地黄低聚糖对过氧化氢-血清饥饿诱导的脂肪组织来源干细胞Bax/Bcl-2表达的影响

目的探讨地黄低聚糖(RGOs)对过氧化氢-血清饥饿诱导的小型猪脂肪组织来源干细胞(ASCs)Bax、Bcl-2表达的影响。方法过氧化氢(200μM)联合血清饥饿(H2O2/SD,6 h)建立小型猪ASCs凋亡模型。RGOs(0.01 g/L、0.1 g/L、1 g/L、10 g/L)预处理12 h并继续干预6 h。Western-blot法测定细胞Bax、Bcl-2的表达。结果 RGOs在一定浓度范围(0.1 g/L~10 g/L)可以减轻H2O2/SD引起的ASCs损伤,表现在Bax表达下调,Bcl-2表达上调。结论地黄低聚糖对过氧化氢-血清饥饿诱导的脂肪组织来源干细胞的凋亡具有保护作用。     

地黄低聚糖对过氧化氢-血清饥饿诱导的脂肪组织来源干细胞凋亡的影响

目的探讨地黄低聚糖(RGOs)对过氧化氢-血清饥饿诱导的脂肪组织来源干细胞(ASCs)凋亡的影响。方法过氧化氢(200μM)联合血清饥饿(H2O2/SD,6 h)建立小型猪ASCs凋亡模型。RGOs(0.01 g/L、0.1 g/L、1 g/L、10 g/L)预处理12h并继续干预6 h。Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡率,CCK-8法测定细胞活性,酶标仪比色法测定细胞caspase-3的活性。结果 RGOs在一定浓度范围(0.1~10 g/L)可以减轻H2O2/SD引起的ASCs损伤,表现在细胞凋亡率下降,细胞活性增加,caspase-3活性降低。结论地黄低聚糖对过氧化氢-血清饥饿诱导的脂肪组织来源干细胞的凋亡具有保护作用。     

脂肪组织来源干细胞可促进脂肪移植物的存活率

背景:在体外定向诱导条件下,脂肪组织来源干细胞可分泌细胞因子促进血管形成。目的:将脂肪组织来源干细胞和游离脂肪组织混合移植,评价脂肪组织来源干细胞对脂肪移植物存活率的影响。方法:采用不同感染复数MOI值Ad-EGFP基因转染人脂肪组织来源干细胞,确定理想的MOI值对细胞进行标记后,与人脂肪组织混合移植于裸鼠背部(实验组),以移植单纯脂肪组织为对照组。结果与结论:①脂肪组织来源干细胞转染24h可见绿色荧光,5d荧光表达强度最强,传代后仍有强荧光表达。MOI值为50时转染率95.3%较为理想。②移植后6个月实验组脂肪组织来源干细胞散在分布于部分脂肪细胞及小叶间隔中,在体内能够部分转化为血管内皮细胞,移植脂肪湿质量与存活率高于对照组(P=0.001),移植脂肪纤维化及坏死程度低于对照组(P=0.001)。说明脂肪组织来源干细胞移植在体内可促进游离移植脂肪组织的再血管化,提高移植脂肪组织存活率。     

同种异体脂肪组织来源干细胞联合地黄低聚糖对心肌梗死小型猪心肌凋亡的影响

目的探讨同种异体脂肪组织来源干细胞(ASCs)联合地黄低聚糖(RGOs)对心肌梗死(MI)小型猪心肌凋亡的影响。方法球囊封堵冠状动脉前降支制备小型猪MI模型,17头小型猪造模成功,采用随机数字表法分为4组:ASCs组(n=4),RGOs组(n=4),RGOs+ASCs组(n=4)及对照组(n=5)。造模前3天、造模后1月RGOs组及RGOs+ASCs组均饲以RGOs粗提物;造模7~10 d经冠状动脉移植ASCs,RGOs组及对照组均注入0.9%氯化钠注射溶液。移植后8周检测心肌梗死边缘区细胞凋亡(TUNEL法)及Bax、Bcl-2的表达。结果与对照组比较,RGOs组及RGOs+ASCs组心肌细胞凋亡均显著降低(P<0.05,P<0.01),三组Bax的表达均明显降低(P<0.05),RGOs组及RGOs+ASCs组Bcl-2的表达均明显升高(P<0.01)。结论 ASCs联合RGOs抑制了梗死边缘区心肌细胞凋亡。     

地黄低聚糖对体外培养的小型猪脂肪组织来源干细胞增殖的影响

目的分离培养小型猪脂肪组织来源干细胞(ASCs),观察不同浓度地黄低聚糖(RGOs)对其增殖的影响。方法酶消化法及贴壁法从小型猪腹股沟脂肪组织中分离、培养ASCs,流式细胞仪检测ASCs表面抗原CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD90、CD105、HLA-DR的表达,CCK-8比色法观察不同浓度RGOs(0g/L、0.001g/L、0.01g/L、0.1g/L、1g/L、10g/L)对其增殖的影响。结果第4代ASCs表面抗原CD29、CD44、CD90、CD105表达呈阳性,CD31、CD34、CD45、HLA-DR表达呈阴性。RGOs在0.01～1 g/L浓度范围内对体外培养的小型猪ASCs具有促增殖作用(P<0.05),最佳浓度为0.1 g/L。结论一定浓度的RGOs对体外培养的小型猪ASCs具有促增殖作用。     

脂肪组织来源干细胞的分离培养及鉴定

目的探讨脂肪组织来源干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs)的分离、培养、分化和鉴定的方法,为进一步的实验研究提供理论依据。方法酶消化法处理脂类抽吸物,分离培养ASCs,观察细胞形态;四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测细胞活性并绘制细胞生长曲线,流式细胞仪测定细胞周期,丫啶橙染色检测细胞的衰老;流式细胞仪、免疫组织化学染色法鉴定表面分子表达;成脂定向诱导分化后油红"O"染色定性。结果原代培养的ASCs呈成纤维细胞样贴壁生长,具有很强的增殖能力;细胞周期研究发现ASCs具有干细胞的特性。流式细胞仪检测显示干细胞标志的CD29、CD44、CD34的表达均呈阳性;免疫化学染色发现VШ因子、CD31、CD34,CD105、SMA表达阳性;成脂诱导分化2周后,细胞内可见有大量脂滴,油红"O"染色可见胞浆内有大量红染颗粒。结论自人体脂类抽吸物中通过酶消化法能分离和培养出具有干细胞特性的成纤维细胞样细胞群,该细胞具有很强的增殖活性且不易衰老,能稳定表达干细胞表面标志并能实现定向成脂分化。     

自制血清替代物行无血清条件培养人表皮干细胞

目的：建立一种人表皮干细胞的无血清培养方法，并与目前表皮干细胞常用的有血清培养方法进行比较，探讨该条件是否更适合表皮干细胞的生长和有利于实施表皮干细胞的调控，提高实验的准确性。方法：实验于2002-05／2004-07在江西医学院第二附属医院医学分子中心完成。①从幼儿包皮中分离表皮细胞、用胶原Ⅳ分别黏附表皮细胞10～15min，收集黏附细胞，即为纯化的表皮干细胞。②分3组进行培养，3组培养条件均有无钙低糖Dulbecco改良的Eagle培养基，0．05mmol／LCaCl2，10μg／L表皮细胞生长因子，1&;#215;10^-6mol／L氢化可的松；有血清培养组还含有100g／L螯合钙的干细胞专用血清；无血清培养组1还含有100g／L无血清培养基血清替代物。无血清培养组2还含有100g／L无血清培养基血清替代物和50μg／L牛垂体提取物。③培养20d后。在倒置显微镜下对所培养细胞进行形态学观察；同时计数细胞数(大于100个细胞团为1个集落称克隆)，计数各组克隆数；采用胰酶消化传代，计数传代数及多次传代后所得细胞总数；流式细胞术分析α6，CD71(人表皮干细胞表面标记)的表达情况，计算人表皮干细胞α6bri CD71dim细胞百分率；采用流式细胞术进行细胞周期分析处于静止期／DNA合成前期人表皮干细胞百分率，采用免疫组化法鉴定细胞角蛋白19及5／8(均表明人表皮干细胞生长情况，且以角蛋白19更能明确表明人表皮干细胞生成情况)和角蛋白10表达情况。结果：①人表皮干细胞细胞形态学观察结果：应用倒置显微镜下观察检测，无血清培养组1与有血清培养组人表皮干细胞细胞形态学基本相同，无血清培养组1集落形成时间稍晚于有血清培养组。②形成的克隆数及经胰酶消化可传代数、细胞总得数：胰酶消化传代后，形成的克隆数、细胞总得数及细胞传代数无血清培养组1与有血清培养组相近(P&;gt;0．05)，两组形成的克隆数、细胞总得数明显低于无血清培养组2(P&;lt;0．05)而细胞传代数组明显高于无血清培养组2(P&;lt;0．05)。③细胞周期分析及α6，CD71鉴定结果：采用流式细胞术检测，有血清培养组与无血清培养组1中人表皮生长干细胞α6^briCD71^dim细胞百分率及处于静止期／DNA合成前期细胞(即人表皮干细胞)百分率相近(P&;gt;0．05)，且均高于无血清培养组2(P&;lt;0．05)。④细胞角蛋白19和5／8及10表达情况：免疫细胞化学鉴定结果，有血清培养组与无血清培养组1角蛋白19和5／8及10阳性细胞百分率相近(P&;gt;0．05)，而两组角蛋白19阳性细胞百分率明显高于无血清培养组2(P&;lt;0．05)，角蛋白5／8和10阳性细胞百分率明显低于无血清培养组2(P&;lt;0．05)。结论：①利用自制的无血清培养基血清替代物．添加一些辅助因子(0．05mmol／L CaCl2，10μg／L表皮细胞生长因子，1&;#215;10^-6mol／L氢化可的松)能较好的培养表皮干细胞，传代次数多，培养时间长，形成克隆数较多，说明此类细胞具有较强的自我复制能力，结合所培养细胞中人表皮干细胞α6^briCD71^dim细胞及角蛋白19和5／8阳性细胞比例较高等特点，表明该无血清培养条件适合表皮干细胞的生长。②自制的无血清培养基血清替代物添加一些辅助因子(0．05mmol／LCaCl2，10μg／L表皮细胞生长因子，1&;#215;10^-6mol／L氢化可的松，50μg／L牛垂体提取物)的无血清培养组2能较快获得大量人表皮细胞，当组织工程需要大量细胞时可用此种培养扩增方法。     

脂肪组织来源的干细胞体外培养随机恶性转化

目的：研究脂肪来源干细胞在体外能否恶性转化。方法从小鼠脂肪组织培养出脂肪组织来源干细胞（ADSCs）,观察细胞是否发生恶性转化,应用免疫细胞化学方法检测转化细胞的相关标志物的表达,并对其染色体结构进行分析,并将转化细胞移植到裸鼠皮下以检测其成瘤性。结果1个培养瓶中的细胞在体外培养4个月左右发生了转化,已经永生化,目前体外培养超过100代,细胞仍维持原来的增殖速度。细胞表达中胚层的标志物vimentin,但不表达pan-CK,说明其是间充质来源;同时表达PCNA、Ki67和VEGF-c,不表达p16;染色体分析证明为非整倍体,有广泛的易位;透射电镜下可见细胞表面微绒毛结构;细胞在软琼脂中没有克隆形成能力;裸鼠皮下移植能够形成肿瘤组织,肿瘤组织的主体成分为肉瘤。结论脂肪组织来源的干细胞在体外长期培养能够发生恶性转化,裸鼠皮下移植能够形成肉瘤。     

地黄低聚糖联合脂肪组织来源干细胞移植治疗小型猪急性心肌梗死的疗效

目的探讨地黄低聚糖（RGOs）联合同种异体脂肪组织来源干细胞（ASCs）移植治疗小型猪急性心肌梗死（AMI）的疗效及其可能的机制.方法经皮球囊封堵冠状动脉左前降支制备小型猪AMI模型（n=17）,随机分为4组：对照组（n=5）,RGOs组（n=4）,ASCs组（A组,n=4）及RGOs＋ASCs联合治疗组（n=4）.RGOs组及联合治疗组造模前3天及造模后1月饲以RGOs粗提物（4g,2次/天）;造模1周后（7-10d）经冠状动脉移植同种异体ASCs（0.8×106kg^-1）,对照组及RGOs组注入0.9%氯化钠注射溶液.移植后8周,延迟增强核磁共振扫描（DE-MRI）评价各组心脏结构及功能变化,荧光显微镜及激光共聚焦扫描观察ASCs存活及分化,免疫组织化学法观察梗死区微血管密度,Masson三色染色法评价梗死区纤维化程度.结果与对照组比较,联合治疗组可以明显改善左心室功能,增加梗死区室壁厚度,减小左心室质量指数及梗死体积（均P〈0.05）.病理和免疫组织化学结果显示,联合治疗组ASCs的存活多于ASCs组（P〈0.01）,并表达心肌细胞标记物（cTnT、α-actin）及血管标志物（vWF、α-SMA）.联合治疗组梗死区微血管密度明显高于其他3组（P〈0.01）.与对照组比较,ASCs组以及联合治疗组均能明显降低梗死区纤维化程度（P〈0.05,P〈0.01）.结论RGOs可以提高ASCs移植治疗小型猪AMI疗效,改善心功能,减轻左心室重构,其作用机制可能与RGOs促进ASCS增殖分化,抗纤维化有关.     

简化无血清培养基分离U2-OS人骨肉瘤细胞系肿瘤干细胞

背景:已有实验应用成分复杂的无血清培养基从骨肉瘤组织中分离出干细胞样肿瘤细胞.目的:应用简化的无血清培养基在U2-OS人骨肉瘤细胞系中分离培养出骨肉瘤干细胞并对其作肿瘤干细胞的相关检验.设计、时间及地点:干细胞体外培养实验,于2006-02/2007-02在兰州大学第二医院骨科研究所完成.材料:U2-OS人骨肉瘤细胞系购自中科院上海生命科学研究院细胞库.无血清培养基为在DMEM/F12培养基中添加重组表皮生长因子(20 μ g/L)和重组成纤维生长因子(20 μ g/L),L-谷氨酰胺(2 mmol/L),胰岛素(4 U/L),青莓素G(1×10°U/L),链霉素(100 mg/L).方法:取在含血清培养基中贴壁生长的U2-OS细胞,接种于含有表皮生长因子和成纤维生长因子的简化无血清培养基中,形成悬浮生长的骨肉瘤细胞球后观察其增殖、分化能力.用免疫细胞化学染色法检测间充质干细胞标志CD44、CD105蛋白在骨肉瘤细胞球中的表达.反转录-聚合酶链反应法检测U2-OS细胞及其肿瘤干细胞中胚胎多能干细胞管家基因Oct3/4mRNA的表达.主要观察指标:①悬浮细胞球的形成.②肿瘤干细胞增殖活性.③肿瘤干细胞的侵袭能力.④CD44、CD105蛋自在骨肉瘤细胞球细胞中的表达.⑤肿瘤干细胞中Oct 3/4 mRNA的表达.结果:U2-OS人骨肉瘤细胞系中有极少数的细胞能在简化无血清培养基中增殖形成骨肉瘤细胞球,具有很强的增殖分化能力,其表面具有间充质干细胞的膜分子CD44、CD105,表达胚胎干细胞管家基因Oct 3/4 mRNA.结论:U2-OS细胞系中存在肿瘤干细胞,简化无血清培养基可用于分离培养骨肉瘤干细胞.     

地黄低聚糖对人脂肪组织来源干细胞旁分泌作用的影响

目的探讨地黄低聚糖(RGOs)对分离、培养的人脂肪组织来源干细胞(hASCs)旁分泌作用的影响。方法酶消化法及贴壁法从人腹部脂肪组织中分离、培养hASCs。流式细胞仪检测hASCs表面抗原CD29、CD31、CD44、CD45、CD90、CD105、HLA-DR的表达。hASCs经RGOs(0.1 g/L)预处理12 h并继续干预,ELISA法观察不同时间点hASCs培养上清液中血管内皮生长因子(VEGF),肝细胞生长因子(HGF),胰岛素样生长因子-1(IGF-1),碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),基质细胞衍生因子-lα(SDF-lα)浓度的变化。结果hASCs表面抗原CD29、CD44、CD90、CD105表达呈阳性,CD31、CD45、HLA-DR表达呈阴性。与对照组相比,RGOs可以促进体外培养的hASCs分泌VEGF、HGF、IGF-1、SDF-1α(P<0.05),而对于bFGF的分泌无明显影响。结论 RGOs可以增强体外培养的hASCs的旁分泌作用。     

SPIO标记脂肪干细胞移植治疗大鼠脑梗死的磁共振示踪成像研究

目的通过采用多聚左旋赖氨酸（PLL）与超顺磁氧化铁纳米微粒（SPIO）的复合物对脂肪干细胞（ADSCs）体外进行标记,观察SPIO标记ADSCs脑内移植治疗大鼠脑梗死的分布和迁徙情况。方法显微镜下直接结扎大脑中动脉方法制备大鼠脑梗死模型36只,随机分成缺血未干预对照组（12只）、磁性标记ADSCs移植组（12只）和未磁性标记ADSCs移植组（12只）,采用立体定向方法脑内移植。对移植后大鼠的神经系统行为和运动功能进行评估,病理组织化学染色观察ADSCs在体内的分布情况,并用磁共振成像的方法在体观察ADSCs的分布,并与病理结果进行对比。结果移植后3周神经系统行为学评分显示移植组动物明显改善,ADSCs脑内移植后3周MRT2WI显示移植区低信号改变并通过胼胝体向病灶迁移。病理组织检查显示磁共振低信号改变区可见普鲁士蓝染色阳性细胞。结论移植ADSCs可以有效地促进大鼠脑梗死后神经行为功能的恢复,MRI可用于在体评价经SPIO和PLL复合物标记的ADSCs细胞移植后在体内的分布、迁移过程。     

Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a novel feeder layer for epithelial cells

We examined a novel human feeder cell layer of mesenchymal stem cells harvested from human adipose tissues. Gene expression analyses and colony-forming assay with human primary epithelial cells showed that the adipose tissue-derived mesenchymal stem cells produced various factors to support epithelial stem/progenitor maintenance and cell growth. Using the mesenchymal stem cells as novel feeder layers, transplantable epithelial cell sheets could be effectively generated ex vivo on temperature-responsive cell-culture surfaces.     

过氧化氢对胚胎干细胞移植治疗心肌梗死的影响

背景：干细胞移植治疗心肌梗死的具体机制一直不十分清楚。目的：探讨H2O2方法：选取24只9周龄C57BL/6小鼠随机分为心肌梗死组、胚胎干细胞组、H体外预处理小鼠胚胎干细胞对治疗心肌梗死疗效的影响。2O2预处理胚胎干细胞组,每组8只,所有小鼠制备心肌梗死模型1周后,分别于尾静脉分别注入150μL的PBS、150μL的胚胎干细胞(1×106)、150μL的H2O2预处理胚胎干细胞(1×106结果与结论：与心肌梗死组比较,胚胎干细胞组和H )。移植后第3周超声测量各组小鼠左心室舒张末内径、左心室收缩末内径和左心室射血分数。超声心动图检查后取心肌组织行天狼星红染色检测心肌胶原含量,计算平均胶原容积分数。2O2预处理胚胎干细胞组左心室舒张末内径和左心室收缩末内径明显下降,左心室射血分数明显升高(P<0.05),全心质量/体质量、左心室质量/体质量、平均胶原容积分数明显降低(P <0.05);与胚胎干细胞组比较,H2O2预处理胚胎干细胞组小鼠左心室舒张末内径和左心室收缩末内径明显下降,左心室射血分数明显升高(P<0.05),全心质量/体质量、左心室质量/体质量、平均胶原容积分数明显降低(P<0.05)。所以体外H2O2预处理胚胎干细胞减轻了心肌梗死后心肌纤维化,心功能改善更为明显。     

Adipose tissue-derived stem cells in clinical applications

Introduction: In the past decade human adipose tissue has been identified as a source of multipotent stem cells. Adipose tissue derived stem cells (ASCs) are characterised by immunosuppressive properties and low immunogenicity. Therefore, they can be used in regenerative medicine, as well as applied to induce graft tolerance or prevent autoimmunity. ASCs can be easily harvested with low morbidity, which is their main advantage over mesenchymal stem cells (MSCs) derived from other sources.

Areas covered: The review focuses on reported clinical applications of ASCs and discusses technical approaches of their isolation and processing. The differences in phenotype and differentiation preferences between ASCs and other MSCs that may affect the choice of a particular cell type for the future therapy are also described.

Expert opinion: ASCs seem to be the perfect tool for regenerative medicine and immunosuppressive cellular therapies. Nevertheless, there are some tasks that should be addressed by the future studies: i) ASCs require better characterisation; a set of markers determining ASCs should be clearly defined; ii) there is need for more studies on safety of reconstructive therapies with ASCs in cancer patients (e.g., after mastectomy); iii) release criteria should be determined for freshly isolated and ex vivo expanded ASCs designed for clinical applications.