cDNA微阵列研究肝纤维化相关基因

cDNA微阵列 (cDNAmicroarray)是近年发展起来的一项新技术 ,其原理是同时将数百甚至数千个cDNA片段或寡核苷酸片段固着在尼龙膜上 ,利用核酸分子杂交技术大规模检测生理和各种病理条件下各基因的表达水平和变化情况 ,具有高通量、集成化和操作并行性的特点。本研究探讨肝纤维化过程中基因表达谱情况 ,以进一步明确肝纤维化发病机制。一、材料与方法1.主要实验材料 :雄性SD大鼠 ,购于中国科学院上海实验动物中心。RNA抽提试剂Trizol和RT PCR试剂盒购自Gibco公司。AtlascDNA表达阵列试剂盒购自Clontech公司。引物由上海申友生物技…     

cDNA微阵列分析穿刺手术所致BALB/c小鼠肝损伤基因表达谱变化

目的分析肝穿刺术后BALB/c小鼠肝脏基因表达谱的变化。方法10只BALB/c随机分为两组;实验组和正常组,每组各5只;实验组小鼠开腹直视下肝左叶注生理盐水,8天后采集肝组织标本并提取RNA,cDNA微阵列分析25 000个基因在实验组和正常组小鼠肝组织中的表达水平差异。结果肝穿刺术后共有82条差异基因,其中52条基因表达上调,30条基因表达下调;功能聚类可分为代谢、转录调节、转运、信号转导、炎症反应、细胞增殖与凋亡、细胞周期与细胞骨架及细胞粘附等8类。结论肝穿刺术所致小鼠肝脏基因表达谱发生的改变,涉及多个基因表达调控途径。     

人胚肝脂代谢相关基因的表达谱

运用cDNA微阵列结合荧光半定量聚合酶链反应技术，首次大规模分析人胚发育过程中肝脏脂代谢相关基因的表达情况，比较孕早、晚期人胚肝脂代谢相关基因的表达谱。抽提孕早、晚期胎儿肝脏组织总RNA，取等量mRNA逆转录标记33P，制成cDNA探针后与人类全基因cDNA微阵列芯片杂交，用相应软件分析杂交信号扫描结果。有差异表达的基因再用实时荧光半定量PCR方法进一步确认。在进入研究的可信基因中，与脂代谢相关的基因共有135条，其中28条有差异表达(2倍以上)，随胎龄增长，脂肪酸分解的相关基因呈现上调趋势，脂肪酸和胆固醇合成的相关基因呈现下调趋势，差异范围从0．43～8．3倍。检测15例胚肝组织的脂质含量，发现胆固醇和甘油三酯水平随胎龄增长而逐渐下降。人类胚胎肝脏的胆固醇和甘油三酯的合成率及含量可能随着发育成熟呈现下降趋势。     

日本血吸虫感染BALB/c小鼠肝窦的动态观察

目的观察感染日本血吸虫BALB／c小鼠肝窦动态变化，及其与肝纤维化和肝细胞损伤的关系。方法建立感染日本血吸虫BALB／c小鼠肝纤维化动物模型，肝标本行常规病理染色和天狼猩红染色，进行肝纤维化程度的半定量分析，免疫组化染色检测肝窦Ⅳ型胶原（C—Ⅳ）和第Ⅶ因子相关抗原（vWF）的表达，测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST），另每组取2只小鼠新鲜肝组织进行透射电镜观察。结果感染小鼠肝窦内皮细胞（SEC）第4周窗孔减少、变小，第8周窗孔消失及SEC下基底膜（BM）形成，肝窦C—Ⅳ和vWF随感染时间的延续表达逐渐增强，肝纤维化程度也逐渐增高，血清ALT和AST与感染时间无关。结论血吸虫感染所引起的小鼠SEC表型改变可能是其诱导肝纤维化的始动机制之一。     

编码大陆株日本血吸虫天冬酰胺肽链酶cDNA的克隆及其在BALB/c小鼠体内的表达

血吸虫成虫３１／３２ｋＤａ蛋白除具有公认的免疫学诊断价值外,作为疫苗抗原的候选分子也有潜在价值［１］。我们对编码大陆株日本血吸虫３２ｋＤａ天冬酰胺肽链酶（Ｓｊ３２）进行了克隆、测序鉴定、构建真核表达载体,并在小鼠骨骼肌细胞得到表达,为该抗原的ＤＮＡ疫苗研究打下了基础。　　材料与方法Ｓｊ３２ｃＤＮＡ的克隆、鉴定日本血吸虫成虫ＲＮＡ的分离纯化,ｃＤＮＡ合成等参见文献［２］。根据文献［３］报道的核苷酸序列,设计并合成引物,Ｐ１：５ＣＴＣＧＧＡＴＣＣＡＡＧＡＧＡＡＡＴＡＡＴＧＴＴＴＴＡＴＴＣ３Ｐ…     

BALB/c小鼠衰老过程中大脑皮质组织基因表达的改变

目的 鉴别和克隆小鼠衰老相关基因，为揭示人体衰老机制提供线索。方法 利用改进逆转录-多聚酶链反应(DDRT-PCR)技术分析了4月龄和24月龄BALB／c小鼠大脑皮质组织中mRNA的差异表达。结果 确定了42个差异表达cDNA片段，在衰老小鼠中表达上调和下调者各21个。其中17个为已知编码蛋白功能的基因片段，12个为已知基因序列但未知功能的基因片段，13个可能为新基因片段。在已知蛋白功能的基因中，与氧化应激、能量产生和蛋白质代谢等相关的基因分别为2个、3个和4个，此外还有参与细胞凋亡、神经退行性变和生长发育调节等基因表达的改变。结论 小鼠衰老可能与机体氧化应激状态、能量产生和蛋白质代谢等的改变有关。     

BALB/c小鼠感染广州管圆线虫后脑内的动态变化

目的观察广州管圆线虫感染BALB/c小鼠后其虫数在小鼠脑内的动态变化,探讨其感染后对人体可能的致病机制。方法以广州管圆线虫Ⅲ期幼虫感染实验BALB/c小鼠,按感染的不同时间分批处死,镜下及肉眼观察脑内虫体数量及分布情况。结果在BALB/c小鼠大、小脑内,广州管圆线虫的分布符合寄生虫感染宿主后先增后减的一般基本变化规律,虫体寄生的部位因感染虫体而受损。引起症状的时间变化与虫体在脑内变化规律基本相符。结论小鼠感染广州管圆线虫以后,出现共济失调,抽搐等症状的时间与虫体在小鼠脑内的变化规律基本相符。为临床研究该病的相关临床症状及治疗提供了一定的实验依据。     

胶原诱导性关节炎大鼠滑膜基因表达谱的cDNA微阵列研究

目的研究胶原诱导性关节炎大鼠滑膜基因表达谱，探讨类风湿关节炎的发病机制。方法用含588个基因的大鼠基因表达谱芯片研究胶原诱导性关节炎及正常大鼠滑膜基因表达谱。结果胶原诱导性关节炎大鼠差异表达基因共有68个，上调基因有63个，下调基因有5个。结论胶原诱导性关节炎是一个涉及多基因表达异常的全身免疫性疾病，筛选到的差异表达基因将为进一步研究类风湿关节炎发病机制及防治提供重要线索。     

基因微阵列分析大鼠肝脏热缺血损伤功能基因的差异表达

目的分析热缺血损伤后大鼠肝脏基因表达谱的改变,初步确定热缺血损伤发病分子机制过程中调控基因。方法采用基因表达谱芯片RAE230分析SD大鼠原位热缺血模型处理前后基因mRNA转录本含量的改变；确定目标基因并联机检索GeneBank等整合数据库,按其生物功能分类进行批量筛选；并应用Gene Cluster3．0生物信息可视化分析软件进行等级聚类分析。用荧光定量逆转录聚合酶链反应法验证目标基因GAPDH、Hsp70、CyclinD1的表达变化,验证芯片分析的初步结果。结果分别得到了正常对照组、缺血组的肝脏基因表达数据和变化显著基因直观图示。对比分析发现,在总共8804个表达的基因(表达率为55．3%)中,实验组有927个基因表达下调,885个基因表达上调,其中变化幅度大于3倍的分别有40个和29个(P＜0．01)；按其生物学功能分类属能量代谢、组织修复、信号转导类分子的调控。结论30 min热缺血损伤处理后,SD大鼠基因的表达谱发生改变,实验分析证实热缺血损伤的分子调控机制涉及多个基因表达调控途径。研究这些基因分子功能有助于为外科临床防治热缺血损伤提供实验依据。     

cDNA微阵列技术检测胃肠安复方对人胃癌细胞基因表达谱的影响

目的:观察健脾类中药胃肠安复方对人胃癌细胞裸小鼠移植瘤的抑瘤作用,探讨基因表达谱芯片在中药复方对胃癌细胞多基因表达影响研究中的应用.方法:采用人胃癌细胞SGC-7901裸小鼠皮下移植瘤模型.造模1周后选瘤块直径1.5 mm以上者共16只,随机分为胃肠安复方组及0.85%氯化钠溶液对照组,每组8只.造模后41 d处死动物.通过RT-PCR反转录、同位素标记、全基因表达谱芯片方法研究胃肠安复方组与对照组人胃癌移植瘤细胞mRNA的表达差异.结果:胃肠安复方组瘤重低于对照组[(0.99±0.49)g:(1.93±0.52) g,P<0.05],胃肠安复方组抑瘤率为48.64%.全基因表达谱芯片检测比较分析示,胃肠安复方组与对照组样品间共有45个显著性差异表达基因,其中上调表达24个,下调表达21个,35个已克隆基因,10个表达序列标签.结论:健脾中药胃肠安复方抑制人胃癌细胞裸小鼠移植瘤生长,并可能对肿瘤细胞多基因表达有影响.     

基因表达谱芯片在胰腺癌组织差异表达相关基因筛选中的应用

目的：探讨基因表达谱芯片技术筛选胰腺癌组织和癌旁正常组织基因表达谱差异的可行性。方法应用Agilent公司生产的包含27958条DNA的基因芯片检测4例胰腺癌患者胰腺癌组织和癌旁正常组织的基因表达谱,筛选差异表达基因,并用半定量RT-PCR法检测差异基因CD151、S100A4、TIMP-3和NME3表达情况。结果共筛选出46条基因表达谱差异基因,其中26条表达上调、20条表达下调。差异基因CD151、S100A4、TIMP-3和NME3的表达情况与基因表达谱芯片检测结果一致。结论基因表达谱芯片技术可以筛选出胰腺癌组织差异表达相关基因,为胰腺癌分子标志物研究提供了可靠依据。     

急性病毒性心肌炎小鼠相关基因差异表达的研究

目的应用基因表达谱芯片筛选急性病毒性心肌炎相关基因,并对这些基因的功能进行初步分析。方法将8 464条小鼠PCR产物按微聚阵排列点样于化学涂层的载玻片上,制成基因芯片;用柯萨奇B3 (CVB3)病毒感染BALBc小鼠,在感染后的第4、8、21天,分别将正常和病毒性心肌炎心肌中mRNA逆转录,合成荧光分子(cy3／cy5)掺入的cDNA链制备表达谱探针,芯片杂交和严格洗片后,用ScanArray3000荧光扫描芯片荧光信号图像,利用计算机分析病毒性心肌炎心肌与正常心肌中丝氨酸苏氨酸磷酸化酶基因(PIM-3)、血管形成因子基因(Ang)-1、组织相容性基因-2的表达,并对获得的基因进行生物信息学分析。结果小鼠在CVB3感染后的第4、8、21天,心肌中分别发现了1 684、284、98条差异表达基因:PIM-3、Ang-1、组织相容性基因-2的表达被持续抑制。结论应用基因表达谱芯片可筛选出差异表达基因,PIM-3、Ang-1、组织相容性基因-2的差异表达可能与病毒性心肌炎发生和发展有关。     

应用基因芯片技术筛选大鼠再生肝中差异表达基因

目的应用基因芯片技术筛选大鼠再生肝中差异表达基因,为探讨急性肝功能衰竭的发病机制提供基础。方法雄性SD大鼠行95％肝部分切除术,用含1176个基因的大鼠尼龙膜微阵列筛选大鼠再生肝组织中差异表达的基因。RT—PCR随机验证若干差异表达基因在微阵列中的表达。结果再生肝组织有138个基因明显较对照组织表达高,它们主要是生长因子基因、核受体基因、核糖体蛋白基因、应急反应蛋白基因、细胞周期调节基因、神经递质基因等;下调基因共50个,主要为代谢酶基因、激素受体基因及表面抗原基因等。结论cDNA微阵列技术有助于研究急性肝功能衰竭的发病机制,并提供诊断和治疗的潜在靶点。     

野生型K-ras2诱导结肠癌细胞基因表达谱改变的特征分析

目的：应用基因芯片技术,检测野生型K-ras2基因在结肠癌Caco2细胞中表达诱发的基因谱改变,进一步阐明野生型K-ras2基因可能的分子生物学功能.方法：抽取正常人的静脉血,提取RNA,反转录成cDNA,以此为模板,采用PCR方法克隆K-ras2野生型全编码cDNA序列.以常规的分子生物学技术将获得的K-ras2 cDNA克隆到T Easy载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pCI-neo-K-ras2,以脂质体转染结肠癌细胞系Caco2,提取mRNA逆转录为cDNA与转染空白表达载体pCI-neo的Caco2细胞进行cDNA芯片分析.结果：构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定证实准确无误,提取高质量的RNA逆转录为cDNA进行DNA芯片技术分析.在135个差异表达基因中发现有24个基因表达水平显著上调,121个基因表达水平显著下调.差异表达基因与细胞增殖、分化、凋亡和信号传导等有关.结论：应用基因表达谱芯片技术成功筛选了野生型K-ras2转染结肠癌细胞后差异表达基因,反映出野生型K-ras2对细胞增殖、代谢、转录调控等过程的负性调控状态,为进一步阐明野生型K-ras2可能的生物学功能提供了新的线索.     

应用基因芯片技术筛选胰腺癌相关基因

目的应用基因芯片技术筛选胰腺癌相关基因。方法将14000种人类基因PCR产物按微矩阵排列点样于化学涂层的载玻片上，制成基因芯片。按一步法抽提4例胰腺癌和癌旁正常胰腺组织的总RNA，将等量的RNA分别逆转录合成荧光分子掺人的cDNA一链作探针，混合后杂交上述基因芯片。经严格洗片后用ScanArray 4000扫描仪扫描芯片荧光信号图像，每点上两种荧光信号的强度分别代表Cy5-dCTP和Cy3-dCTP的量，获得的荧光信号图像用计算机分析。结果按差异显著性标准，从14000个基因中筛选出在胰腺癌组织中共同差异表达基因189条，其中已知基因101条，新基因88条。在筛选出的已知基因中，有50条表达上调，51条表达下调。结论基因芯片技术的肿瘤基因表达谱分析能够高通量筛选胰腺癌相关基因。并高效对基因功能进行研究。胰腺癌基因表达谱的分析有助于认识肿瘤发病机制。     

基因芯片在肺癌发生相关基因筛查中的应用

目的 研究人肺癌发生相关基因表达谱,探讨肺癌发生的分子机制。方法 选取1280个与肿瘤相关的基因克隆。制备成肿瘤相关cDNA芯片。提取人肺癌组织以及相应正常组织RNA,反转录后标记为cDNA探针,与cDNA芯片杂交,经扫描及Quantarray3．0软件分析后比较两种组织中的差异表达基因。结果 共筛查出差异表达基因52条。其中表达上调基因35条,下调基因17条;按照基因功能可分为运输载体,代谢相关基因、细胞信号转导分子、细胞骨架、转录调控因子以及未知功能基因。结论 基因芯片可用于肺癌相关基因表达谱的筛查,为明确肺癌发生机制提供重要参考。     

表达谱芯片技术在罗勒多糖抗肿瘤机制研究中的应用

目的探讨表达谱芯片技术在罗勒多糖抗肿瘤机制研究中的价值与作用。方法建立荷NuTu-19卵巢癌大鼠模型共20只,10只予罗勒多糖（2．5mg／kg）连续灌胃50d（药物组）,另10只予等量生理盐水灌胃50d（对照组）。以腹水量、腹腔脏器转移程度积分判断各组肿瘤生长及转移情况。分别用Cy3-dUTP、Cy5-dUTP标记两组癌组织cDNA,与含有2000点的大鼠基因表达谱芯片杂交。结果对照组与药物组共有168条基因出现差异表达。结论表达谱芯片技术可以快速确定药物作用的可能机制． 并为进一步研究提供重要信息。     

基因表达谱芯片筛选NS5ATP2剪切体NS5ATP2-512转染细胞差异表达基因

目的应用基因芯片技术检测丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活基因NS5ATP2剪切体512的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明NS5ATP2剪切体512蛋白可能的分子生物学功能。方法设计并合成NS5ATP2基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS5ATP2蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的NS5ATP2编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,在此过程中发现其剪切体NS5ATP2512并构建真核表达载体pcDNA3.1(-)NS5ATP2512。以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析。结果构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误。提取高质量的mRNA,逆转录为cDNA,进行DNA芯片技术分析。在1152个基因表达谱的筛选中,发现有14个基因表达水平显著上调,15个基因表达水平显著下调。结论应用基因表达谱芯片技术成功筛选了NS5ATP2剪切体NS5ATP2512转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明NS5ATP2512蛋白可能的生物学功能提供依据。