单核细胞趋化因子1发卡环RNA真核表达载体的构建

目的：构建单核细胞趋化因子1发卡环RNA真核表达载体。 方法：实验于2002—10／2003-05在解放军第二军医大学中心实验室完成。①单核细胞趋化因子1发卡小分子干扰RNA片段合成。（2）将发卡小分子干扰RNA克隆人质粒pSilencer产生重组质粒SiRNA—pSilencer-单核细胞趋化因子1。③分别用BamHⅠ和HindⅢ酶切鉴定，随机分为1，2样本，每份样本进行10次电泳，并且采用460bpi标准参照样。④将经酶切鉴定后的重组质粒作测序分析。 结果：①单核细胞趋化因子1发卡小分子干扰RNA片段被成功克隆进pSilencer-U6质粒中。②BamHⅠ和HindⅢ酶切鉴定可切出450bpi大小的片段，结果表明样本1，2均与参照以及marker相一致，从片段大小的角度初步确定酶切的准确。③DNA测序分析显示，重组质粒小分子干扰RNA编码序列与设计片段的序列完全一致。 结论：针对单核细胞趋化因子1发卡小分子干扰RNA片段的真核表达载体SiRNA—pSilencer-单核细胞趋化因子1的成功构建，为进一步研究其基因功能打下了基础。     

促红细胞生成素小干扰RNA真核表达载体的构建

目的 探讨促红细胞生成素(EPO)新靶点的小干扰RNA (siRNA)真核表达载体构建策略.方法 设计合成3个EPO siRNA片段,与含有绿色荧光蛋白和卡那霉素抗性的质粒载体连接,转化到JM109大肠埃希菌感受态细胞中,采用碱基序列测序方法鉴定其构建情况.在人脑神经胶质瘤U251细胞株中,转染成功构建的3个EPO siRNA真核表达载体,采用倒置荧光显微镜,观察U251细胞绿色荧光蛋白表达情况.结果 ①本研究成功构建了新靶点EPO siRNA真核表达载体,即PEPO-1、PEPO-2与PEPO-3,并且构建的3个EPO siRNA真核表达载体序列,与所设计的标准序列完全相同,未发现任何突变、缺失、插入等基因异常情况.②本研究成功将3个EPO siRNA真核表达载体PEPO-1、PEPO-2与PEPO-3转染至人脑神经胶质瘤U251细胞内,并且所有转染PEPO-1、PEPO-2与PEPO-3的U251细胞均表达绿色荧光蛋白.结论 本研究成功构建新靶点EPO siRNA真核表达载体,并将其转染于人脑神经胶质瘤细胞中,为EPO在贫血等疾病中的作用机制研究奠定了实验基础.     

MMP-26基因siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建基质金属蛋白酶-26（MMP-26）小干扰RNA（siRNA）表达质粒,以研究其对人肿瘤细胞MMP-26基因表达的沉默效果,探索肿瘤基因治疗的新途径.方法 根据MMP-26基因mRNA序列,设计有小发夹结构的3条寡核苷酸序列,克隆到空载体pSUPERIOR.puro中,构建重组质粒,同时设计构建分别针对GFP和β-actin的干扰质粒作为阴性对照和阳性对照,并进行酶切鉴定和测序分析.结果 酶切及测序证实重组质粒构建成功.结论 利用RNA干扰（RNAi）技术可成功构建siRNA表达载体.     

增殖诱导配体基因短发夹RNA慢病毒表达载体的构建

目的 构建针对人的增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand,APRIL)基因的短发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA)慢病毒表达载体,并在感染293T细胞后检测病毒滴度及适合的感染复数(multiplicity of infection,MOI)值.方法 以人APRIL基因为靶点,筛选出3条shRNA靶序列:shAPRIL1210、shAPRIL1754、shAPRIL1604;各自合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA后分别与经酶切的pGEL-GFP载体连接,构建3个慢病毒表达载体LV-shAPRIL1210、LV-shAPRIL1754、LV-shAPRIL1604;将连接产物分别转化到DH5α感受态细胞,经PCR及DNA测序鉴定.再用LV-shAPRIL与包装质粒pHelper 1.0、pHelper 2.0共转染293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞绿色荧光蛋白的表达水平确定病毒滴度及适合的MOI值.结果 PCR和测序结果与构建的3个慢病毒载体LV-shAPRIL1210、LV-shAPRIL1754、LV-shAPRIL1604的预期结果一致,经包装产生的慢病毒滴度分别为5×107、6×107、4×107转导单位(TU)/ml;适合高效感染的MOI值为5.结论 成功构建人APRIL基因3个慢病毒表达载体LV-shAPRIL,为后继的在相关靶细胞中诱导特异性的APRIL基因沉默奠定基础.     

FRAT1基因真核表达质粒的构建与鉴定

目的构建FRAT1siRNA真核干涉表达载体pSINsi-FRAT1,并测序鉴定证实克隆正确。方法设计以FRAT1基因为靶标的RNAi序列和阴性对照片段序列,并克隆入载体pSINsi-hU6,用基因测序进行重组克隆验证。结果PCR检测证实siRNA插人pSINsi-hU6质粒,测序分析证实插入序列正确。结论成功构建FRAT1基因的RNAi载体,为研究FRAT1基因对结肠癌细胞增殖凋亡侵袭的影响提供了稳定转染的RNA干扰质粒。     

139例慢性阻塞性肺疾病患者核因子-κB调控单核细胞化学趋化因子1表达的研究

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种具有气流受限特征的疾病,发病率及病死率高,社会经济负担重,已成为一个重要的公共卫生问题,其发病机制尚未完全阐明。研究认为核因子-κB（nuclearfactor,NF-κB）是普遍存在于胞浆的一种应激反应因子,其调控基因大多与免疫反应及炎症反应有关。单核细胞化学趋化因子（monocytechemoactracttive peptide 1,MCP-1）是一种单核细胞特异的趋化因子,研究表明其在支气管和肺组织产生增加是单核细胞浸润的主要原因,而单核和（或）巨噬细胞浸润在COPD发病机制中有重要作用。目前国内少见有关NF-κB直接参与COPD气道炎症形成过程临床方面的研究报道,笔者通过此研究阐明NF-κB及其调控蛋白MCP-1在COPD中的作用,为其发病机制提供新的理论依据。     

趋化因子受体CXCR4 miRNA真核表达载体的构建

目的构建趋化因子受体4（CXCR4）的特异RNA干扰载体。方法在GenBank数据库查询CXCR4基因的登陆号为NM-003467。使用Invitrogen公司的在线设计软件Invitrogen’sRNAi Designer,设计miR RNAi,选择713这个位点设计成相应的Oligo DNA,退火DNA oligos生成双链oligos,应用T4DNA连接酶连接双链oligos与表达载体pcDNA^TM6．2-GW／EmGFP-miR。酶切鉴定和测序鉴定。结果合成的基因序列完全正确并成功克隆到真核表达载体上。结论CXCR4miRNA真核表达载体构建成功,可作为进一步研究该基因的功能和探索肿瘤的基因治疗的工具。     

靶向转化生长因子β1的siRNA真核表达载体的构建及鉴定

[目的]构建靶向转化生长因子β1（TGFβ1）小干扰RNA（siRNA）的真核表达载体.[方法]设计二个siRNA作用靶点,体外合成的相应双链DNA被插入pSilencer-2.1质粒中,对该重组表达载体进行酶切鉴定及DNA测序.采用脂质体转入HSC-T6细胞中,利用RT-PCR法和western-blot分别检测TGFβ1 mRNA和蛋白的表达.[结果]靶向TGFβ1 的siRNA-a和siRNA-b二个表达质粒是成功构建; 与无关对照组相比,siRNA-b组对TGFβ1mRNA和蛋白表达均明显下调（ P 〈0.01）,siRNA-a组无明显下调（ P 〉0.05）.[结论]成功构建了靶向TGFβ1 基因的siRNA表达质粒,为进一步研究其阻断肝纤维化打下基础.     

骨髓间充质干细胞的体外趋化与单核细胞趋化蛋白1的作用

目的：观察单核细胞趋化蛋白1对骨髓问充质干细胞体外增殖和迁移的作用，及单核细胞趋化蛋白1抗体对该作用的影响。方法：实验于2003—12／2004一02在军事医学科学院野战输血研究所干细胞生物实验室完成。取10只健康雄性Wistar大鼠骨髓，体外分离、培养骨髓间充质干细胞，选择第2代作为实验细胞。观察0，5，25，50，75，150μg／L单核细胞趋化蛋白1对大鼠骨髓间充质干细胞的生物学作用；通过细胞迁移实验，观察0，5，25，50，75，150μg／L单核细胞趋化蛋白1对骨髓间充质干细胞的体外趋化作用，以及加入单核细胞趋化蛋白1抗体中和后其对骨髓间充质干细胞趋化作用的变化；应用反转录多聚酶链反应方法，检测大鼠骨髓间充质干细胞有无单核细胞趋化蛋白1相关受体细胞趋化因子受体2的表达。结果：①二甲基偶氮唑盐法测定细胞增殖实验结果：在体外，单核细胞趋化蛋白1以浓度梯度（0，5，25，50，75，150μg／L)依赖方式促进大鼠骨髓间充质干细胞的增殖，但作用较温和。②细胞迁移实验结果：单核细胞趋化蛋白1以浓度梯度（0，5，25，50，75，150μg／L)依赖方式促进大鼠骨髓骨髓间充质干细胞的定向迁移，该作用显著（P&;lt;0．05)。③抗体中和后的迁移实验：75μg／L质量浓度单核细胞趋化蛋白1对骨髓间充质干细胞的促迁移作用可被单核细胞趋化蛋白1中和抗体明显减弱（P&;lt;0．05)。④反转录聚合酶链反应方法证实骨髓间充质干细胞表达单核细胞趋化蛋白1的相关受体细胞趋化因子受体2。结论：在体外，单核细胞趋化蛋白1以浓度梯度依赖方式引起骨髓间充质干细胞的定向迁移，而且该作用可被单核细胞趋化蛋白1中和抗体减弱。单核细胞趋化蛋白1可能通过与细胞趋化因子受体2结合后发挥作用。本实验为了将影响因素相对简单化，便于观察其中的相互关系，并非将体外实验结果完全等同于在体情况。     

人血小板源性生长因子A基因发夹结构小干扰RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的：血小板源性生长因子对诱发视网膜色素上皮细胞移行、最终导致增生性玻璃体视网膜病变起到了重要作用。构建人血小板源性生长因子A具有发夹结构小干扰RNA（shRNA）表达质粒，以观察其对人血小板源性生长因子A基因表达的沉默效果。 方法：实验于2007—04／2007—07在吉林大学第一临床医院传染科研究室完成。根据血小板源性生长因子A基因mRNA序列，设计有小发夹结构的3条寡核苷酸序列，克隆到空载体pGPU6／GFP／Neo中，构建重组质粒，同时设计构建分别针对人GAPDH干扰质粒作为阳性对照,不针对任何特异基因的质粒作为阴性对照。通过酶切鉴定和测序验证阳性克隆。 结果：经重组质粒筛选，重组质粒测序鉴定与设计的shRNA转录模板序列相同，均证实重组质粒构建成功。 结论：利用RNA干扰技术路线可成功构建靶向人血小板源性生长因子A的发夹结构小干扰RNA表达载体。     

血管内皮生长因子C靶向RNA干扰重组载体的构建和效应检测

目的:构建针对人血管内皮生长因子C小干扰RNA表达载体,并观察其在胃癌细胞中的干扰效果。方法:实验于2006-02/2007-02在河南省分子医学重点学科开放实验室完成。①实验材料:小干扰RNA表达载体pSilencer3.1为美国Ambion公司产品;胃癌细胞SGC7901为河南省分子医学重点学科开放实验室保存;血管内皮生长因子C基因的干扰片断和聚合酶链反应引物(152bp)由上海生工生物公司合成。②实验过程:根据pSilencer3.1-H1载体要求设计靶向血管内皮生长因子C基因的两对小干扰RNA,退火后连接入载体相应位点,构建重组表达质粒。经酶切和测序鉴定后分别转染胃癌细胞株SGC-7901,经G418筛选,获得稳定表达的细胞株。③实验评估:采用反转录-聚合酶链反应和Westernblot法检测血管内皮生长因子CmRNA和蛋白水平的表达。结果:①重组质粒的酶切、核苷酸序列分析结果:经酶切和测序鉴定证实成功构建了血管内皮生长因子C小干扰RNA表达载体,建立了稳定转染细胞株。②稳定转染的细胞株中血管内皮生长因子CmRNA和蛋白表达:反转录-聚合酶链反应和Western blot显示转染后血管内皮生长因子C表达与对照组相比有不同程度的降低,以pSilencer3.1-neo-VEGF-C1尤为明显,抑制血管内皮生长因子C表达,不影响细胞的生长。结论:成功构建了血管内皮生长因子C小干扰RNA表达载体及稳定转染的胃癌细胞株。     

大鼠delta阿片受体短发卡RNA干扰真核表达载体的构建和鉴定

背景:长期应用阿片受体治疗疼痛会导致药物耐受或成瘾,可能与delta 阿片受体密度上调有关.目的:设计及构建大鼠delta 阿片受体短发卡RNA 真核表达载体并鉴定.方法:根据大鼠delta 阿片受体mRNA 序列设计并体外合成短发卡RNA 寡核苷酸片段,退火形成双链,克隆到线性化质粒pGenesil-1,然后进行酶切和测序鉴定.结果与结论:酶切证明delta 阿片受体-短发卡RNA 已经插入到质粒载体pGenesil-1 里,测序结果证明均为插入正确的克隆质粒,而且质量均符合设计标准,证实靶向大鼠delta 阿片受体基因的短发卡RNA 真核表达载体构建成功.     

大鼠delta阿片受体短发卡RNA干扰真核表达载体的构建和鉴定

背景：长期应用阿片受体治疗疼痛会导致药物耐受或成瘾,可能与delta阿片受体密度上调有关。目的：设计及构建大鼠delta阿片受体短发卡RNA真核表达载体并鉴定。方法：根据大鼠delta阿片受体mRNA序列设计并体外合成短发卡RNA寡核苷酸片段,退火形成双链,克隆到线性化质粒pGenesil-1,然后进行酶切和测序鉴定。结果与结论：酶切证明delta阿片受体-短发卡RNA已经插入到质粒载体pGenesil-1里,测序结果证明均为插入正确的克隆质粒,而且质量均符合设计标准,证实靶向大鼠delta阿片受体基因的短发卡RNA真核表达载体构建成功。     

靶向人血管紧张素原小干扰RNA表达质粒的构建和鉴定

背景:RNA干扰技术通过将具有一定结构特点、长19～25 bp的双链小干扰RNA导入哺乳动物细胞,特异性降解与其序列具有同源性的mRNA分子,导致目的基因表达抑制.目的:拟构建针对人血管紧张素原mRNA的小干扰RNA表达载体,从而抑制肾素基因在脂肪细胞的表达.方法:从NCBI中查找人血管紧张素原基因全长mRNA序列(NM000029),利用GeneScript公司提供的在线小干扰RNA模板序列设计软件,自行设计靶向血管紧张素原的两条shRNA的DNA模板单链,合成靶向血管紧张素原基因转录可形成茎环结构的寡聚核苷酸,退火后与酶切后的psiRNAT-U6.1/Neo质粒连接,在TOP10菌株中扩增,并测序鉴定.结果与结论:将含有血管紧张素原-mRNA目标序列19 bp的双链DNA插入片段,连接到pRNAT-U6.1/Neo质粒形成重组质粒.EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后,空载体得到351 bp小片段,而人重组质粒得到397 bp小片段,与预期相符.EcoRI和Kpv Ⅰ双酶切后,空载体得到1条345 bp小片段,而人重组载体没有得到小片段条带,与预期相符.测序结果表明psiRNAT-U6.1/Neo质粒已经插入人脂肪细胞的干扰合成片段,无碱基突变,成功构建了靶向血管紧张素原-小干扰RNA表达载体.     

分化型胚胎软骨发育基因1特异性小干扰RNA表达质粒的构建和鉴定

背景:分化型胚胎软骨基因1 可调控肿瘤生长、凋亡、衰老相关因子,与肿瘤的发生发展有着重要的联系.目的:构建针对人分化型胚胎软骨基因1 的小干扰RNA 表达载体.方法:从NCBI 中查找人分化型胚胎软骨基因1 基因全长mRNA 序列,利用Katahdin 提供的在线小干扰 RNA 模板序列设计软件,设计针对分化型胚胎软骨基因1 的2 条shRNA 的 DNA 模板单链,合成靶向分化型胚胎软骨基因1 基因转录可形成茎环结构的寡聚核苷酸,退火后与酶切后的pGreenPuro.shRNA Cloning and Expression Lentivector 质粒连接,在JM-109 菌株中扩增,并进行质粒DNA 琼脂糖凝胶电泳分析、紫外分光光度计检测、菌落PCR 以及测序鉴定.结果与结论:将含有分化型胚胎软骨基因1 目标序列25 bp 的双链 DNA 插入片段,连接到pGreenPuro.shRNA Cloning and Expression Lentivector 质粒形成重组质粒.质粒DNA 琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分析结果确认所提质粒纯度较高,可用于后续实验.菌落PCR 结果表明产物大小约为170 bp,与预期相符.测序结果表明pGreenPuro.shRNA Cloning and Expression Lentivector 质粒已经插入人分化型胚胎软骨基因1 的干扰合成片段,无碱基突变.成功构建了靶向分化型胚胎软骨基因1-小干扰 RNA 表达载体.     

分化型胚胎软骨发育基因1特异性小干扰RNA表达质粒的构建和鉴定

背景：分化型胚胎软骨基因1可调控肿瘤生长、凋亡、衰老相关因子,与肿瘤的发生发展有着重要的联系。目的：构建针对人分化型胚胎软骨基因1的小干扰RNA表达载体。方法：从NCBI中查找人分化型胚胎软骨基因1基因全长mRNA序列,利用Katahdin提供的在线小干扰RNA模板序列设计软件,设计针对分化型胚胎软骨基因1的2条shRNA的DNA模板单链,合成靶向分化型胚胎软骨基因1基因转录可形成茎环结构的寡聚核苷酸,退火后与酶切后的pGreenPuroTM shRNA Cloning and Expression Lentivector质粒连接,在JM-109菌株中扩增,并进行质粒DNA琼脂糖凝胶电泳分析、紫外分光光度计检测、菌落PCR以及测序鉴定。结果与结论：将含有分化型胚胎软骨基因1目标序列25bp的双链DNA插入片段,连接到pGreenPuroTM shRNA Cloning and Expression Lentivector质粒形成重组质粒。质粒DNA琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分析结果确认所提质粒纯度较高,可用于后续实验。菌落PCR结果表明产物大小约为170bp,与预期相符。测序结果表明pGreenPuroTM shRNA Cloning and Expression Lentivector质粒已经插入人分化型胚胎软骨基因1的干扰合成片段,无碱基突变。成功构建了靶向分化型胚胎软骨基因1-小干扰RNA表达载体。     

真核表达载体pcDNA3-ICOSIg的构建及表达

背景：人可诱导共刺激分子0cos）是迄今发现的重要共刺激分子家族成员,可促进激活T细胞的增殖和分泌、调节Th1／Th2细胞的极化、增强依赖T细胞的B细胞功能,阻断ICOS共刺激信号会导致T细胞的克隆失活或克隆无反应,从而诱导肿瘤对机体的免疫逃逸。目的：构建表达ICOSIg的质粒,观察其在小鼠体内的表达。方法：克隆编码ICOS的胞外片段,将其与编码小鼠免疫球蛋白IgG恒定片段（Ig）的基因融合,构建ICOSIg融合基因及其分泌型真核表达载体pcDNA3-ICOSIg,酶切鉴定重组子,测序,利用阳性脂质体载体包被pcDNA3-ICOSlg转染小鼠右侧大腿肌肉组织,Westernblot法检测血清ICOSIg水平。结果与结论：经测序鉴定证实pcDNA3．ICOSIg质粒目的基因片断与Genbank上公布的ICOS序列完全一致,说明质粒构建成功。脂质体载体包被pcDNA3-ICOSIg转染小鼠7d,在小鼠血清中检测到ICOSIg的阳性表达,说明pcDNA3．ICOSlg能够在小鼠肌细胞内表达。证实利用基因合成和重组技术可成功构建真核表达载体pcDNA3-ICOSIg。f201     

Delivery of MDR1 small interfering RNA by self-complementary recombinant adeno-associated virus vector.

Small interfering RNAs (siRNAs) are potentially powerful tools for therapeutic gene regulation. DNA cassettes encoding RNA polymerase III promoter-driven hairpin siRNAs allow long-term expression of siRNA in targeted cells. A variety of viral vectors have been used to deliver such cassettes to cells. Here we report on the development and use of a self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vector for siRNA delivery into mammalian cells. We demonstrate that this modified vector efficiently delivers siRNA into multidrug-resistant human breast and oral cancer cells and suppresses MDR1 gene expression. This results in rapid, profound, and durable reduction in the expression of the P-glycoprotein multidrug transporter and a substantial reversion of the drug-resistant phenotype. This research suggests that scAAV-based vectors can be very effective agents for efficient delivery of therapeutic siRNA.