卵巢癌的p53基因治疗实验研究——人野生型p53基因真核细胞表达质粒的构建

目的 :本实验构建了人野生型 p53基因与真核表达载体 pc DNA3的重组体 ,为进行卵巢癌基因治疗研究打下基础。方法 :利用分子生物学基因克隆技术从质粒 p GEX-p53中用双酶切下目的片段 ,挤压法回收与 pc DNA3构成重组体。结果 :成功的构建了人野生型 p53基因真核细胞表达质粒。结论 :带有两个不同的酶切位点的目的片段定向克隆的方法使重组体的构建高效简便 ,挤压法回收目的片段经济有效。     

野生型p53基因重组质粒的构建及对人卵巢癌细胞的抑制作用

目的:研究p53基因转染对卵巢癌细胞系SKOV-3生物学行为的影响.方法:用分子克隆技术构建人野生型p53基因与真核细胞表达载体PCNDA3的重组体(PCNDA-p53),并用脂质体介导的转染技术,将其导入不表达p53的人卵巢癌SKOV-3细胞中,经筛选、鉴定后,观察细胞生长速度、集落形成能力和增殖周期的变化.结果:成功地构建了人野生型p53基因与真核细胞表达载体的重组体,转染后获得稳定表达p53的转染克隆.外源性p53基因的表达明显抑制了卵巢癌细胞的生长速度及集落形成能力,使细胞阻滞于G1期.结论:外源性野生型p53基因能抑制卵巢癌细胞的增殖.     

野生型p53基因转染对卵巢癌细胞株端粒酶活性的影响

目的 :探讨野生型 p5 3(wt- p5 3)基因转染对卵巢癌细胞端粒酶活性的影响。方法 :利用脂质体介导 ,将含有人全长 wt- p5 3基因 c DNA的真核表达载体质粒 p CEP4 / p5 3和空载体质粒 p CEP4分别转染人卵巢浆液性乳头状囊腺癌 SKOV3细胞株 ,分别命名为 SKOV3- p CEP4 / p5 3细胞 (C组 )、SKOV3- p CEP4细胞 (B组 ) ,另设 SKOV3细胞为空白对照组 (A组 ) ,观察 3组细胞周期和端粒酶活性变化。结果 :外源性 wt- p5 3基因在 C组细胞中获表达 ,而 A、B组细胞中无 wt- p5 3基因的表达。流式细胞仪检测示 C组细胞 G0 ～ G1 期百分比 (5 7.79% )及凋亡细胞率 (13.91% )均高于 B组 (46 .0 2 %、2 .0 8% )和 A组 (43.6 2 %、0 ) ,差异有显著性 (P <0 .0 1) ,A、B、C3组细胞中端粒酶活性均呈阳性 ,但 3组细胞端粒酶活性无显著性差异 (P =0 .6 5 )。结论 :wt- P5 3基因转染可介导 SKOV3细胞 G0 ～ G1 期停滞和诱导细胞凋亡 ,但对 SKOV3细胞内端粒酶活性无影响     

逆转录病毒介导的人卵巢癌 p53基因治疗体外及小鼠体内实验研究

目的 :评价人卵巢癌的 p5 3基因治疗效果。 方法 :用携带人野生型 p5 3的逆转录病毒转导 p5 3蛋白表达缺如的人卵巢癌细胞系SK OV 3,通过体外及小鼠体内实验研究转基因的表达及对肿瘤的抑制作用。结果 :逆转录病毒介导的 p5 3基因能够在体外及小鼠体内人卵巢癌细胞SK OV 3中表达 ,并对人卵巢癌生长有抑制作用。体外抑制率为 5 7%～ 88% ;对体内肿瘤抑制率为 40 %。结论 :逆转录病毒介导的外源野生型p5 3能够抑制人卵巢癌生长 ,增加病毒滴度将进一步提高体内治疗效果     

腺病毒介导的野生型p53基因治疗肿瘤研究进展

恶性肿瘤的发生与基因突变有密切关系。抑癌基因p53编码转录因子P53蛋白在调控癌基因表达、DNA合成和损伤修复以及细胞凋亡中起关键作用。已证实50％以上肿瘤细胞存在p53基因突变，p53被认为在肿瘤形成中起非常重要作用。p53基因治疗的目的是纠正恶性细胞中突变的p53基因功能，在多种肿瘤的体内外试验中显示出明显疗效。作者就这方面研究进展作一综述，重点讨论腺病毒介导的p53基因治疗。     

逆转录病毒介导的野生型p53基因转入对慢粒多药耐药细胞？…

以Ｋ５６２／ＨＨＴ细胞为模型,采用重组逆转录病毒载体介导的基因转移技术,将人野生型Ｐ５３ｃＤＮＡ转入该细胞系,研究外源性野生型Ｐ５３基因在白血病多药耐经细胞表达的意义。结果显示,外源性野生型Ｐ５３基因抑制细胞增殖,一般形态学观察见细胞明显向成熟发化,流式细胞仪分析还显示Ｐ５３基因诱导Ｋ５６２／ＨＨＴ细胞死亡且伴有细胞周期Ｇ１基因的生长阻滞,结果表明,野生型Ｐ５３基因对多药耐药的白血病细胞能部分降低     

p53基因与人类肿瘤基因治疗研究进展

抗癌基因 (又称肿瘤抑制基因或抑癌基因 )的失活与癌基因的激活参与人类各种肿瘤的形成和发展。常见的抗癌基因有ｐ53、ｐ2 1、ｐ2 7、Ｒｂ、ｐ1 6等。其中ｐ53基因是最受瞩目者 ,这是因为在人类恶性肿瘤中至少有 50 %发生了ｐ53基因的变化。现就ｐ53基因与肿瘤基因治疗研究新进展综述如下。1　ｐ53基因的结构及产物生物学特性ｐ53基因位于人类染色体 1 7ｐ1 3,基因全长 1 6～ 2 0ｋｂ ,由1 1个外显子和 1 0个内含子组成 ,编码 393个氨基酸。ｐ53蛋白质是一种由ｐ53基因编码的与细胞分裂周期相关的核磷酸蛋白质 ,分子量为 53ｋｕ。ｐ53蛋白…     

野生型p53cDNA真核表达载体的构建

ｐ５３基因是癌症研究和肿瘤基因治疗中最引人注目的抑癌基因之一，据报道，大约一半左右癌症的起因是由于ｐ５３基因突变。在所有的抑癌基因中，ｐ５３基因是突变率极高的一种，它的失活会阻止细胞进入凋亡，从而使之处于持续分裂状态而增加突变及恶性转化的概率［１］。因此，研究野生型ｐ５３基因在肿瘤的基因治疗中有普遍性意义。１材料和方法１．１材料ｐＧＥＭ－Ｔ载体（Ｐｒｏｍｅｇｅ公司）；真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（本室保存）；野生型ｐ５３ｃＤＮＡ由南京军事医学研究所朱敏生教授惠赠；限制性内切酶、ＴａｑＤＮＡ聚合酶…     

重组野生型p53基因转染人骨肉瘤细胞株体外实验

目的：将外源性野生型ｐ５３基因导入人骨肉瘤细胞株，研究野生型ｐ５３蛋白在诱导瘤细胞凋亡中的作用。方法：用ＤＮＡ转染技术将７重组野生型ｐ５３基因ＰＭ４７质粒导入人骨肉瘤细胞株ＨＯＳ－８６０３中，用ＰＣＲ技术监测外源性ｐ５３基因在瘤细胞中存在的稳定性；用免疫组化方法检测在地塞米松的诱导下瘤细胞中ｐ５３的表达情况；用相差显微镜去观察凋亡瘤细胞的形态特点；用细胞凋亡原位检测技术标记并统计凋亡的瘤细胞数。结     

携带野生型p53基因的重组腺病毒载体的构建

应用同源重组方法成功地构建了携带野生型Ｐ５３基因的复制缺陷型重组腺病毒，通过光镜电镜、酶切、ＰＣＲ共扩增等方法证实了构建载体的正确性，并使常规的同源重组方法进一步改进，简化了载体构建的操作程序，结果准确，成功率高。本结果可用于以腺病毒为载体进行肿瘤、心血管疾病等基因治疗的研究。     

重组人p53腺病毒增强肝癌放疗敏感性的实验研究

目的 观察重组人p53腺病毒(recombinant human adenovinm p53,rAd-p53)联合放疗对肝癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用.方法 人肝癌细胞SMMC-7721荷瘤裸鼠18只,应用随机数字表法选取2只,1只瘤内注射rAd-p53,另1只注射PBS,注射后48 h处死动物取瘤,Western blot方法检测肿瘤P53蛋白表达;其余16只分为4组:对照组、单独放疗(IR)组、重组人pS3腺病毒(rAd-p53)治疗组和重组人p53腺病毒+放疗(rAd-p53+IR)联合治疗组.实验治疗第16天处死动物,绘制肿瘤生长曲线;光镜下观察肿瘤治疗后组织形态学变化;免疫组化S-P法检测Ki-67,TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡.结果 rAd-p53成功感染了肝癌裸鼠移植瘤细胞,并增强肝癌细胞P53蛋白的表达;rAd-p53+IR联合治疗组、IR组和rAd-p53治疗组的肿瘤生长抑制率分别为81.49%、30.74%和33.67%,其中rAd-p53+IR联合治疗组的肿瘤抑制最强(P<0.01).光镜下观察各治疗组的肿瘤组织均出现坏死,其中rAd-p53+IR联合治疗组肿瘤坏死较多;rAd-p53+IR联合治疗组肿瘤细胞表达Ki-67明显低于对照组、IR组和rAd-p53治疗组(P<0.01),而肿瘤细胞凋亡显著增加(P<0.01).结论 rAd-p53+IR联合治疗较单独放疗能显著抑制肝癌的生长,rAd-p53能增强肝癌对放疗敏感性.     

野生型p53基因转移预防血管成形术后再狭窄的实验研究

目的探讨逆转录病毒载体介导的人野生型ｐ５３基因转移对预防血管成形术后再狭窄的作用。方法构建野生型ｐ５３基因逆转录病毒载体，通过逆转录病毒载体介导，将野生型ｐ５３基因转导至大鼠球囊损伤的颈动脉再狭窄模型中，２１ｄ后观察其对新生内膜形成的影响，并检测ｐ５３蛋白表达水平。结果构建和包装了人野生型ｐ５３基因的重组逆转录病毒载体，并在体外细胞中表达；用逆转录病毒载体转导野生型ｐ５３基因至大鼠球囊损伤的颈动脉，免疫组化检测表明转导血管局部表达人野生型ｐ５３蛋白，且与对照组相比，损伤血管新生内膜／中层面积比降低了４４％。结论人野生型ｐ５３基因治疗对血管成形术后再狭窄有一定的预防作用     

腺病毒介导野生型p53基因对人肺腺癌细胞的抑制效应

目的：p53基因突变是人类肿瘤中常见的遗传学改变。将野生型p53基因导入一些肿瘤细胞中被证明能抑制其细胞增殖，因此做为肺癌基因治疗主要目的基因而备受关注。本研究旨在观察野生型p53基因对人肺腺癌细胞和裸鼠移植瘤的抑制效应，并对其抑癌机制进行分析，为今后肺癌基因治疗的临床试验提供科学依据。方法：采用重组体腺病毒Ad-p53基因转染人肺腺癌细胞系GLC－82；以裸鼠皮下移植瘤治疗试验观察Ad-p53基因的抑瘤效应；用流式细胞计数，DNA片断化及TUNEL分析探讨Ad-p53基因的抑癌机制。结果：导入Ad-p53基因后人肺腺癌GLC－82细胞生长能力显著下降，克隆形成能力受到明显抑制；并显著抑制裸鼠皮下移植瘤的生长；肺癌细胞发生凋亡，并出现明显的G1期阻滞现象。结论：腺病毒介导野生型p53基因（Ad-p53)对人肺腺癌细胞和裸鼠皮下移植瘤均有明显抑制效应，主要通过诱导癌细胞凋亡和参与细胞周期调控实现，进而提示Ad-p53基因有可能在人肺癌基因治疗中发挥重要作用。     

重组野生型p53基因转染人骨肉瘤细胞株体外实验

目的：将外源性野生型ｐ５３基因导入人骨肉瘤细胞株，研究野生型ｐ５３蛋白在诱导瘤细胞凋亡中的作用。方法：用ＤＮＡ转染技术将７重组野生型ｐ５３基因ＰＭ４７质粒导入人骨肉瘤细胞株ＨＯＳ８６０３中，用ＰＣＲ技术监测外源性ｐ５３基因在瘤细胞中存在的稳定性；用免疫组化方法检测在地塞米松的诱导下瘤细胞中ｐ５３的表达情况；用相差显微镜去观察凋亡瘤细胞的形态特点；用细胞凋亡原位检测技术标记并统计凋亡的瘤细胞数。结果：成功地将重组野性型ｐ５３基因ＰＭ４７质粒导入人骨肉瘤细胞株ＨＯＳ８６０３中，在ｇｐｔ选择培养基中培养两周后，分离生长出阳性细胞克隆；经ＰＣＲ证实外源性ｐ５３基因在瘤细胞内稳定存在并可随瘤细胞分裂而传给子代；当向培养液中加入１μｍｏｌ／Ｌ地塞松（Ｄｅｘ）后，８ｈ即可用免疫组化方法检测到ｐ５３蛋白的表达并可观察到瘤细胞出现凋亡的一系列形态学改变，转染后的瘤细胞凋亡率高达９０％。结论：当人骨肉瘤细胞株中重组野生型ｐ５３基因诱导过表达时，瘤细胞呈现凋亡，本实验为骨肉瘤的基因治疗提供了理论依据。     

野生型p53诱导基因1研究进展

p53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因.过去20多年来,人们对p53基因的认识经历了癌蛋白抗原,癌基因到抑癌基因的3个认识转变,现已认识到,引起肿瘤形成或细胞转化的突变型p53蛋白是野生型p53基因突变的产物,是一种肿瘤促进因子,它可以抑制正常p53蛋白的功能,而野生型p53基因是一种抑癌基因,它的失活对肿瘤形成起重要作用[1].     

野生型p53基因抑制人结肠癌细胞的体内抑瘤效应观察

目的研究人野生型p53基因对人结肠癌SW1116细胞生长的影响。方法采用电穿孔法将正向携带有野生型p53基因cDNA的重组反转录病毒质粒导入有p53基因突变的人结肠腺癌SW1116细胞,筛选带外源p53基因的G418抗药性SW1116细胞克隆,对其进行生长速度、软琼脂集落形成及裸鼠成瘤等方面的检测,分析其生物学特性变化。结果导入人野生型p53基因使人结肠腺癌SW1116细胞的生长速度明显减慢(P<0.05或0.01)、软琼脂集落数量明显较对照组减少(P<0.05或0.01),移植瘤体积较对照组明显小(P<0.05)。结论人野生型p53基因对人结肠腺癌SW1116细胞有明确的抑瘤效应。     

腺病毒介导的野生型p53基因对人肺腺癌细胞放疗敏感性的影响

目的:研究腺病毒介导的野生型p53基因(Ad-p53)对人肺腺癌细胞生长及放疗敏感性的影响。方法:将重组的含野生型p53基因的腺病毒导入A549细胞,通过免疫细胞化学方法检测p53基因的表达。A549细胞分为4组:对照组、转染组、放疗组、转染联合放疗组。用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)和流式细胞仪检测p53基因以及联合放射治疗(2,4,6 Gy)对A549细胞生长抑制及凋亡的影响。结果:通过免疫细胞化学方法证实了p53基因在A549细胞中的表达。MTT法检测发现p53基因对A549细胞的生长抑制率为(50.60±5.69)%。当放射剂量为2,4,6 Gy时,A549细胞的生长抑制率分别为(16.06±4.35)%、(16.39±1.67)%、(17.73±4.68)%。当p53基因与放疗(2,4,6 Gy)联合作用时,抑制率分别为(80.60±5.35)%,(89.30±1.67)%、(90.30±2.01)%(P<0.01)。p53基因转染所产生的A549细胞凋亡率为(10.38±1.68)%。放疗(2,4,6 Gy)引起的细胞凋亡率分别为(3.98±0.72)%、(4.84±0.60)%、(5.40±0.70)%。当p53基因与放疗(2,4,6 Gy)联合作用时,凋亡率分别为(17.80±1.30)%、(19.03±0.54)%、(21.34±2.51)%(P<0.01)。结论:野生型p53基因与放疗对人肺腺癌细胞生长有协同抑制作用,增加了人肺腺癌细胞对放射治疗的敏感性     

外源性野生型p53基因对白血病细胞作用及对白血病细胞因子表达的调控

野生型 p5 3基因 (简称 wt- p5 3基因 )是一种重要抑癌基因 ,wt- p5 3功能失活与肿瘤的发生密不可分 ,通过重建 wt-p5 3功能治疗恶性肿瘤是近年来基因治疗热点。 p5 3基因是人类肿瘤中基因改变频率最高的一种基因 ,几乎所有组织均可发生 p5 3突变 ,血液系统的肿瘤也不例外。综合文献 ,急性髓细胞白血病 (AML)患者伴有 17号染色体异常 [i17(q) ]者p5 3基因点突变的发生率可达 40 % ,而大多数的白血病细胞系如 HL6 0、K5 6 2、CMK、U937均可检出 p5 3基因严重缺失或突变。慢性粒细胞白血病慢性期 ,p5 3基因发生重排、缺失或点突变的比率低…     

人恶性卵巢上皮肿瘤p53基因5～8外显子突变的研究

为探明ｐ５３基因突变与恶性巢上皮肿瘤发生发展的关系,采用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ法对４０例恶性卵巢上皮肿瘤及３０例良性卵巢上皮肿瘤（对照）的ｐ５３基因第５￣８外显子突变情况进行了检测。结果显示：恶性卵巢上皮肿瘤ｐ５３基因５￣８外显子点突变率为３０％,而３０例良性卵巢上皮肿瘤中未发现ｐ５３基因突变。结论：在卵巢良性肿瘤向恶性转化过程中,ｐ５３基因突变可能起着重要作用。