日本七鳃鳗MIF多克隆抗体的制备及应用

目的以日本七鳃鳗(Lampetra japonica)类淋巴细胞为研究对象提取总RNA,通过RT-PCR方法获得七鳃鳗MIF基因对其进行生物信息学分析。方法将MIF基因构建到原核表达载体p ET-28a上,诱导表达并纯化MIF蛋白。以可溶表达的MIF蛋白免疫新西兰兔,应用间接ELISA方法和Western blot方法检测多克隆抗体。结果 ELISA检测抗体效价为1∶512 000;Western blot结果显示该多克隆抗体能特异性的结合重组和天然MIF蛋白;流式细胞术分析确定了19.36%的七鳃鳗类淋巴细胞表达MIF分子;激光共聚焦分析技术确定MIF分子主要定位于七鳃鳗类淋巴细胞的细胞浆中。结论重组MIF蛋白表达及多克隆抗体的成功制备,为七鳃鳗免疫功能方面的相关研究奠定了基础。     

兔抗人乳酸脱氢酶C4(LDHC4)多克隆抗体制备与应用

目的 制备兔抗人乳酸脱氢酶C4(LDHC4)的多克隆抗体。方法 采用PCR点突变LDHC基因,并将该基因构建到pET-28a载体上,形成pET-28a-LDHC重组表达载体、将重组载体转化至大肠杆菌表达宿主BL21(DE3),诱导表达获得重组人LDHC4蛋白,将重组蛋白作为抗原免疫新西兰兔,3次加强免疫后得到抗血清,采用ELISA检测抗血清效价,采用Western blot法检测抗血清的特异性,采用免疫组织化学法检测人三阴性乳腺癌组织中LDHC4的表达。结果 获得了特异性的兔抗人LDHC4多克隆抗体,抗体效价达1∶51 200,该抗体可用于Western blot法和免疫组织化学法。结论 成功制备了特异性兔抗人LDHC4多克隆抗体。     

人TLR2胞外区基因的原核表达及其抗体的制备

目的: 在原核系统中表达人Toll样受体2(TLR2)胞外区基因的融合蛋白并制备多克隆抗体.方法: 应用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞中扩增TLR2胞外区基因, 将其克隆到表达载体pET-32a( )上构建重组原核表达质粒, 并在大肠杆菌中诱导表达, 目的融合蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化, 用SDS-PAGE和 Western blot进行鉴定.用纯化的蛋白免疫新西兰白兔, 制备多克隆抗体, 采用Western blot对抗体进行鉴定, 并用ELISA分析抗体活性.结果: 成功构建了pET-32a( )-TLR2重组表达质粒并在大肠杆菌中进行表达, 获得了纯化重组蛋白, 重组蛋白免疫白兔后能够有效地刺激抗体产生, 并具有良好的免疫活性.结论: 成功地获得人TLR2胞外区基因的融合蛋白, 制备的多克隆抗体为进一步研究TLR2胞外区的功能和生物活性奠定基础.     

人视黄醇结合蛋白原核蛋白表达和兔多克隆抗体的制备

目的制备兔抗人视黄醇结合蛋白(RBP)多克隆抗体。方法逆转录PCR扩增人RBP基因,将扩增产物连接到原核表达载体pET-28a(+)上,构建重组质粒pET-28a(+)-RBP,转化至大肠杆菌中。用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导其表达,表达产物经SDS-PAGE分析鉴定出阳性克隆,扩大培养。用组蛋白标签(His-tag)纯化柱纯化重组蛋白。将纯化的重组蛋白皮下注射到新西兰白兔, 4次加强免疫得到抗血清。从抗血清中纯化出抗RBP多克隆抗体,并进行SDS-PAGE、 ELISA和Western blot法鉴定。结果成功构建了重组质粒pET-28a(+)-RBP,并获得高纯度的RBP重组蛋白, ELISA检测结果显示抗体效价达到1∶512 000。结论成功制备兔抗人RBP多克隆抗体。     

人IL-37在大肠杆菌表达及多克隆抗体的制备与鉴定北大核心CSCD

目的原核表达白细胞介素37(IL-37)及制备其多克隆抗体。方法 PCR扩增IL-37b成熟肽编码区基因,克隆至表达载体pET28a,转化大肠杆菌感受态细胞,IPTG诱导表达,Ni2+-NTA琼脂糖凝胶柱亲和层析纯化重组蛋白,以纯化的重组蛋白IL-37为免疫原免疫BALB/c小鼠制备其特异性抗体,用ELISA、Western blot法和免疫组织化学染色检测抗体的效价和特异性。结果原核表达了重组蛋白IL-37b成熟肽,并获得高效价的小鼠抗IL-37抗体,能特异性识别天然的IL-37抗原。结论成功制备效价高、特异性好的小鼠抗IL-37抗体。     

人IL-37在大肠杆菌表达及多克隆抗体的制备与鉴定

目的原核表达白细胞介素37(IL-37)及制备其多克隆抗体。方法 PCR扩增IL-37b成熟肽编码区基因,克隆至表达载体pET28a,转化大肠杆菌感受态细胞,IPTG诱导表达,Ni2+-NTA琼脂糖凝胶柱亲和层析纯化重组蛋白,以纯化的重组蛋白IL-37为免疫原免疫BALB/c小鼠制备其特异性抗体,用ELISA、Western blot法和免疫组织化学染色检测抗体的效价和特异性。结果原核表达了重组蛋白IL-37b成熟肽,并获得高效价的小鼠抗IL-37抗体,能特异性识别天然的IL-37抗原。结论成功制备效价高、特异性好的小鼠抗IL-37抗体。     

Nanog基因的原核表达及抗体制备

目的:在大肠杆菌中表达Nanog融合蛋白,制备兔抗小鼠Nanog融合蛋白抗体。方法:从含小鼠Nanog基因的pNA992质粒中扩增出小鼠Nanog基因并插入pET-32a中构建pET-32a-Nanog重组表达载体,并转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,得到了Nanog融合蛋白,并经Histrap亲和层析柱纯化后,将其作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测抗体效价,Western blot和免疫细胞化学染色检测抗体特异性。结果:成功地构建了重组表达载体pET-32a-Nanog,经诱导获得了大量Nanog融合蛋白,其主要以包涵体形式表达,纯化后蛋白纯度达到97%,经免疫的兔抗血清效价可达1∶32 000,并表现出较好的特异性。结论:成功地制备出高滴度、高特异性的兔抗Nanog融合蛋白抗体。     

小鼠IL-1α多克隆抗体的制备及应用

目的:构建小鼠白细胞介素-1α原核表达载体,表达并纯化IL-1α蛋白,制备兔抗鼠IL-1α多克隆抗体,并对抗体特性进行初步的鉴定。方法:利用RT-PCR技术,从BALB/c小鼠脾脏cDNA中扩增出IL-1α的全长基因,酶切后连接至pET32a(+)原核表达载体,重组载体测序正确后转化至BL21(DE3)大肠杆菌。利用蛋白质原核表达自动诱导方案成功表达重组蛋白。重组蛋白经电洗脱纯化后用以免疫新西兰大白兔,获得了抗小鼠IL-1α的多克隆抗体,ELISA检测抗体效价。Western blot和流式细胞术(FCM)检测抗血清的特异性。结果:成功构建了重组表达载体pET32a(+)-IL-1α,表达的重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,得到的多克隆抗体ELISA显示抗体效价可达1∶25 600。Western blot和FCM分析该抗体能特异性结合IL-1α。结论:利用重组的IL-1α蛋白成功制备了高效价、高特异性的兔抗IL-1α抗体,为进一步研究IL-1α的生物学功能奠定了基础。     

小鼠IL-1α多克隆抗体的制备及应用

目的:构建小鼠白细胞介素-1α原核表达载体,表达并纯化IL-1α蛋白,制备兔抗鼠IL-1α多克隆抗体,并对抗体特性进行初步的鉴定.方法:利用RT-PCR技术,从BALB/c小鼠脾脏cDNA中扩增出IL-1α的全长基因,酶切后连接至pET32a(+)原核表达载体,重组载体测序正确后转化至BL21( DE3)大肠杆菌.利用蛋白质原核表达自动诱导方案成功表达重组蛋白.重组蛋白经电洗脱纯化后用以免疫新西兰大白兔,获得了抗小鼠IL-1α的多克隆抗体,ELISA检测抗体效价.Western blot和流式细胞术(FCM)检测抗血清的特异性.结果:成功构建了重组表达载体pET32a(+)-IL-1α,表达的重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,得到的多克隆抗体ELISA显示抗体效价可达1∶25 600.Western blot和FCM分析该抗体能特异性结合IL-1α.结论:利用重组的IL-1α蛋白成功制备了高效价、高特异性的兔抗IL-1α抗体,为进一步研究IL-1α的生物学功能奠定了基础.     

兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体的制备和鉴定

目的制备兔抗小鼠白细胞介素23p19(IL-23p19)多克隆抗体。方法利用分子克隆技术构建重组表达质粒p ET-16b-IL-23p19,转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,SDS-PAGE及Western blot法分析鉴定蛋白,镍柱亲和层析纯化制备蛋白;以此蛋白为免疫抗原免疫新西兰大白兔,获得抗血清,并利用亲和层析法纯化抗血清,制备兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体;采用ELISA检测抗体效价;Western blot法检测抗体特异性。结果重组表达载体p ET-16b-IL-23p19构建正确且IL-23p19蛋白能够在大肠杆菌BL21(DE3)中有效表达。通过多次IL-23p19蛋白免疫新西兰大白兔,成功制备兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体。ELISA检测确定新西兰大白兔血清效价达1∶256 000,Western blot法证实兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体能特异性识别小鼠IL-23p19蛋白。结论成功制备了兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体,抗体具有高的效价和较好的特异性。     

肺炎链球菌SpxA蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的 构建肺炎链球菌SpxA蛋白的原核表达系统,制备其多克隆抗体.方法 设计引物,利用PCR技术扩增肺炎链球菌D39菌株的spxA基因,并插入表达载体pET-28a(+)内,测序鉴定.重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,以IPTG诱导表达含6个组氨酸标签的SpxA重组蛋白,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,以其为抗原免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体.用ELISA及Western印迹方法分别检测多克隆抗体的效价及特异性.结果 从大肠埃希菌中诱导出高表达的SpxA重组蛋白,纯化后免疫小鼠获得抗血清,ELISA测定其效价可达1:2 560 000以上,Western印迹结果显示其能特异性地作用于肺炎链球菌SpxA.结论 成功构建了pET-28a(+)-spxA原核表达质粒,获得了高纯度的目的 蛋白和高滴度、高特异性的多克隆抗体.     

HPV16型E7重组蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

目的制备人乳头瘤病毒(HPV)16型E7原核表达蛋白及其多克隆抗体。方法用PCR方法从宫颈癌组织中扩增HPV16 E7基因,克隆至pET21a(+)载体并构建pET21a(+)/HPV16 E7重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导后表达重组蛋白,用Ni-NTA亲和层析法纯化并经SDS-PAGE及Western blot分析鉴定;纯化的HPV16 E7重组蛋白免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体,用ELISA检测多克隆抗体的效价,并用Western blot法及免疫荧光技术分析多克隆抗体的特异性。结果 HPV16 E7重组蛋白可通过原核表达系统进行表达和纯化;通过兔免疫后可制备特异性的多克隆IgG抗体,效价达1∶30 000;经Western blot法和免疫荧光染色结果证实兔多克隆抗体可特异性识别HPV16 E7蛋白。结论成功进行了HPV16 E7原核表达并制备了HPV16 E7兔多克隆抗体。     

小鼠精子Sp17与IL-5融合蛋白的构建、表达及其免疫原性鉴定

目的 构建和表达小鼠精子蛋白Sp17与白介素5(IL-5)融合蛋白,并对其进行纯化和免疫原性鉴定.方法 采用PCR技术从质粒pGEM-1-IL-5中扩增IL-5基因片段,将其克隆至pET/Sp17原核表达载体中与Sp17基因融合,构建重组质粒pET/Sp17-IL-5,经酶切鉴定后转化大肠杆菌B121(DE3),IPTG诱导表达,采用Ni2+-NTA Agarose 纯化,SDS-PAGE检测、N端测序及Western blot;重组蛋白Sp17.IL-5免疫小鼠后ELISA检测小鼠血清特异性抗体.结果 成功构建小鼠精子蛋白Sp17与IL-5融合蛋白的高效表达质粒pET/Sp17-IL-5,重组工程菌pET-28a(+)-sp17-IL-5/BL21经IPTG诱导目的蛋白表达率约28%,PAGE初步测定目的蛋白相对分子量(Mr)约39 000,纯化后蛋白纯度达91%,免疫后小鼠血清中检测到特异性抗体.结论 Sp17-IL-5蛋白经基因克隆获得了较高的表达量,并初步显示了较好的免疫活性,为新型Sp17避孕疫苗的研制奠定基础.     

肿瘤相关抗原胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白3多克隆抗体的制备和鉴定

目的构建胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白3(IGF2BP3)的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化IGF2BP3-His融合蛋白,制备和鉴定小鼠抗人IGF2BP3多克隆抗体。方法用PCR方法扩增IGF2BP3基因,构建到pET-28a原核表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导IGF2BP3蛋白的表达。所获得的蛋白经镍柱亲和层析纯化,并用透析方法脱去尿素使蛋白复性,获得IGF2BP3原核表达蛋白。将制备的原核表达蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,再用ELISA、Western blot法、免疫组织化学法对抗体的反应性及特异性进行鉴定。结果成功克隆出IGF2BP3基因,经测序与GenBank公布的序列一致;PCR酶切鉴定证实成功构建了pET-28a-IGF2BP3原核表达载体;质粒在BL21(DE3)中成功表达出相对分子质量(Mr)为70000左右的融合蛋白,纯化后经SDS-PAGE分析纯度在90%以上。ELISA确定抗体效价在1∶50000以上,且Western blot法和免疫组织化学技术均证实多克隆抗体能特异性识别目的蛋白。结论成功制备了特异性的小鼠抗人IGF2BP3的多克隆抗体。     

Autotaxin多克隆抗体的制备

目的:表达和纯化带多聚组氨酸(6×His)标签的Autotaxin(58-157位氨基酸)融合蛋白,制备抗Autotaxin的多克隆抗体。方法:构建pET-21 c-Autotaxin(58-157)重组表达质粒,转入BL21大肠杆菌,IPTG诱导蛋白表达,经镍离子金属螯合树脂纯化后,用纯化的蛋白免疫家兔,制备抗Autotax-in的多克隆抗体。ELISA检测抗体效价,Western blot检测抗体特异性,并用于免疫组化实验。结果:在大肠杆菌中高表达Autotaxin(58-157)-His6融合蛋白,经亲和纯化后免疫家兔,获得了特异性的抗Autotaxin抗血清。结论:成功构建pET-21 c-Autotaxin(58-157)表达质粒,原核表达获得高纯度的目的蛋白,制备出高效价的特异性抗Autotaxin多克隆抗体。     

鸡肺表面活性蛋白A的表达及其多克隆抗体的制备

目的表达鸡肺表面活性蛋白A(cSP-A)重组蛋白,并制备鼠抗cSP-A多克隆抗体。方法人工合成cSP-A的凝集素糖识别区(CRD)基因(cSP-A-CRD),亚克隆到pGEX-6P-1载体中进行原核表达,对表达产物进行鉴定。切胶纯化法纯化重组蛋白,并免疫小鼠制备抗cSP-A多克隆抗体,ELISA检测抗体效价,Western blot法、免疫荧光组织化学染色和ELISA鉴定该抗体的特异性和适用范围。结果获得鼠抗cSP-A血清,效价达到105;Western blot法结果表明多抗血清具有良好的特异性和反应性,并可用免疫荧光组织化学技术检测鸡肺上皮细胞表达的cSP-A和用间接ELISA检测鸡肺灌洗液中存在的水溶性cSP-A蛋白。结论成功表达了cSP-A重组蛋白并制备了小鼠抗cSP-A多克隆抗体。     

小鼠TIM-3原核表达载体的建立及多克隆抗体的制备与鉴定

目的:克隆小鼠TIM-3基因,构建原核表达载体,制备相应的多克隆抗体并初步鉴定。方法:以小鼠脾细胞总RNA为模板,用RT-PCR方法,扩增得到TIM-3基因编码区,构建pRSET-B-TIM-3原核表达载体;经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白;然后常规免疫家兔,制备多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体的效价,用Western blot、免疫组化、流式细胞术检测抗体的特异性。结果:成功构建的原核表达载体pRSET-B-TIM-3在大肠杆菌中诱导后可以高效表达TIM-3蛋白;免疫获得的多克隆抗体经过ELISA检测,抗体效价为1∶320 000,经Western blot、免疫组化和流式细胞术等鉴定,抗体的特异性较好。结论:成功克隆出小鼠的TIM-3基因,构建了原核表达载体,制备的兔抗小鼠TIM-3多克隆抗体具有较高的效价和良好的特异性。     

人核糖体蛋白S13的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的克隆人核糖体蛋白S13(ribosomal protein S13,RPS13)cDNA全长,构建原核表达质粒,诱导表达、纯化RPS13蛋白并制备其多克隆抗体。方法应用RT-PCR方法从胃癌多药耐药细胞SGC7901/VCR中扩增出RPS13的cDNA全长,利用DNA重组技术构建重组原核表达载体pET-28a( )-RPS13,双酶切及测序鉴定。将重组载体转化入大肠杆菌BL21中,筛选抗性克隆并经DNA测序证实。IPTG诱导融合蛋白的表达,利用镍离子亲和层析柱提纯融合蛋白,经SDS-PAGE和Western blot鉴定。用纯化的融合蛋白His-RPS13免疫BALB/c小鼠,ELISA法测定抗体效价,饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体,Western blot检测抗体活性。结果RT-PCR扩增片段与预计目的基因片段大小一致;双酶切鉴定表明,重组表达载体pET-28a( )-RPS13构建成功,DNA测序结果显示所获基因序列与GenBank中收录完全相同。IPTG诱导3h后,经SDS-PAGE检测显示在Mr19000处出现一新生条带,与预计的融合白大小一致;利用抗His标签的抗体进行Western blot,结果证实融合蛋白表达成功。其免疫血清经Western blot证实可特异性的识别蛋白RPS13。结论成功地获得了RPS13的编码基因序列,并获得了纯化的RPS13蛋白质,为制备RPS13的单克隆抗体、进一步研究RPS13在肿瘤中的作用奠定了基础。     

PBDC1蛋白的表达及其多克隆抗体的制备简

 目的 原核表达、纯化PBDC1蛋白,制备PBDC1多克隆抗体。方法 将PBDC1基因克隆到pET-28a(+)质粒中,构建成重组质粒pET-28a(+)-PBDC1。将此重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后,IPTG诱导其在宿主菌中大量表达,并进行SDS-PAGE检测。经镍离子亲和柱纯化得到PBDC1融合蛋白,并以此免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。结果 经质谱鉴定,获得了高纯度的PBDC1蛋白。经Western blot验证,获得了抗PBDC1蛋白的多克隆抗体。结论 成功获得抗PBDC1蛋白的多克隆抗体,为研究PBDC1在红系分化中的功能提供了有利工具。     

PBDC1蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

目的原核表达、纯化PBDC1蛋白,制备PBDC1多克隆抗体。方法将PBDC1基因克隆到pET-28a(+)质粒中,构建成重组质粒pET-28a(+)-PBDC1。将此重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)后,IPTG诱导其在宿主菌中大量表达,并进行SDS-PAGE检测。经镍离子亲和柱纯化得到PBDC1融合蛋白,并以此免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。结果经质谱鉴定,获得了高纯度的PBDC1蛋白。经Western blot验证,获得了抗PBDC1蛋白的多克隆抗体。结论成功获得抗PBDC1蛋白的多克隆抗体,为研究PBDC1在红系分化中的功能提供了有利工具。