大肠癌错配修复基因hMLH1突变与微卫星不稳二维DNA电泳及DNA测序技术的意义

背景微卫星不稳是一种重要的基因改变方式,在肿瘤的发生中起重要作用,其发生是由于错配修复基因发生缺陷所致.错配修复基因hMLH1突变在遗传性非息肉性大肠癌中的作用已有报道,但在散发性大肠癌的作用尚缺乏深入的研究.目的探讨错配修复基因hMLH1突变在大肠癌发生中的作用及与微卫星不稳的关系.设计单一样本实验.单位解放军第三军医大学西南医院消化科.材料76例大肠癌及相应正常组织均为2001-01/2003-12西南医院外科手术切除标本,所有患者均无肿瘤家族史,并未接受过放疗和化疗,对实验知情同意.方法采用二维DNA电泳和DNA测序技术检测hMLH1突变;采用聚合酶链反应为基础的方法检测微卫星不稳.主要观察指标①大肠癌hMLH1突变及微卫星不稳检出率.②微卫星不稳与hMLH1突变的关系.结果①76例大肠癌中检出hMLH1基因突变8例,突变率为10.5%,检出微卫星不稳20例,检出率为26.3%.右侧大肠癌hMLH1突变和微卫星不稳的检出率显著高于左侧大肠癌(6/26比2/50,x2=4.739,P=0.029;11/26比9/50,x2=5.212,P=0.022),hMLH1突变和微卫星不稳与肿瘤大小、分化程度、组织学类型、浸润深度、淋巴结转移和临床病理分期无显著相关.②将微卫星不稳分为高频率微卫星不稳(≥2个位点)10例、低频率微卫星不稳(仅为1个位点)10例和微卫星不稳阴性56例3组,8例hMLH1基因突变均发生于高频率微卫星不稳组,而低频率微卫星不稳和微卫星不稳阴性组未见有突变者.结论hMLH1基因突变与微卫星不稳多发生于右侧大肠癌,hMLH1突变与高频率微卫星不稳大肠癌的发生有关.     

应用二维ＤＮＡ电泳检测大肠癌错配修复基因ｈＭＬＨｌ突变

目的探讨大肠癌措配修复基因ｈＭＬＨｌ突变与微卫星不稳（ＭＳｌ）的关系。方法采用二维ＤＮＡ电泳和ＤＮＡ测序技术测ｈＭＬ检Ｈｌ突变，采用ＰＣＲ为基础的方法检测ＭＳｌ６结果７６例大肠癌中检出ｈＭＬＨｌ基因突变８例，突变率为１０．５％；检出ＭＳｌ２０例，检出率为２６．３％。右侧大肠癌ｈＭＬＨｌ突变和ＭＳＩ的检出率显高于左侧大肠癌（Ｐ＜０．０５），ｈＭＬＨｌ突变与肿瘤大小、分化程度、组织学类型、浸润深度、淋巴结转移和临床病理分期无显相关。将ＭＳｌ分为高频率ＭＳＩ（ＭＳＬＨ－Ｈ，≥２个位点）１０例、低频率ＭＳＩ（ＭＳＬＬ，仅为１个位点）１０例和ＭＳＩ阴性（ＭＳＳ）５６例三组，８例ｈＭＬＨｌ基因突变均发生于ＭＳＬＨ组，而ＭＳＬＬ和ＭＳＳ组未见有突变。结论ｈＭＬＨｌ基因突变与ＭＳＩ多发生于右侧大肠癌，ＭＳＩ的发生与ｈＭＬＨｌ突变有关。     

PCR-SSCP银染法在检测错配修复基因突变中的应用

目的建立稳定、有效地检测错配修复（Mismatch Repair，MMR）基因突变的方法。方法对30例肠癌及癌旁正常组织标本分别提取DNA，设计错配修复基因hMSH1引物，应用聚合酶链式反应进行PCR扩增，10％聚丙稀酰胺凝胶电泳PCR产物，银染等技术检测分析错配修复基因hMSHI突变；hMSH1抗体为一抗，免疫组化法检测30例肠癌及例癌旁正常组织石蜡切片中hMSH1蛋白的表达。结果30例肠癌组织中发生错配修复基因hMSH1突变4例（发生率13．3％），10例癌旁正常组织中无一例发生错配修复基因hMSH1突变；免疫组化检测到30例肠癌组织中有6例hMSH1蛋白表达阴性，其中hMSH1基因突变的组织hMSH1蛋白均未表达，正常组织中hMSH1蛋白表达正常。结论PCR-SSCP银染法是检测错配修复基因突变的简捷、稳定、有效的方法之一。可成为早期诊断肿瘤发生的分子手段。在肿瘤的早期治疗中具有重要作用。     

散发性结直肠癌中MMR与突变p53的表达

目的　探讨错配修复基因MMR(hMSH2与hMLH1基因 )在散发性结直肠癌发生中的作用。方法　采用PCR SSCP和PCR产物直接测序法对 41例散发性结直肠癌患者肿瘤组织及正常组织的hMSH2、hMLH1与p53基因进行检测。结果　41例散发性结直肠癌中,有 2例发生hMSH2基因突变,占 4. 88% (2 /41), 5例发生hMLH1基因突变,占 12. 20% (5 /41), 20例发生p53基因突变,占 48. 78% (20 /41)。hMLH1和hMSH2基因在p53突变患者的突变率 30. 00% (6 /20)显著高于p53未发生突变患者的突变率 4. 76(1 /21) (P<0. 05)。结论　部分散发性结直肠癌患者中存在MMR基因缺陷,其中hMLH1基因的作用大于hMSH2。MMR基因突变与p53突变密切相关。     

微卫星不稳定性─大肠癌发生的新机制

错配修复基因是遗传性非息肉性大肠癌综合征的遗传易感基因，该基因突变使细胞错配修复功能缺陷，结果引起微卫星不稳定性，致使DNA复制的精确性降低，并与遗传性非息肉性大肠癌和部分散发性大肠癌的发生相关。因此，微卫星不稳定性可能是大肠癌发生过程中一个新发现的重要机制。     

错配修复基因及其在妇科肿瘤中的研究进展

错配修复基因是细胞内负责对碱基错配进行修复的基因,它们的突变或者功能缺陷将导致错配碱基不能及时有效纠正,基因突变累积,引起微卫星不稳定,并最终导致肿瘤发生。随着近年来对遗传性非息肉病性大肠癌(HNPCC)遗传性的研究,人类错配修复基因的研究也得到了快速发展,错配修复基因与妇科肿瘤的发病也密切相关,现就其作用机制及其与妇科肿瘤的关系作一综述。     

微卫星不稳定性——大肠癌发生的新机制

错配修复基因是遗传性非息肉性大肠癌综合征的遗传易基因，该基因突变使细胞与修复功能缺陷，结果引起微卫星不稳定性，致使ＤＮＡ复制的精确性降低，并与遗传性非从性大肠癌和部分散发性大肠癌发生相关，因此，微卫星不稳定性可能是大肠癌发生过程中一人新发现的重要机制。     

p53基因在大肠癌发生转移及预后过程中的动态变化

背景：肿瘤相关基因在癌瘤发生、发展、转移及预后过程中的作用如何一直是医学界研究的难点。目的：了解变性梯度凝胶电泳(DGGE)和自动DNA序列分析方法检测肿瘤基因变异及p53基因、p53蛋白在大肠癌发生、转移过程中的动态变化，为大肠癌预后评估提供依据。设计：以组织标本为研究埘象的单一样本研究。单位：一所军医大学医院肿瘤科。对象：收集1994—01／2000—12解放军第一军医大学南方医院住院治疗的41例因大肠癌接受大肠根治性切除并于手术后5个月至5年内因肝转移接受肝切除术患者的大肠癌原发灶及肝转移灶标本。方法：以DGGE及自动DNA序列分析法检测41例大肠癌原发病灶和肝转移灶p53外显子5～11的基因突变以免疫组织化学方法检测p53蛋白表达。主要观察指标：①p53基因突变住DGGE中的检出情况及突变。②p53基因的序列分析；③p53免疫组织化学染色结果。结果：41例中24例有p53基因突变(62％)．其中6例仅在肝转移灶发现p53基因突变，其余均为原发灶、转移灶有一致性的突变。另有3例原发灶即有p53基因突变的患者，在转移灶除保留原有突变外，还出现新增加的突变。在原发、转移灶同时有突变的16例中．14例呈现突变的p53碱基峰和正常峰之比在肝转移灶明显高于大肠癌原发灶(P&;lt;0．001)。p53免疫组织化学染色结果和DGGE.DNA序列分析结果高度一致。但在基因分析呈无义突变的癌灶，免疫组织化学显示p53蛋白的过度表达。结论：在大肠癌肝转移过程中，p53基因突变主要开始于肠癌原发灶，并被保持于转移至肝脏的癌细胞内，在转移灶其含量或含突变型p53癌细胞量明显增加：p53基因突变与p53蛋白过度表达呈正相关关系。     

银染PCR—SSCP检测大肠癌p53基因突变

采用银染ＰＣＲ－ＳＳＣＰ法检测肠癌细胞株及３０例新鲜肠癌Ｐ５３基因突变。结果发现ＬＯＶＯ细胞ｐ５３基因外显子５、６、７发生突变，ＬＳ１７４Ｔ细胞Ｐ５３基因的外显子５、８发生突变，３０例新鲜肿瘤标本ｐ５３基因外显子５、６、７、８的突变例数各为４、０、４、４例。大肠癌Ｐ５３基因突变热点为外显子５、７、８。     

膀胱肿瘤中错配修复基因hMLH1启动子甲基化状态的研究

目的 探讨膀胱肿瘤中错配修复基因hMLH1启动子甲基化状态及其意义。方法 收集30对新鲜的膀胱癌组织及其癌周正常组织；采用甲基化特异聚合酶链反应（methylation specific PCR，MSP）检测hMLH1基因启动子区CpG岛的甲基化状态。结果 30对膀胱癌组织、癌周正常组织中hMLH1基因的甲基化阳性率分别为10／30、1／30，二者差异有统计学意义（P〈0．叭）；hMLH1基因甲基化阳性率在Ta-T1期、T2-T3期膀胱癌中分别为7／19、3／11，二者差异无统计学意义（P〉0．05）；在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级膀胱癌中分别为7／18、2／9、1／3，三者差异无统计学意义（P〉0．05）。结论 错配修复基因hMLH1在膀胱癌组织中有一定程度的过甲基化，但与膀胱癌的临床病理特点无显著相关性，提示hMLH1的异常甲基化可能参与了膀胱肿瘤的发生。     

Effect of incorporation of cidofovir into DNA by human cytomegalovirus DNA polymerase on DNA elongation.

Cidofovir (CDV) (HPMPC) has potent in vitro and in vivo activity against human cytomegalovirus (HCMV), CDV diphosphate (CDVpp), the putative antiviral metabolite of CDV, is an inhibitor and an alternate substrate of HCMV DNA polymerase. CDV is incorporated with the correct complementation to dGMP in the template, and the incorporated CDV at the primer end is not excised by the 3'-to-5' exonuclease activity of HCMV DNA polymerase. The incorporation of a CDV molecule causes a decrease in the rate of DNA elongation for the addition of the second natural nucleotide from the singly incorporated CDV molecule. The reduction in the rate of DNA (36-mer) synthesis from an 18-mer by one incorporated CDV is 31% that of the control. However, the fidelity of HCMV DNA polymerase is maintained for the addition of the nucleotides following a single incorporated CDV molecule. The rate of DNA synthesis by HCMV DNA polymerase is drastically decreased after the incorporation of two consecutive CDV molecules; the incorporation of a third consecutive CDV molecule is not detectable. Incorporation of two CDV molecules separated by either one or two deoxynucleoside monophosphates (dAMP, dGMP, or dTMP) also drastically decreases the rate of DNA chain elongation by HCMV DNA polymerase. The rate of DNA synthesis decreases by 90% when a template which contains one internally incorporated CDV molecule is used. The inhibition by CDVpp of DNA synthesis by HCMV DNA polymerase and the inability of HCMV DNA polymerase to excise incorporated CDV from DNA may account for the potent and long-lasting anti-CMV activity of CDV.     

人白细胞抗原B位点基因芯片分型技术研究

目的 探讨基因芯片技术在进行北方汉族人群人白细胞抗原B位点（HLA-B）分辨度分型的价值.方法 根据中国北方汉族人群HLA-B常见基因位点及临床分型分辨度特征,设计特异性寡核苷酸中分辨度分型探针,制成HLA-B基因分型芯片.采用荧光标记引物和不对称聚合酶链反应（PCR）扩增HLA-B 2、3外显子,产物与芯片探针杂交后经荧光扫描,并用特定软件分析判断阳性探针,以确定样品基因型.结果 用中分辨度探针从30份北方汉族人标本中可分出HLA-B 7～83范围的42个B抗原等位基因,与顺序特异引物聚合酶链反应（PCR-SSP）分型方法对比,多检出3个HLA-B14、73和82新等位基因.结论 HLA-B基因芯片具有较高的精确度和特异性,可一张芯片多人份检测,适合用于临床HLA-B抗原分型.     

微量接触类生物检材的游离 DNA 问题分析

目的探究接触类生物检材的游离DNA问题,游离DNA和细胞内DNA含量的比例问题,以及游离DNA在法医检验中的影响。方法对手部、面部和足部的皮肤及口腔粘膜进行模拟微量接触类检材的制备,对模拟检材进行浸泡,对游离DNA进行定量和STR扩增,对剩余检材使用常规程序进行DNA提取、定量和STR扩增,并对结果进行分析和讨论。 结果实验观察到,78.55%的样品检测到了游离DNA,其中,手部模拟检材的游离DNA检测率为82.1%,脸部模拟检材的游离DNA检测率为82.1%,口腔模拟检材的游离DNA检测率为96.4%,足部模拟检材的游离DNA检测率为53.6%,微量接触类检材中游离DNA量占DNA总量的12.9%。 结论接触类生物检材中提取到的DNA,除了包括细胞内DNA,还存在一定比例的细胞外游离DNA,这为微量接触类检材的DNA有效提取和检验提供了新的理论依据。       

Sequence-specific modification of genomic DNA by small DNA fragments

Small DNA fragments have been used to modify endogenous genomic DNA in both human and mouse cells. This strategy for sequence-specific modification or genomic editing, known as small-fragment homologous replacement (SFHR), has yet to be characterized in terms of its underlying mechanisms. Genotypic and phenotypic analyses following SFHR have shown specific modification of disease-causing genetic loci associated with cystic fibrosis, beta-thalassemia, and Duchenne muscular dystrophy, suggesting that SFHR has potential as a therapeutic modality for the treatment of monogenic inherited disease.     

Modification of hepatic genomic DNA using RNA/DNA oligonucleotides

The ideal gene therapy is one that repairs the precise genetic defect without additional modification of the genome. Such a strategy has been developed for correcting single nucleotide mutations by using RNA/DNA oligonucleotides, or chimeraplasts. This approach for in situ repair is based on the delivery of exogenous DNA designed to mediate genomic base conversion, insertion, or deletion, thereby, correcting the genetic mutation. Using in vivo delivery systems to hepatocytes via the asialoglycoprotein receptor, we targeted rat liver DNA and successfully modified the genomic sequence by chimeraplasty. The changes in both the hepatic genes, and their associated phenotypes remained stable for 2 years. In addition, we also examined the potential to alter sequence defects in mitochondrial DNA. Therefore, we determined whether mitochondria possess the enzymatic machinery for chimeraplast-mediated DNA changes. Using an in vitro DNA repair assay of mutagenized plasmids and an Escherichia coli readout system, we showed that extracts from highly purified rat liver mitochondria have the essential enzymatic activity to mediate precise single-nucleotide changes at a frequency similar to liver nuclear extracts. Moreover, single-stranded oligonucleotides carrying a single nucleotide mismatch with the target sequence were capable of promoting gene conversion using either mitochondrial or nuclear extracts. Several approaches now exist for the precise repair of genetic mutations using either single-stranded or RNA/DNA chimeric oligonucleotides.     

应用DNA探针检测石蜡包埋组织中结核杆菌DNA的研究

结核病是严重危害人类健康的传染病，近年来发病呈上升趋势。由于外界理化环境的影响及菌体的变异，传统抗酸染色阳性率大为降低。近年来，临床采用PCR等技术对体液标本中结核杆菌-DNA进行检测，使诊断率明显提高，但病理学石蜡包埋组织中结核杆菌的检测尚未建立稳定可靠的方法，我们对此进行了探索。