抗幽门螺杆菌粘附素HpaA卵黄抗体的制备

目的研制高效价特异性的抗幽门螺杆菌黏附素鸡卵黄抗体免疫球蛋白抗体。方法用纯化重组幽门螺杆菌黏附素(Helicobacter pyloriadhesin A,rHpaA)抗原免疫22周龄罗曼鸡,母鸡免疫应答后,在卵黄中产生抗幽门螺杆菌黏附素抗体;经硫酸铵法初步纯化浓缩后;以间接ELISA鉴定抗体效价及免疫学活性;采用Bradford法测定蛋白含量;并用SDS-PAGE法测定分子量及鉴定抗体纯度。结果母鸡初次免疫第10d即有抗体产生,初次免疫后75d左右抗体效价超过1∶10000;最高可达为1∶12800。卵黄抗体经硫酸铵法纯化后,用SDS-PAGE分析,出现两条蛋白带,纯度达95%以上。其含量为10.56mg/ml蛋黄。结论本研究首次研制并鉴定抗黏附素卵黄抗体,开拓了我国预防幽门螺杆菌感染的新领域,分析了抗体在产蛋期卵黄液中表达的进度,为今后该抗体的持续、高质量诱导奠定基础。有望获得高效价、高产量的抗黏附素的IgY抗体(IgY-HpaA),为制备口服制剂开辟了广阔前景。     

幽门螺杆菌疫苗免疫保护机制及其研究进展

幽门螺杆菌(H.pylori)是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的主要病因,与胃恶性肿瘤的发生密切相关。根除H.py-lori对上述疾病的好转及治愈至关重要。目前常用药物(抗生素加秘剂或质子泵抑制剂)根除H.pylori,但因副作用大。复发率高及耐药菌株出现等使药物根除其的疗效受到影响。许多学者证实了免疫方法的可行性,但关于免疫保护的机制尚无定论。本文就H .pylori疫苗的免疫保护机制及其研究进展作一综述。保护机制一。抗体的作用病原微生物感染肠道后可刺激机体免疫反应,产生抗体分泌细胞,分泌以IgA为主的抗体,从而杀伤病原微生物。这是粘膜免疫…     

优化构建UreB/HpaA双价幽门螺杆菌减毒活菌疫苗的免疫保护作用

目的 以减毒鼠伤寒沙门菌为载体，通过在UreB和HpaA间引入由3个甘氨酸残基组成的三肽柔韧接头，构建成UreB／HpaA双价抗幽门螺杆菌(Hp)活疫苗，并对照相应单价疫苗和空白载体研究其对C57BL／6小鼠的免疫保护效果。方法 用序列重叠延伸聚合酶链反应扩增带3个甘氨酸残基柔韧接头的融合基因UreB／HpaA，进一步以减毒鼠伤寒沙门菌SL3261为载体构建UreB／HpaA双价活疫苗，观察其在小鼠体内的稳定性。用双价活疫苗株免疫Ⅱ级C57BL／6小鼠1次，对照单价活疫苗和空白载体观察其在体内诱导的特异抗体反应和对小鼠的免疫保护作用。结果 测序结果显示，3个甘氨酸残基的编码序列GGTGGAGGC已成功地插入UreB／HpaA融合基因中。双价疫苗灌喂小鼠后，至少能在脾脏和回肠末段存留10d。双价疫苗在小鼠体内诱导血清特异性IgGl和IgG2a水平明显升高。UreB／HpaA双价疫苗的免疫保护率为77．3％(17／22)，而UreB疫苗和HpaA疫苗的免疫保护率分别为50．0％(12／24)和43．5％(10／23)。结论 引入柔韧接头，优化构建表达UreB和HpaA的双价抗Hp活疫苗。UreB／HpaA双价活疫苗对Ⅱ级C57BL／6小鼠有更好的免疫保护作用。     

幽门螺杆菌融合蛋白UreB-Omp11在大肠杆菌中的表达与纯化

近年来,研究者发现了多种Hp的有效保护性抗原成分,UreB、Omp、Hsp、NAP等,其中尿素酶、外膜蛋白等是人们研究的焦点。但它们单独免疫动物时,获得的免疫保护效果均不理想,为克服单一抗原分子诱导的免疫保护水平偏低的问题,本研究用重叠延伸PCR法将H.pylori郑州分离株MELHP27的ur     

胃黏蛋白在抗幽门螺杆菌感染中的作用

黏蛋白(MUCs)是特殊的上皮细胞分泌的大分子量的糖蛋白,是构成胃黏液凝胶的主要组成成分.多项研究显示幽门螺杆菌(H.pylori)通过其表面的黏附素分子或非黏附素分子与胃黏蛋白结合从而定植在胃黏膜上皮上.在H.pylori感染过程中,H.pylori导致了胃黏蛋白的表达发生了改变.反之,胃黏蛋白也因其特有的结构在抗H.pylori感染中也发挥了重要作用.此文就目前有关胃黏蛋白在抗H.pylori感染中的作用的研究现状及进展作一简要概述.     

幽门螺杆菌唾液酸结合黏附素（SabA）的克隆表达

[摘要] 目的：构建幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,简称H.pylori或HP）唾液酸结合黏附素（sialic acid-binding adhesion,SabA）的重组质粒,并在大肠杆菌BL21中表达,为探讨SabA的功能及相关疫苗的发展提供帮助。方法：以HP 26695株基因组为模板,设计sabA基因特异性引物扩增目的基因,将PCR产物插入到pGEX-4T-1载体构建重组质粒,在大肠杆菌BL21中诱导表达。表达蛋白经飞行质谱鉴定,并用免疫印迹法评价其抗原性。结果：经SDS-PAGE和飞行质谱鉴定,该表达蛋白为HP外膜蛋白,经免疫印法迹检测具有良好的抗原性。结论：成功克隆了HP的SabA,并能在大肠杆菌BL21中表达,该蛋白具有良好的抗原性。     

外膜蛋白疫苗对幽门螺杆菌感染的免疫保护作用

研究幽门螺杆菌(H.pylori)外膜蛋白(OMP)加大肠杆菌不耐热内毒素(LT)经口免疫对小鼠H.pylori感染的保护作用。探讨定量细菌培养在疫苗免疫效果评价中的应用。方法从H.pyloriNCTC11637菌株制备OMP和全菌超声粉碎抗原,LT作为粘膜免疫佐剂。通过灌胃分别以H.pylori全菌超声粉碎抗原1mg加LT10μg(A组)、H.pyloriOMP0.5mg加LT10μg(B组)和生理盐水(C组)免疫小鼠(n=30),每周1次,共4次。免疫完成后4周以H.pyloriSydneyStrain1菌株攻击小鼠1次(1×107CFU/只),攻击后4周处死小鼠,取胃分别作快速尿素酶试验、病理检查及定量细菌培养,观察H.pylori定植情况。结果C组小鼠Hpylori定植密度为2.40×107CFU/g胃组织,A组和B组小鼠分别为2.03×105CFU/g和6.76×105CFU/g胃组织,免疫组的定植密度明显降低。结论口服HpyloriOMP加LT对小鼠H.pylori感染具有一定免疫保护作用,但不能完全预防感染,需进一步筛选更为有效的抗原和佐剂。定量细菌培养可以更敏感、更客观地反映胃粘膜H.pylori定植量和评价疫苗免疫效果。     

幽门螺杆菌粘附素与大肠杆菌LtB融合疫苗的口服免疫与预防试验

目的　观察幽门螺杆菌粘附素HpaA与大肠杆菌LtB融合蛋白质经口服免疫BALB/c小鼠后机体产生的免疫应答和蒙古沙鼠免疫预防作用。方法　用PCR方法扩增HpaA和LtB目的基因片段 ,将LtB与 pPIM质粒连接后 ,再与HpaA基因连接 ,转化大肠杆菌DH5α ,经酶切获得含有ltB -hpaA的pPIM -ltB/hpaA融合质粒。将重组质粒转化E coliBL2 1(DE3) ,筛选获得重组工程菌 ,经发酵、包涵体提取 ,复性 ,纯化获得LtB -HpaA。BABL/c小鼠设正常对照组、单独rHpaA对照组、CT +HpaA实验组、融合蛋白LtB -HpaA组和rLtB +rHpaA实验组 ,免疫 4周后检测血清抗原特异性IgG、IgA和胃冲洗液、肠冲洗液中sIgA。蒙古沙鼠分 3个实验组 ,正常对照 (PBS)组 ,单独HpaA免疫组和LtB -HpaA组 ,免疫 4周 ,于末次免疫后 14天灌活力良好的H pyloriSS1活菌 ,1个月处死动物 ,采集标本 ,用细菌培养和病理切片检查评价蒙古沙鼠的免疫保护作用。结果　融合蛋白LtB -HpaA组及将CT和LtB作为外粘膜佐剂的CT +HpaA组和LtB +HpaA组中血清IgA和IgG、胃冲洗液和肠冲洗液中sIgA含量明显高于单独HpaA组和对照组 ,差异非常显著 (P <0 0 0 1)。蒙古沙鼠融合蛋白rLtB-HpaA组比单纯rHpaA组效果明显 (rLtB -HpaA组保护率为 80 % ,单独rHpaA为 2 0 % )。 结论　融合蛋白质LtB     

幽门螺杆菌融合蛋白HspA-UreB在大肠杆菌中的表达与鉴定

目的在大肠杆菌中表达幽门螺杆菌(简称Hp)HspA-UreB融合蛋白,并探索其免疫反应性,为Hp基因工程疫苗的研制奠定基础。方法用PCR方法扩增郑州分离Hp菌株MEL-HP27的hspA和ureB基因,分别克隆入pNEB193中。测序后,回收两种基因片段,并以hspA-ureB的顺序连接插入原核表达载体pMAL-C2x进行融合表达。采用蛋白印迹法对表达产物进行鉴定。结果特异PCR法和酶切鉴定证实融合基因hspA-ureB克隆入表达载体中;重组质粒转化大肠杆菌TB1后,经IPTG诱导3h,SDS-PAGE电泳显示在119kDa处出现一条特异蛋白带,即麦芽糖结合蛋白(MBP)与HspA-UreB的融合表达形式,约占细菌总体蛋白含量的31%;该融合蛋白与Hp免疫小鼠血清和Hp阳性病人血清的Westernblot分析结果显示,在119kDa处出现特异杂交带。结论成功地在大肠杆菌中实现了Hp融合蛋白HspA-UreB的高效表达,并证实其具有良好的免疫反应性。     

Fusion expression of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein in E.coli

AIM: To produce a recombinant protein rMBP-NAP, which was fusionally expressed by Helicobacter pylori (H pylori) neutrophil-activating protein (NAP) and E. coli maltose binding protein (MBP) and to evaluate its immunoreactivity and immunogenicity. METHODS: Neutrophil-activating protein gene of H pylori (HP-napA) was subcloned from the recombinant plasmid pNEB-napA, and fused to MalE gene of expressing vector pMAL-c2x. The recombinant plasmid pMAL-c2x-napA was confirmed by restriction enzyme digestion, and then transformed into E. coli TB1. Fusion protein rMBP-NAP was induced by IPTG and identified by SDS-PAGE analysis. Soluble rMBP-NAP was purified by amylose affinity chromatography. Immunoreactivity and immunogenicity of the fusion protein were evaluated by animal experiment, Western blotting with human H pylori anti-sera. RESULTS: E.coli TB1 carrying recombinant plasmid pMAL-c2x-napA was constructed and led to a high efficiency cytosol expression of fusion protein rBMP -NAP when induced by IPTG. The molecular weight of rBMP-NAP was about 57 kD, accounting for 37.55% of the total protein in the sonicated supematant of E. coli TB1 (pMAL-c2x-napA). The purity of the fusion protein after one-step affinity chromatography was 94% and the yield was 100 mg per liter of bacterial culture. The purified fusion protein could be specifically recognized by both human anti-sera from clinical patients with H pylori infection and rabbit sera immunized by rMBP-NAP itself. CONCLUSION: Recombinant protein rMBP-NAP might be a novel antigen for vaccine development against H pylori.     

重组抗原LTB-UreB-HpaA对幽门螺杆菌感染小鼠的免疫保护性及内置佐剂LTB的免疫增强作用(英文)

目的构建大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)和幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(UreB)、幽门螺杆菌粘附素A(HpaA)的融合基因ltBureBhpaA及其原核表达系统,鉴定重组表达产物rLTBUreBHpaA的免疫原性、佐剂活性及对Hp感染小鼠的保护作用。方法采用连接引物PCR构建ltBureBhpaA融合基因,TA克隆后测序。采用pET42a质粒及其宿主菌E.coliBL21DE3亚克隆构建原核表达系统pET42altBureBhpaAE.coliBL21DE3,并用不同浓度IPTG诱导表达。SDSPAGE用于检测rLTBUreBHpaA的表达及其产量,免疫双扩散试验及Western印迹法检测rLTBUreBHpaA抗原性和免疫反应性。建立牛GM1的ELISA(GM1ELISA)检测重组蛋白中rLTB的佐剂活性。采用HpSS1株BaLb/C小鼠感染模型,检测rLTBUreBHpaA的免疫保护作用。结果ltBureBhpaA核苷酸序列与各原始基因序列完全相同。不同浓度的IPTG均可诱导pET42altBureBhpaAE.coliBL21DE3表达rLTBUreBHpaA,其产量约为细菌总蛋白的15%。rLTBUreBHpaA家兔抗血清的双扩效价为1∶8。商品化兔抗Hp全菌抗体、兔抗UreB或HpaA均能识别rLTBUreBHpaA并与之结合。GM1ELISA结果证实rLTBUreBHpaA仍具有结合牛GM1的活性。rLTBUreBHpaA(200μg/每只小鼠)免疫后,可使小鼠100%免于HpSS1株的感染。10μgrLTB与rUreB或rHpa共同免疫小鼠,可使保护率分别从66.7%提高至81.8%和83.3%。结论本研究成功地构建了ltBureBhpaA融合基因及其原核表达系统。目的表达产物rLTBUreBHpaA有良好的免疫原性、佐剂活性及免疫保护效果,具有作为Hp基因工程疫苗的应用前景。     

幽门螺杆菌临床株粘附素HapA基因的克隆表达及在诊断中的价值

目的　构建表达幽门螺杆菌临床株粘附素 (HpaA)的重组质粒 ,在大肠杆菌中表达获得重组蛋白 ,探讨重组蛋白作为Hp抗原在感染诊断中的价值。 方法　用PCR方法从幽门螺杆菌临床株DNA中扩增HpaA基因片段。克隆及序列分析后在大肠杆菌中进行高效表达 ,表达产物经纯化和Westernblot鉴定后 ,作为Hp抗原 ,ELISA法对 10 0例临床标本进行相应抗体检测 ,并与细菌培养、组织学染色和快速尿素酶试验比较来评价其应用的可行性。结果　经酶切、测序分析插入的基因片段全长 783bp ,与基因文库中的粘附素基因同源性达 98 87%。表达蛋白经SDS -PAGE分析 ,相对分子量 (Mr)约为 300 0 0 ,可溶性表达占全菌的 4 1 6 7%以上 ,经亲和层析后可获得纯度为 90 %以上的重组蛋白。Westernblot证实了其免疫反应性。通过对临床病例的检测结果显示细菌培养、组织学染色、快速尿素酶试验和HpaA抗体检测的敏感性、特异性和准确性分别为 10 0 0 %和 80 9% ;10 0 0 % ;和 90 5 % ;90 5 %和 85 8% ;93 3%和 85 9% ,相差不多。结论　HpaA能在大肠杆菌中高效表达 ,具有较强的免疫反应性 ,作为检测试剂敏感性和特异性均较好 ,有望成为Hp新的非侵入性的检测方法。     

幽门螺杆菌VacA蛋白的纯化

目的对幽门螺杆菌(Hp)相对分子质量(Mv)95×10~2的VacA蛋白进行分离纯化。为进一步研究VaGA的作用机制奠定基础.方法采用经硫酸铵沉淀及透析后得到的Hp ccUG17874菌株浓缩上清,应用吸附层析、疏水层析、阴离子交换层析及凝胶过滤等液相层析方法进行VacA蛋白的纯化.每步层析后得到的样品均检测蛋白浓度及空泡毒素活性并行SDS-PAGE电泳检测蛋白成分.结果纯化蛋白的Mr为95×10~3,电泳纯,具有明显的空泡毒性,比活力达20480,与上清原液相比纯化倍数提高了4550倍,产率约为5μg/L.结论采用吸附层析、疏水层析、离子交换层析及凝胶过滤的纯化流程,可以成功分离纯化Hp液体培养上清液中的VacA,纯化的VacA蛋白可用于Hp致病机理的研究.     

Helicobacter pylori neutrophil activating protein as target for new drugs against H. pylori inflammation

Helicobacter pylori(H.pylori) infection is among the most common human infections and the major risk factor for peptic ulcer disease and gastric cancer.With-in this work we present the implication of C-terminal region of H.pylori neutrophil activating protein in the stimulation of neutrophil activation as well as the evi-dence that the C-terminal region of H.pylori activating protein is indispensable for neutrophil adhesion to endothelial cells,a step necessary to H.pylori inflammation.In addition we show t...     

蛋白质二硫键异构酶在幽门螺杆菌感染者胃黏膜中的表达及意义

目的：了解蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)在幽门螺杆菌(H pylon)感染人胃黏膜组织中的表达情况．方法：分别应用半定量RT-PCR方法及Westem blot方法检测感染(n=32)与未感染(n=28)H pylori的人胃黏膜组织中PDI mRNA及蛋白的表达情况．结果：未感染组PDI mRNA及蛋白表达量分别为0．5704±0．0794,0．5198±0．0379,感染组PDI mRNA及蛋白表达量分别为1．0642±0．1533,0．8252±0．0321：两组相比差异显著(P＜0．01)．结论：正常情况下胃黏膜组织有PDI mRNA的表达及蛋白的合成,H pylori感染可使胃黏膜增加PDI mRNA的表达及蛋白的合成．     

肠化胃黏膜病变组织HSP60的表达与幽门螺杆菌感染的相关性

目的:探讨HSP60在肠化胃黏膜组织中的表达及与H pylori感染之间的关系.方法:对171例肠化胃黏膜组织其中I型肠化54例、Ⅱ型肠化76例、Ⅲ型肠化41例,对照组浅表性胃炎40例,胃癌49例,采用SP免疫组织化学技术进行胃黏膜HSP60的检测,用ELISA,H pylori IgG抗体检测及H pylori-DNA PCR方法进行H pylori感染情况的判定.结果:HSP60在肠化胃黏膜组织中的表达主要为中等强度阳性,Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ型肠化胃黏膜组织的阳性率分别为35.19%,51.32%,75.61%,过表达率分别为1.9%,3.9%和19.5%;浅表性胃炎组织中的表达多为弱阳性或中等强度阳性,阳性表达率为30.00%,与浅表性胃炎相比肠化胃黏膜组织中HSP60的表达显著增加(P＜0.01);HSP60在胃癌组织的表达以强阳性和中等强度阳性为主,阳性表达率为73.47%,过表达率为34.69%,明显高于Ⅰ,Ⅱ型肠化胃黏膜组织中的表达,与Ⅲ型肠化胃黏膜组织相比差异不显著(P＞0.05),肠化胃黏膜组织的Hpylori感染和HSP60表达有明显的相关性(r=-0.191,P=0.012)结论:HSP60的过度表达发生在胃黏膜病变的进展过程中;肠化胃黏膜组织中H pylori感染和HSP60表达有明显的相关性.