均明显抑制血清诱导的大鼠VSMCs增殖,阻断细胞由G0／G1期向S期转化;RT-PCR检测显示,随着雷公藤内酯醇浓度的增加,c-fos mRNA表达明显减少。结论雷公藤内酯醇能明显抑制血清诱导的VSMCs增殖,而阻断细胞周期、下调原癌基因c-fos mRNA的表达可能是其药理机制之一。     

血管内皮和平滑肌细胞联合培养构建组织工程化血管的方法

目的：探讨组织工程血管种子细胞原代培养、传代扩增、鉴定的方法，为组织工程血管的构建提供理想的种子细胞。方法：无菌条件下取正常产妇分娩的脐带动静脉，ROSS法（即组织贴块法）原代培养混合血管细胞。倒置相差显微镜、免疫组化法对细胞进行鉴定。结果：倒置显微镜显示原代细胞及经传代培养后的细胞，呈现内皮样细胞、平滑肌样细胞混合生长的特征。免疫组化法检测示内皮细胞Ⅷ因子、平滑肌细胞α-肌动蛋白呈阳性反应。细胞经3次～5次传代，数量可增殖达到8×10^6—10×10^6。结论：使用组织贴块法原代培养可获得内皮细胞、平滑肌细胞混合体，细胞经体外联合培养、传代可以达到组织工程血管种子细胞所需的数量。     

一种改良的猪肺动脉干平滑肌细胞培养方法

在本室已建立的肺动脉平滑肌细胞(PASMC)培养方法的基础上作了改进①用含400ml.LPASMC条件培养液和100ml／L胎牛血清(FBS)的PASMC混合培养液(PASMCMM)代替含100ml/LFBS的M199培养液;②传代时间选在90％长满,即PASMC处在对数生长期末而停滞期前;③用5～8滴／瓶混合消化液传代,然后用含100ml／L小牛血清的M199培养液终止反应,并使其贴壁,第2d改换成PASMCMM。经此法培养的PASMC具有生长快、分散更均匀的特点。细胞倍增时间(45．6h)较改进前(56．8h)缩短11．2h。改进后的培养方法更加简便、实用、高效。因此是一种快速、并可大量获取优质PASMC的有效方法。     

血管平滑肌细胞自噬对小鼠主动脉夹层形成的影响

研究血管平滑肌自噬对小鼠主动脉夹层形成的影响。     

维生素E对内皮细胞诱发血管平滑肌细胞凋亡的抑制作用

目的：研究维生素E对脂质过氧化损伤的内皮细胞（EC）诱发的血管平滑肌细胞（VSMC）凋亡是否具有抑制作用。方法：以氢过氧化枯烯为诱发剂引发培养的血管EC的脂质过氧化反应,将制备的内皮细胞条件培养液（EC－CM）作为实验因素作用于培养的VSMC。彩和透射电子显微镜,免疫组织化学等方法观察维生素E对内皮细胞条件培养液诱发的血管平滑肌细胞凋亡的影响。结果：电镜可见VSMC凋亡小体。免疫组织化学结果显示,VSMC的P53蛋白表达增加,bcl-2蛋白表达下调。加维生素E组电镜改变轻微,p53,bcl-2异常表达减轻,结果：维生素E对脂质过氧化损伤的内皮细胞诱发的血管平滑肌细胞凋亡具有抑制作用。,