光损伤诱导视网膜上皮细胞半胱天冬酶－3表达与促红细胞生成素的干预效应*☆

背景：有实验表明，促红细胞生成素对视网膜的光化学损伤有保护作用，该作用与光化学损伤视网膜色素上皮细胞中半胱天冬酶-3表达的变化有关？ 目的：采用光刺激诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡，观察不同剂量促红细胞生成素对细胞半胱天冬酶-3表达的影响。 设计：观察对比实验。 单位：青岛大学医学院。 材料：成人视网膜色素上皮-19细胞株购自美国细胞培养收集公司。DMEM/F12混合培养基、新生牛血清、胰蛋白酶购自GIBCO生物技术公司。重组人促红细胞生成素购自Sigma生物技术公司。人半胱天冬酶-3定量EIA试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司。半胱天冬酶-3单克隆抗体购自美国Santa Cruz 公司；PV6001免疫组织化学试剂盒和DAB显色试剂盒购自北京中山生物技术公司。 方法：实验于2006-05/2007-01在青岛大学医学院病理生理教研室完成。取成人视网膜色素上皮-19细胞株传代培养的2~5代细胞建立光损伤模型，传代细胞随机分为7组，每组4孔，①正常对照组：不加光照，不加促红细胞生成素药物干预。②光损伤模型组：光照12 h，不加促红细胞生成素药物干预。③光损伤＋10 000U/L 促红细胞生成素组、光损伤＋20 000 U/L 促红细胞生成素组及光损伤＋40000 U/L 促红细胞生成素组：光照12 h，分别加10 000、20 000及40 000 U/L促红细胞生成素。④光损伤＋40 000 U/L促红细胞生成素组＋AG490组：光照12 h，加促红细胞生成素 40 000 U/L及Jak2激酶抑制剂 50 000 U/L。⑤光损伤＋40 000 U/L促红细胞生成素组＋蛋白激酶B特异性抑制剂组：光照12 h，加促红细胞生成素 40 000 U/L及蛋白激酶B特异性抑制剂100 μmol/L。 主要观察指标：采用酶联免疫吸附实验和免疫组织化学法定量检测不同含量促红细胞生成素干预治疗前后视网膜色素上皮细胞半胱天冬酶-3表达的变化。 结果：正常对照组半胱天冬酶-3无明显表达；光损伤模型组半胱天冬酶-3表达于视网膜色素上皮细胞核上，呈大量特异性黄色着色；光损伤不同剂量促红细胞生成素组半胱天冬酶-3表达的特异性黄色着色随促红细胞生成素含量增加而减弱，以光损伤＋40 000 U/L 促红细胞生成素组最弱光损伤＋40 000 U/L促红细胞生成素组＋AG490组半胱天冬酶-3呈强阳性表达，光损伤＋40 000 U/L促红细胞生成素组＋蛋白激酶B特异性抑制剂组半胱天冬酶-3表达仍呈阳性，但较光损伤模型组稍弱。 结论：重组人促红细胞生成素可减少视网膜色素上皮细胞的光损伤后半胱天冬酶-3的表达。重组人促红细胞生成素抗光损伤诱导的视网膜色素上皮细胞凋亡作用机制之一可能是抑制半胱天冬酶-3的表达。     

促红细胞生成素对大鼠内皮祖细胞生物学特点的影响

背景：内皮祖细胞是内皮细胞的前体细胞,可参与新生血管的形成。研究发现,促红细胞生成素对骨髓内皮祖细胞有动员作用,促进血管的新生和损伤组织修复。 目的：观察不同浓度促红细胞生成素对体外培养的大鼠内皮祖细胞功能的影响。 方法：提取Wistar大鼠股骨和胫骨骨髓,利用密度梯度离心方法分离单核细胞进行培养,分别在培养基中加入0,4,8 U/mL不同浓度的促红细胞生成素进行培养。培养7 d后,对内皮祖细胞利用FITC-UEA-1和 Dil-Ac-LDL共同染色方法进行鉴定;同时利用CD34和CD133共同标记,以流式细胞仪进行鉴定;采用黏附实验、迁移实验及MTT实验对其功能进行评定。 结果与结论：培养到7 d左右,细胞形态变化完全,细胞之间形成联接,并可以围成似管腔状形态,十二三天时,细胞融合,形成铺路石样。培养细胞荧光染色显示内皮祖细胞呈双阳性染色,经流式细胞仪鉴定培养的内皮祖细胞可以结合CD133和CD34。黏附实验、迁移实验及MTT实验显示,促红细胞生成素呈剂量依赖性提高内皮祖细胞的黏附、迁移和增殖能力。说明在0~8 U/mL浓度内,促红细胞生成素呈剂量依赖性提高内皮祖细胞的黏附、迁移和增殖功能。     

人参总皂苷诱导红系血细胞增殖的信号转导

背景: 研究证实多数造血生长因子通过JAKs-STATs途径转导信号,调节血细胞的增殖与分化。人参总皂苷能够促进早期的造血干/祖细胞向红系细胞分化,具有类似造血生长因子的功效,在红系血细胞发生中造血细胞膜表面红细胞生成素受体起着关键性的作用。 目的：通过红细胞生成素及其受体介导的JAK2/STAT5 信号转导途径,分析人参总皂苷定向诱导红系血细胞发生的分子机制。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2006-05/2008-10在在重庆医科大学基础医学研究所、组织胚胎学教研室完成。 材料：脐血细胞来源于正常足月妊娠产妇分娩脐带血,由重庆医科大学第一附属医院提供。人参总皂苷由重庆中药研究所惠赠,纯度95%以上,添加MI-1640培养液配成1 g/L的工作液。 方法：①集落形成实验：取5×106 L-1脐血单个核细胞,添加含马血清的RPMI-1640培养液,10,25,50,75,100 mg/L人参总皂苷组分别加入对应终浓度的人参总皂苷,并设立空白对照组。在96孔板上培养,0.2 mL/孔,14 d计数早期红系祖细胞,6 d计数晚期红系祖细胞。②取脐血单个核细胞悬液100 μL(5×108 L-1),进行MTT检测。③分别将0,25,50,100 mg/L人参总皂苷与脐血造血细胞1×109 L-1共培养24 h,进行Western blot检测。④取脐血造血细胞 1×109 L-1,对照组加入含体积分数为10%马血清的RPMI-1640培养液,人参总皂苷组在常规培养体系中加入终浓度25 mg/L人参总皂苷。分别用5 U/mL红细胞生成素诱导0,2,5,30 min后终止反应,进行免疫沉淀检测。 主要观察指标：人参总皂苷刺激红系造血祖细胞增殖的能力,红细胞生成素对脐血细胞增殖的影响,人参总皂苷对造血细胞红细胞生成素受体表达的影响,JAK2、STAT5蛋白酪氨酸磷酸化情况。 结果：10~75 mg/L人参总皂苷均能提高脐血细胞形成早期红系祖细胞、晚期红系祖细胞的集落产率,以25 mg/L提高幅度最为明显。2~50 U/mL红细胞生成素均能促进脐血细胞的增殖,以5 U/mL促进增殖效果最为明显。0~100 mg/L人参总皂苷作用脐血细胞24 h后,红细胞生成素受体的表达无明显变化。人参总皂苷作用造血细胞24 h后,加入红细胞生成素继续刺激0~30 min,JAK2和STAT5的酪氨酸磷酸化程度均明显增强。 结论：人参总皂苷在促进造血细胞增殖的过程中,尽管对造血细胞红细胞生成素受体的表达无明显影响,但可能通过在红细胞生成素受体介导的信号转导过程中增强JAK2和STAT5的酪氨酸磷酸化程度发挥作用。     

不同浓度重组人促红细胞生成素对神经干细胞体外培养增殖的影响

背景：重组人促红细胞生成素是一种糖蛋白，近年的研究表明其对神经细胞的许多功能活动均具有调节作用。 目的：观察不同浓度重组人促红细胞生成素对神经干细胞体外培养增殖的影响。 方法：提取新生SD大鼠神经干细胞，用含不同浓度(5，50，500 U/mL)重组人促红细胞生成素和20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养基进行培养，以不含重组人促红细胞生成素无血清培养基为对照组。细胞培养7 d后计算神经干细胞克隆形成率，培养10 d后计数NSE和GFAP免疫阳性细胞数。 结果与结论：添加重组人促红细胞生成素组细胞增殖较快，最终神经球的数量多于对照组，以50 U/mL重组人促红细胞生成素组作用显著；50 U/mL重组人促红细胞生成素组的生长速度显著快于对照组。50 U/mL重组人促红细胞生成素组中NSE和GFAP免疫阳性细胞明显多于对照组(P < 0.01)。结果表明重组人促红细胞生成素对神经干细胞体外培养增殖有促进作用，尤以适中浓度(50 U/mL) 作用更加明显。 关键词：重组人促红细胞生成素；神经干细胞；碱性成纤维细胞生长因子；体外培养；增殖     

局灶性脑缺血再灌注损伤模型大鼠与促红细胞生成素的神经保护作用

背景：近年来动物实验和体外细胞培养研究证实促红细胞生成素对脑缺血具有神经保护作用，有关促红细胞生成素脑保护的作用机制目前尚未阐明。 目的：通过观察缺血损伤区域脑组织细胞学形态，检测脑组织超氧化物歧化酶、丙二醛浓度，探讨促红细胞生成素对脑缺血再灌注损伤的保护作用。 方法：采用线栓法建立Wistar大鼠局灶性缺血再灌注损伤模型，分别于缺血后2 h腹腔注射生理盐水3 000 U/kg、促红细胞生成素3 000，1 000 U/kg，并设假手术组。缺血再灌注损伤24 h后，应用苏木精-伊红染色法检测大鼠脑组织病理学变化，应用黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法分别测定超氧化物歧化酶活性和丙二醛浓度。 结果与结论：形态学结果显示促红细胞生成素高剂量组较生理盐水组皮质神经细胞存活数量增多，损伤程度减轻；促红细胞生成素高、低剂量组超氧化物歧化酶活性均明显高于假手术组和生理盐水组(P < 0.05)，丙二醛浓度明显低于假手术组和生理盐水组(P < 0.05)；促红细胞生成素高剂量组超氧化物歧化酶活性明显高于促红细胞生成素低剂量组，丙二醛含量明显低于促红细胞生成素低剂量组(P < 0.05)。提示经腹腔注射促红细胞生成素，可使大鼠脑缺血再灌注损伤区神经细胞存活数量明显增加，可显著改善组织的病理学改变，其保护作用可能是通过促红细胞生成素清除自由基，拮抗过氧化损伤实现的。     

促红细胞生成素与内皮祖细胞在脑损伤中的应用前景

内皮祖细胞是内皮细胞的前体细胞,其可以参与出生后新生血管的生成,加速受损组织修复的作用得到广泛研究。促红细胞生成素具有很强的动员内皮祖细胞的作用,同时可以提高其自身生物学功能,而且有抗凋亡、下调炎症反应、抗氧化等非干细胞的生物学作用。所以将内皮祖细胞的作用和促红细胞生成素的作用有机的结合,应用在脑创伤患者上应具有很好的应用前景。     

黄芪多糖对2型糖尿病患者外周血内皮祖细胞PI3K/Akt/eNOS信号通路的影响

背景：前期研究证实黄芪通过P38MAPK通路促进内皮祖细胞增殖,其影响是否通过PI3K/Akt/eNOS途径实现？ 目的：观察黄芪多糖对2型糖尿病患者外周血内皮祖细胞蛋白激酶B、内皮型一氧化氮合酶表达的影响。 方法：采用密度梯度离心法获取糖尿病患者外周血单个核细胞,培养7 d后鉴定内皮祖细胞。观察0,50,200,800,3 200,6 400 mg/L黄芪多糖分别干预6,12,24,48 h对内皮祖细胞影响的量效和时效关系;用黄芪多糖及黄芪多糖与PI3K抑制剂LY294002联合干预糖尿病患者内皮祖细胞,Western blot检测磷酸化Akt及磷酸化内皮型一氧化氮合酶的表达水平。以未进行任何处理健康人内皮祖细胞作为对照组。 结果与结论：糖尿病患者内皮祖细胞的增殖能力较对照组明显下降(P < 0.05)。黄芪多糖显著增加糖尿病患者内皮祖细胞的增殖能力,当黄芪多糖在200~800 mg/L质量浓度范围,干预6~24 h可呈时间及剂量依赖性增强内皮祖细胞的增殖能力(P < 0.01),并呈剂量依赖性升高内皮祖细胞磷酸化Akt及磷酸化内皮型一氧化氮合酶的表达(P < 0.05);PI3K抑制剂LY294002能阻断黄芪多糖诱导的Akt、内皮型一氧化氮合酶的磷酸化(P < 0.05)。说明黄芪多糖通过激活PI3K/Akt/eNOS信号通路促进内皮祖细胞增殖和向内皮细胞的分化。     

重组人类肝细胞生长因子对胶质瘤细胞增殖及VEGF表达的影响

目的探讨重组人类肝细胞生长因子(rhHGF)对胶质瘤细胞增殖及血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法用5、10、20、30μg/L不同浓度的rhHGF作用于体外培养的U251胶质瘤细胞并设立空白对照组,甲基噻唑基四唑(MTT)法检测细胞增殖;免疫组化及Westernblot检测增殖细胞核抗原(PCNA)和VEGF表达。结果与对照组相比,rhHGF明显促进U251细胞的增殖和生长,其作用呈时间效应关系和一定浓度范围内的剂量效应关系(P<0.05)。Westernblot及免疫组化检测显示,20μg/LrhHGF作用后U251细胞PCNA和VEGF表达上升,呈时间依赖性(P<0.05);细胞外调节蛋白激酶(ERK)抑制剂PD98059呈剂量依赖性抑制rhHGF诱导的PCNA和VEGF表达增加。结论rhHGF可能通过ERK信号途径促进胶质瘤细胞增殖和VEGF表达,从而影响胶质瘤的生长和血管发生。     

细胞外信号调节激酶在蛛网膜下腔出血损伤中的作用及意义

目的研究细胞外信号调节激酶(ERK)途径在蛛网膜下腔出血(SAH)脑损伤中的作用。方法ICR小鼠随机分为假手术组、模型组、U0126干预组,采用非开颅血管内穿线法制备小鼠SAH模型,给予ERK抑制剂U0126,术后行颅底检查,分别在SAH后12、24、48h 3个时相点取右侧大脑动脉标本,在光镜下观察大脑中动脉病理变化,应用免疫印迹法检测各组p-ERK1/2、caspase-8蛋白表达,TUNEL法检测大脑中动脉内皮细胞凋亡。结果随损伤时间延长,模型组小鼠p-ERK1/2、caspase-8蛋白均有不同程度增强,凋亡细胞增多。与模型组比较,U0126干预组小鼠各时相点3项指标的表达均不同程度下调。结论 ERK信号途径参与小鼠SAH病理损伤过程,并在神经细胞凋亡进程中发挥关键作用。     

溶血磷脂酸通过ERK1/2通道诱导在体海马星形胶质细胞增殖

目的:探讨溶血磷脂酸( lysophosphatidic acid,LPA)对在体海马星形胶质细胞（astrocyte,AST）活化增殖的影响及其可能的作用机制。方法:在立体定向仪下向大鼠海马CA1区注射50μmol LPA以及LPA和U0126 混合液5μl,在不同时间点采用免疫荧光双标记法检测磷酸化ERK1/2 (p-ERK1/2)和胶原纤维酸性蛋白(GFAP)含量并使用激光共聚焦扫描、三维重建观察二者空间关系。结果:LPA注射后,GFAP阳性细胞数以及p-ERK1/2显著增加(P＜0.05);p-ERK1/2早期(≤7d)主要在神经元分布区域检测到,后期(≥7d)发现p-ERK1/2主要在GFAP阳性细胞中表达。注射U0126与LPA混合液的部位未能检测到p-ERK1/2,GFAP阳性细胞数目轻度增加。结论:LPA可以通过磷酸化ERK1/2诱导大鼠海马AST增殖。     

Denervation study of synapses of organ of corti of old world monkeys

Fine structural characteristics of synapses in the spiral organ of Corti were examined, with reference to differences between inner and outer haircell systems, and to location of neurons of origin of efferent axons. Surgical interruption of crossed olivocochlear bundle, of vestibular nerve, of facial nerve, and excision of superior cervical ganglia were used to determine the pathways of efferent axons. Interruption of the vestibular nerve near the brainstem results in degeneration of all efferent terminals on outer hair cells. Mid-line lesions at, and caudal to, the facial colliculus result in degeneration of about half of these efferent terminals. Efferent synaptic bulbs to the inner hair-cell system are small, of the order of one micron, and form type 2 junctions with afferent dendrites. They tend to have more large dense-core vesicles (about 80 nm) than the large efferent terminals of the outer hair-cell system, and appear to be the terminals of axons in the habenula perforata, which exhibit varicosities laden with large dense core vesicles. The varicosities are unaffected by excision of the superior cervical ganglia. So far as our material can reveal, it appears that the varicosities in the habenula perforata do not survive vestibular root interruption, nor do the efferent processes in the internal spiral bundle or at the base of inner hair cells. Most interestingly, the afferent processes of the inner hair-cell system, as identified for example by their relation to pre-synaptic bodies in the inner hair cells, are subject to a trans-synaptic reaction after severance of the vestibular root. They undergo a dramatic cytological transformation, characterized by increase of volume, engorgement with microtubules, microfilaments, microvesicles of various sizes, and clusters of lysosomes. Thus, both the efferent and afferent terminals of the inner hair-cell system show marked cytological differences from the corresponding terminals of the outer hair cell system.     

Mechanism of action of tubocurarine on nicotinic cholinoreceptors of neurons of the sympathetic ganglia of rats

Tubocurarine (Tc) effect on membrane currents elicited by acetylcholine (ACh) was studied in isolated superior cervical ganglion neurons of rat using patch-clamp method in the whole-cell recording mode. The "use-dependent" block of ACh current by Tc was revealed in the experiments with ACh applications, indicating that Tc blocked the channels opened by ACh. Mean lifetime of Tc-open channel complex, tau, was found to be 9.8 +/- 0.5 s (n = 7) at -50 mV and 20-24 degrees C. tau exponentially increased with membrane hyperpolarization (e-fold change in tau corresponded to the membrane potential shift by 61 mV). Inhibition of the ACh-induced current by Tc (3-30 microM/1) was completely abolished by membrane depolarization to the level of 80-100 mV. Inhibition of ACh-induced current was augmented at increased ACh doses. It is concluded that the open channel block produced by Tc is likely to be the only mechanism for Tc action on nicotinic acetylcholine receptors in superior cervical ganglion neurons of rat.     

The effect of age of onset of PD on risk of dementia

Background Dementia occurs in the majority of patients with Parkinson’s disease (PD). Late onset of PD has been reported to be associated with a higher risk for dementia. However, age at onset (AAO) and age at baseline assessment are often correlated. The aim of this study was to explore whether AAO of PD symptoms is a risk factor for dementia independent of the general effect of age. Methods Two community-based studies of PD in New York (n = 281) and Rogaland county, Norway (n = 227) and two population-based groups of healthy elderly from New York (n = 180) and Odense, Denmark (n = 2414) were followed prospectively for 3–4 years and assessed for dementia according to DSM-IIIR. All PD and control cases underwent neurological examination and were followed with neurological and neuropsychological assessments. We used Cox proportional hazards regression based on three different time scales to explore the effect of AAO of PD on risk of dementia, adjusting for age at baseline and other demographic and clinical variables. Findings In both PD groups and in the pooled analyses, there was a significant effect of age at baseline assessment on the time to develop dementia, but there was no effect of AAO independent of age itself. Consistent with these results, there was no increased relative effect of age on the time to develop dementia in PD cases compared with controls. Interpretation This study shows that it is the general effect of age, rather than AAO that is associated with incident dementia in subjects with PD. Received in revised form: 22 December 2005     

Limits of deinstitutionalization--perspectives of relatives of psychiatric patients

After a hopeful beginning, the social process of the reintegration of those with severe mental illness has come to a standstill. I am led to wonder whether "the community" really wants to live together with people suffering from severe mental illness, and if so, how closely? As long as the medical treatment of mental illness provided by the general practitioners is fundamentally deficient, as they are not able to prescribe the necessary interventions--such as out-patient psychiatric nursing, and service providers in the out-patient sector are content with offering increasingly intensive forms of care for the less seriously ill at the cost of the Social Welfare System--the reintegration of those with serious mental illness remains an illusion--which is mainly to the benefit of providers of residential care in homes and hostels.